何潔凝 田生禮

摘要：RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默現(xiàn)象，是近幾年發(fā)展起來的基因表達(dá)調(diào)節(jié)新機制。RNAi廣泛存在于真菌、植物和動物中，這種調(diào)控可以由siRNA、shRNA及miRNA等小分子RNA參與。在此主要對RNAi的研究進(jìn)展如背景、分子調(diào)控機制、存在的問題和應(yīng)用前景等進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：RNA干擾；小分子RNA；研究進(jìn)展

中圖分類號：Q819

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）03-0265-04

2006年，美國斯坦福大學(xué)的Andrew Z.Fire和美國馬薩諸塞大學(xué)的CraigC.Mello分別被授予了諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了RNA干擾（RNA interference，RNAi）現(xiàn)象，即用雙鏈RNA使基因沉默（RNA interference gene silencingby double-stranded RNA）。自發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象至2006年的8年間，在PubMed網(wǎng)站上能搜索到的有關(guān)RNAi的文章已經(jīng)達(dá)到8900多篇，可見，從RNA干擾理論提出到現(xiàn)在已經(jīng)歷十余年時間，人們對其機制和應(yīng)用的研究熱情始終沒有冷卻。為了加深對該技術(shù)的了解與追蹤，本文主要對RNAi的發(fā)現(xiàn)、作用機制、應(yīng)用的研究進(jìn)展予以綜述。

1RNAi的發(fā)現(xiàn)

RNA干擾是一種在進(jìn)化過程中存在的高度保守、由雙鏈RNA分子（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)同源mRNA高效特異性降解的基因轉(zhuǎn)錄后沉默現(xiàn)象（post-transcriptional gene silenc-ing，PTGS）。1990年初，科學(xué)家在向矮牽牛花導(dǎo)入能使花卉變得更鮮艷的查爾酮基因后，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)，一些花的顏色不但沒有變鮮艷反而被“漂白”了。這種過度表達(dá)內(nèi)源基因而引發(fā)的基因沉默的現(xiàn)象當(dāng)時被稱為共阻遏。1998年Fire等在向線蟲中分別導(dǎo)入正義、反義和雙鏈RNA同樣干擾par-l基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單鏈反義RNA和雙鏈RNA均能特異性沉默靶基因的表達(dá)，雙鏈RNA的效果明顯比單鏈RNA的沉默效果強，于是他們將這種雙鏈RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象稱為RNA干擾（RNA interference，RNAi），把引發(fā)RNA干擾現(xiàn)象的RNA分子稱為干擾RNA[1]。此后，RNA干擾這種現(xiàn)象被證明廣泛存在于多種真核生物中。

2RNAi的作用機制

眾所周知，RNAi的分子主要包括以下幾種：siRNA、shRNA、miRNA，雖然它們在結(jié)構(gòu)上各不相同，但是所有這些分子都具有誘導(dǎo)基因沉默的能力，它們在細(xì)胞中的作用機制主要有3個步驟[2]：

起始階段：外源性或內(nèi)源性雙鏈RNA分子被核酸酶Dicer加工剪切成21～25個核苷酸長度的小分子雙鏈。

RISC （RNA-induced silencing complex）的組裝：產(chǎn)生的小分子雙鏈RNA中其中一條鏈與相關(guān)的蛋白（主要是Argonaute蛋白）組裝形成具有活性的沉默復(fù)合體RISC。

效應(yīng)階段：組裝形成的具有活性的RISC作用于與其上的單鏈小分子RNA序列互補的mR-NA，并將該mRNA降解，使其翻譯受到抑制，最終導(dǎo)致基因的沉默。siRNA、shRNA與miRNA對靶基因mRNA沉默時作用的位點有所不同，siRNA沉默目的基因主要作用于mRNA的編碼序列，而miRNA主要作用于mRNA的3的非翻譯區(qū)。

在RNAi過程中，研究得較清楚的蛋白主要是Argonaute蛋白家族：Argonaute（Ago）蛋白屬于一個高度保守的蛋白家族，包括Agol、Ago2、A-go3、Ago4。它的大小約100kD，這4種蛋白都包含兩個重要的結(jié)構(gòu)域：PAZ、MID結(jié)構(gòu)域，分別與miRNA3'與5'端相互作用。在所有的Ago蛋白中只有Ago2所包含的PIWI結(jié)構(gòu)域具有切割活性，Agol、Ago3、Ago4沒有此活性[3，4]。Argonaute能跟不同的小分子RNA（miRNA、siRNA）結(jié)合，根據(jù)小分子RNA結(jié)構(gòu)的不同，它們所結(jié)合的Argonaute蛋白也有所區(qū)別，其中miRNA與Agol結(jié)合，而siRNA則與Ago2結(jié)合[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，Ago2能提高細(xì)胞中miRNA的穩(wěn)定性及提高成熟miRNA在細(xì)胞中的水平[6]；Ago3蛋白的PIWI與Piwi-in-teracting RNAs （piRNAs）相互作用產(chǎn)生沉默轉(zhuǎn)座子的作用；Ago4在調(diào)控哺乳動物精細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂和減數(shù)分裂性染色體失活（MSCI）中起作用[7]。

