董婷 李正發(fā) 歐陽紅梅 張芹 朱紅艷 蔣雅先 辜學(xué)忠 沈曉梅 楊同華 賴洵 史克倩 楊艷梅 聞艷 陸智祥

摘要：免疫相關(guān)性全血細(xì)胞減少（immune-related pancytopenia，IRP）是臨床多個(gè)學(xué)科易見的疾病，也是困擾臨床醫(yī)師的一大難題。近年來關(guān)于輔助性T細(xì)胞17 （T helper 17，Th17）對(duì)IRP發(fā)病作用的研究更是熱點(diǎn)。通過檢測(cè)免疫相關(guān)性全血細(xì)胞減少癥患者骨髓中Th17細(xì)胞數(shù)量及功能變化，探討Th17細(xì)胞在IRP中的免疫調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，IRP患者（IL-23R）+CD4+/CD4+細(xì)胞比率及其骨髓上清液IL-6、IL-17、IL-23水平增高，提示IL-23介導(dǎo)的Th17細(xì)胞分化亢進(jìn)可能是IRP發(fā)病原因之一。免疫干預(yù)治療可以顯著降低Th17細(xì)胞比率及IL-23R，抑制Th17細(xì)胞分化亢進(jìn)可能是治療IRP的一個(gè)靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：全血細(xì)胞減少；免疫相關(guān)；流式細(xì)胞術(shù)；（IL-23R）+CD4+/CD4+細(xì)胞；Th17細(xì)胞；IL-6；IL-17；IL-23

中圖分類號(hào)：R446.11

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2014）03-0232-04

免疫相關(guān)性全血細(xì)胞減少癥（immunorelatedpancytopenia，IRP）是由于B淋巴細(xì)胞功能亢進(jìn)、產(chǎn)生抗骨髓造血細(xì)胞自身抗體引起骨髓造血衰竭的自身免疫性血細(xì)胞減少性疾病。其與再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征、陣發(fā)性血紅蛋白尿、慢性病性貧血等骨髓衰竭性疾病不易區(qū)分，容易混淆，危害性大，治療難以著手，是困擾臨床醫(yī)師的一大難題。輔助性T細(xì)胞17（T helper 17，Th17）是近年來研究發(fā)現(xiàn)的一種不同于T輔助細(xì)胞l和T輔助細(xì)胞2型的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞，具有獨(dú)立分化和發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制，在自身免疫性疾病中具有重要意義[1]。有學(xué)者提出IRP患者中B淋巴細(xì)胞功能亢進(jìn)、產(chǎn)生自身抗體可能與Th17細(xì)胞數(shù)量增多和功能亢進(jìn)有關(guān)[2]。隨著研究的深入，已獲知IL-23R只表達(dá)在成熟的Th17細(xì)胞表面，是TH17細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志性分子。因此，本文通過檢測(cè)IRP患者骨髓（IL-23R）+CD4+/CD4+細(xì)胞比率及上清液中IL-6、IL-17和IL-23水平，觀測(cè)其免疫干預(yù)治療前后的變化。力圖探明IRP區(qū)別于其他骨髓衰竭性疾病的本質(zhì)以及Th17細(xì)胞在IRP中免疫調(diào)節(jié)作用，尋求可能成為IRP治療的新靶點(diǎn)。

1材料和方法

1.1病例

27例患者均取自于云南省第一人民醫(yī)院血液科初治住院病人，其中男14例，女13例，年齡13～60歲。其中16例明確診斷組經(jīng)常規(guī)檢查已排除已知的各種血液系統(tǒng)疾病，且按文獻(xiàn)[2]標(biāo)準(zhǔn)擬診斷為IRP。另11例為造血衰竭疾病組，分別診斷為骨髓增生異常綜合征4例、再生障礙性貧血3例、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿4例，均符合國內(nèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。復(fù)診組12例為IRP經(jīng)免疫干預(yù)治療后血常規(guī)恢復(fù)正?；颊?，達(dá)到完全緩解組（CR組）。正常對(duì)照組22例，其中男11例，女11例，年齡6～18歲。