3RNAi的應(yīng)用

3.1基因功能研究

在后基因組時代，基因功能的研究顯得尤其迫切，可是，由于我們在進(jìn)行研究基因功能實驗時難以直接在人活體內(nèi)進(jìn)行，建立有效的轉(zhuǎn)基因或基因敲除的動物模型顯得格外重要，RNAi技術(shù)在此方面做出重大貢獻(xiàn)。Kim等利用針對影響胚胎發(fā)育的兩種內(nèi)源性的Oct3/4和c-mos基因的siRNA，將其植入鼠卵母細(xì)胞前胚胎中，成功地清除了內(nèi)源性的Oct3/4和c-mos產(chǎn)物，建立了敲除Oct3/4和c-mos基因的動物模型[8]；其次利用RNAi文庫也是基因功能研究的重要手段，RNAi文庫是人工構(gòu)建的一種混合文庫，研究者能通過它誘導(dǎo)RNAi抑制眾多種不同基因表達(dá)。目前，研究者利用RNAi文庫已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多與生物功能相關(guān)的新基因和治療疾病的新靶點。Buss等在秀麗隱桿線蟲中通過全基因組RNAi篩選的方式，發(fā)現(xiàn)煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine re-ceptor subunit ACR-7）是抗精神病藥物的靶點[9]。

3.2臨床基礎(chǔ)研究

RNAi技術(shù)具有簡單、快速、特異性沉默任意基因的特點，使其被廣泛用來研究腫瘤、肺動脈高壓、先天性遺傳病等疾病的治療靶點，并取得了一定成果。最近Ku等證實通過脂質(zhì)體的方式向T24膀胱癌細(xì)胞中導(dǎo)入針對生存素（survivin）的siRNA，該siRNA能特異性地干擾膀胱癌細(xì)胞中生存素的表達(dá)，同時加速了膀胱癌細(xì)胞的凋亡[10]。Wedg-wood等運用RNAi技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶在新生兒肺動脈高壓中血管的重塑中起著重要作用，有望成為該疾病治療的靶點[11]。Leachman等對先天性厚甲遺傳病患者通過皮下注射siRNA的方式針對突變的K6a角質(zhì)蛋白進(jìn)行沉默，3個月后成功對該蛋白進(jìn)行沉默的同時發(fā)現(xiàn)患者皮膚起繭情況明顯得到好轉(zhuǎn)。此外，RNAi治療并沒有給患者帶來其他負(fù)面影響[12]，這是RNAi在藥物治療方法上的重要進(jìn)展。RNAi技術(shù)還被應(yīng)用于整形外科方面，整形外科的開展主要以手術(shù)為主，RNAi技術(shù)的應(yīng)用為整形外科的開展注入了新的力量。眾所周知，當(dāng)人體皮膚深層受到創(chuàng)傷后，機體產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)及應(yīng)激反應(yīng)會導(dǎo)致基質(zhì)層許多生長因子異常增多，從而誘使皮膚深層基質(zhì)細(xì)胞變性轉(zhuǎn)化疤痕組織，產(chǎn)生疤痕，這是目前整形外科研究的熱點和難點。Liu等將RNAi技術(shù)與膠原殼聚糖硅橡膠皮膚再生材料（collagen-chitosan/sili-cone membrane bilayer dermai equivalent）結(jié)合起來應(yīng)用于背部皮膚嚴(yán)重缺損的豬的皮膚修復(fù)上，研究發(fā)現(xiàn)siRNA能明顯抑制TGF-βi生長因子的表達(dá)并同時抑制皮膚修復(fù)過程中疤痕的產(chǎn)生[13]。在整形外科軟骨移植中，經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)軟骨外質(zhì)細(xì)胞被大量降解，出現(xiàn)使細(xì)胞質(zhì)中蛋白多糖與膠原水平失衡的現(xiàn)象，Wang等采用RNAi的手段通過抑制軟骨細(xì)胞多聚蛋白聚糖酶1，2（aggrecanase）的表達(dá)，減少其對蛋白多糖的分解，維持軟骨移植后軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的平衡[14]。

3.3藥物開發(fā)研究

RNAi技術(shù)還被應(yīng)用于鑒定藥物靶點和篩選藥物方面。RNAi技術(shù)的應(yīng)用明顯地縮短了從篩選到鑒定藥物靶基因功能的時間，有助于藥物開發(fā)過程中對已知靶基因功能的高通量分析。在鑒定RNAi藥物靶點上，Watanabe等研究發(fā)現(xiàn)通過siRNA干擾的方式在小鼠中沉默蛋白轉(zhuǎn)移酶9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PC-SK9）能有效地減少血清中膽固醇水平，首次證明通過沉默PCSK9有望成為降低膽固醇的治療靶點[15]。在篩選藥物上，Liu-Sullivan[16]等通過pooledshRNA的方法發(fā)現(xiàn)維甲酸類藥物能增強pkll激酶抑制劑藥物GSK461364的抑制作用，進(jìn)而阻止細(xì)胞有絲分裂，加速了癌細(xì)胞凋亡的速度。

4影響RNAi效率的因素及RNAi應(yīng)用中存在的問題

4.1影響RNAi效率的因素

4.1.1RNAi序列的設(shè)計

RNAi技術(shù)的關(guān)鍵是如何有效發(fā)揮siRNA的干擾作用。在RNAi的實際應(yīng)用中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)合理設(shè)計的siRNA不能發(fā)揮有效的干擾作用，分析影響siRNA干擾效果的因素包括dsRNA雙鏈末端的穩(wěn)定性、siRNA與RISC的結(jié)合情況及干擾載體的轉(zhuǎn)染效率。在對siRNA特異性研究中，發(fā)現(xiàn)siRNA最好設(shè)計在19～25個堿基之間，且siRNA的GC含量應(yīng)在30%～52%之間。此外，在siRNA特定的位置應(yīng)設(shè)計特定的核苷酸，例如：siRNA的sense序列的5'端的第一個堿基最好是U，第3、10位堿基最好是A[17]，因為A在熱力學(xué)上結(jié)合力更低，因此會降低siRNA雙鏈的穩(wěn)定性使RISC更好解開雙鏈siRNA，同時增加siRNA的基因沉默效率。相反，若siRNA序列中存在反向重復(fù)序列會降低siRNA的沉默效果。

4.1.2RNAi序列的穩(wěn)定性

一般siRNA在血清的環(huán)境下，很容易被降解以致其難以在細(xì)胞中發(fā)揮其RNAi作用。因此對siRNA進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾是必要的。

目前已經(jīng)存在很多siRNA優(yōu)化方法，研究發(fā)現(xiàn)siRNA經(jīng)過tricyclo-DNA修飾后能明顯提高siRNA在血清中的穩(wěn)定性[18]。除了上述修飾外，還有一種化學(xué)修飾稱LNAs修飾（locked nucleic acids），它是一種核酸類似物，其能使RNA/DNA增加耐受核酸酶的能力，此外，這種修飾能降低siRNA對細(xì)胞的毒性。Petri等[19]研究發(fā)現(xiàn)利用LNAs修飾后的siRNA更利于Ago2聚集和剪切，從而能明顯提高siRNA的穩(wěn)定性及減少siRNA的脫靶效應(yīng)。

4.1.3RNAi序列的導(dǎo)入方式

RNAi技術(shù)被廣泛的應(yīng)用，成功將RNAi分子導(dǎo)入目的細(xì)胞，是實現(xiàn)RNAi的先決條件。RNAi分子存在易降解和不穩(wěn)定的特點，為了保證RNAi分子能有效地被運送到目的組織細(xì)胞，需要特定的導(dǎo)入方式。文獻(xiàn)報道的導(dǎo)入方式有多種，比如浸泡、注射、脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染、納米材料導(dǎo)入、噬菌體包裝轉(zhuǎn)染或通過物理的方式直接導(dǎo)入等，其中，很多研究者會選擇采用病毒載體，利用病毒高感染率、高表達(dá)的特性開展RNAi實驗研究。但是它同時也存在著一些風(fēng)險，比如病毒會誘發(fā)細(xì)胞中基因產(chǎn)生突變或會引起細(xì)胞中各種炎癥反應(yīng)等。

針對于病毒載體給細(xì)胞帶來的各種影響，非病毒性的導(dǎo)入方式越來越受到研究者的青睞。目前，有一種著名的tkRNAi運輸shRNA小分子的技術(shù)，這種技術(shù)主要是用非治病性的大腸桿菌內(nèi)含產(chǎn)生特定shRNA的質(zhì)粒DNA，并將其運送到細(xì)胞中以產(chǎn)生RNAi的效果。Kruhn等運用該技術(shù)將針對ABCB1的shRNA導(dǎo)入到人胃癌細(xì)胞中，shRNA能有效干擾ABCB1蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)了癌細(xì)胞中由ABCB1蛋白介導(dǎo)的多藥抗性的表型[20]。

4.2RNAi技術(shù)應(yīng)用中存在的問題

4.2.1免疫反應(yīng)

細(xì)胞中免疫系統(tǒng)對自身的核酸和外源核酸總是有區(qū)別對待的，這種反應(yīng)主要體現(xiàn)在細(xì)胞水平上和分子水平上，其主要的機理是：外源的RNA或DNA會刺激細(xì)胞中IFN（type I interferon）因子和細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生。在RNAi過程中，依賴dsRNA的激酶（dsRNA dependent protein kinase，PKR）能激活2'-5'寡腺苷酸合成酶（ 2'-5'oligoadenylate synthetase，OAS），OAS會刺激ATP形成2'-5'寡腺苷核苷酸，進(jìn)一步激活細(xì)胞中核糖核酸酶（RNaseL）形成，進(jìn)而降解細(xì)胞中的RNA，包括RNAi小分子，降低RNAi的沉默效率[21]。適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾能改善siRNA引起的細(xì)胞免疫反應(yīng)，如將siRNA用2'-O-Me，2'-O-F加以修飾足以改善siRNA的免疫刺激活性并能更好地優(yōu)化siR-NA的沉默效果[22]。

4.2.2脫靶效應(yīng)

眾所周知，Ago-RISC對靶mRNA的剪切是具有高度特異性的，可是在siRNA的應(yīng)用過程中也會出現(xiàn)許多脫靶效應(yīng)從而誘發(fā)細(xì)胞毒性。siR-NA的脫靶效應(yīng)主要與其序列中靠近5'端的2～8個堿基密切相關(guān)，因為它們與mRNA的3'UTR互補并與RISC結(jié)合緊密。為了減少siRNA的脫靶效應(yīng)，提高siRNA的特異性主要通過以下方式：1）降低siRNA中5'端的熱力學(xué)穩(wěn)定性；2）在選擇靶mRNA位置時要避免靠近mRNA的起始編碼區(qū)；3）通過使用siRNA pools的方法，在既能保持siRNA的沉默效率下，又能減低siRNA的脫靶效應(yīng)[23]；4）文獻(xiàn)報道，在siRNA的第7位加入一個不穩(wěn)定的unlocked nucleic acid （UNA）修飾能減少siRNA的脫靶效應(yīng)[24]。

4.2.3飽和現(xiàn)象

在正常細(xì)胞中，小RNAi分子與其靶基因之間始終保持著一種平衡的狀態(tài)，這使細(xì)胞一直保持著正常的生理功能。大量外源的siRNA/shRNA被導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞中正常RNAi水平達(dá)到一種不平衡的狀態(tài)。大量外源的siRNA/shRNA進(jìn)入細(xì)胞會與內(nèi)源的miRNA競爭某些蛋白因子，如Dicer、Ago蛋白等，以致細(xì)胞內(nèi)的miRNA不能行使正常的功能。在細(xì)胞中，即使使用弱啟動子表達(dá)了大量shRNA也會誘發(fā)生物體內(nèi)細(xì)胞毒性。為了避免上述問題的產(chǎn)生，Grimm等將Ago2、Exp5、L6-shRNA共同導(dǎo)入到小鼠內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)shRNA的干擾效果明顯增強，同時檢測小鼠肝臟毒性明顯降低[25]。為了避免內(nèi)源miRNA與外源的shRNA競爭Dicer因子，Liu等最近研究出一種Ago2shRNA，該shRNA可以不通過Dicer而直接利用Ago2行使剪切功能，這種設(shè)計有望能在進(jìn)一步提高RNAi的同時避免引起RNA干擾效果的脫靶效應(yīng)[26]。

5展望

RNA干擾技術(shù)是一個生物學(xué)研究的亮點，它給許多疾病的治療與藥物的開發(fā)提供了新的思路，其中RNAi藥物具有藥效測試周期短，在理論上適合于任何基因治療的特點，其中比如anti-sense RNAi藥物，它的特異性非常強，有可能在RNAi藥物開發(fā)中引來新的一場革命。目前，許多RNAi藥物迅速地進(jìn)入了臨床研究階段。雖然還存在一些問題，如出現(xiàn)脫靶效應(yīng)、免疫反應(yīng)等問題，但我們始終相信這些問題最終會被解決，使RNAi技術(shù)能更好地被廣泛地應(yīng)用在基礎(chǔ)研究、臨床研究及RNAi藥物研發(fā)之中。

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