1.2實(shí)驗(yàn)分組

27例患者分別為A組（確診IRP組）、B組（造血衰竭疾病組）及C組（免疫干預(yù)治療后達(dá)完傘緩解組（CR組））另設(shè)正常對(duì)照組（22名正常人）。A組16例按文獻(xiàn)[2]確診為IRP患者。B組11例（其中骨髓增生異常綜合征4例、再生障礙性貧血3例、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿4例）。C組12例。采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)A、B、C組及正常對(duì)照組骨髓白細(xì)胞介素（IL）-23受體（JL-23R）+CD4+/CD4+細(xì)胞比率。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)A、B及正常對(duì)照組骨髓卜清液IL-6、IL-17、IL-23水平。

1.3試劑與儀器

異硫氰酸熒光素（FlrC）標(biāo)記的鼠抗人CD3單克隆抗體，藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的鼠抗人CD4單克隆抗體以及它們各自的同型對(duì)照均購自于美國Beckman Coulter公司，純化的人類IgG、PerCP標(biāo)記的IL-23R以及其同型對(duì)照均購自R&D公司。流式細(xì)胞儀型號(hào)FC500 MPL為美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品。IL-6、IL-17、IL-23 ELISA檢測(cè)試劑盒均為Bio-Swamp品牌試劑盒。

1.4 FCM檢測(cè)骨髓11-23R+CD4+細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比率

取兩支檢測(cè)管，分別加入新鮮肝素抗凝骨髓液100μL，加入適量PBS液于離心機(jī)內(nèi)洗滌2次，棄上清液后加入封閉劑人類IgG 20μL，常溫孵育15min，一管中加入CD4-PE、CD3-FITC、IL-23R-PerCP各20μL，另一管加入CD4-PE、CD3-FITC、IgG2b-PerCP各20μL，4℃避光孵育40min，取出均加入紅細(xì)胞裂解液，混勻后孵育10min，加入適量PBS液混勻。同型對(duì)照加入IgG1-PE、IgG2-FITC、IgG2b-PerCP各20μL，其他均按同樣方法操作。處理好的樣品用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定IL-23R+CD4+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞比率。每個(gè)樣本收集15000個(gè)細(xì)胞。

1.5ELISA法檢測(cè)骨髓上清IL-6、IL-17和IL-23水平

取骨髓于離心機(jī)內(nèi)離心，分別收集上清液。細(xì)胞因子水平上清液按ELISA試劑盒說明書操作。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)正態(tài)分布的數(shù)據(jù)變量以χ±s表示，應(yīng)用SPSS19.0數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和相關(guān)性回歸分析。

2結(jié)果

2.1骨髓IL-23R+CD4+/CD4+細(xì)胞比率

確診IRP組患者IL-23R+CD4+/CD4+細(xì)胞比率[3.22±1.67]明顯高于B組[1.51±1.06]和正常對(duì)照組[1.59±1.06]（P<0.05），同時(shí)IRP確診組患者IL-23R+CD4+/CD4+細(xì)胞比率[3.22±1.67]也明顯高于C組[1.72±0.83]。B組、C組及正常對(duì)照組相互間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。骨髓IL-23R+CD4+/CD4+細(xì)胞檢測(cè)典型圖例見圖1。

2.2骨髓上清IL-6、IL-17、IL-23水平

IRP組骨髓上清液IL-6、IL-17和IL-23水平明顯高于造血衰竭疾病組和正常對(duì)照組（P<0.05），而造血衰竭疾病組和正常對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

3討論

免疫相關(guān)性全血細(xì)胞減少癥是當(dāng)前醫(yī)學(xué)界熱門課題之一，它是在鑒別骨髓造血功能衰竭綜合征時(shí)發(fā)現(xiàn)的一類新型血細(xì)胞減少疾病。目前認(rèn)為該類疾病是因?yàn)闄C(jī)體產(chǎn)生了抗骨髓未成熟造血細(xì)胞自身抗體，進(jìn)而導(dǎo)致一系、兩系或全血細(xì)胞減少。近年來，臨床采用腎上腺皮質(zhì)激素、靜脈病種球蛋白、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素等免疫抑制劑取得了客觀的療效，有學(xué)者采用造血干細(xì)胞移植技術(shù)的探索也有進(jìn)步，前景喜人。因而，探索IRP治療的新途徑、新靶點(diǎn)是有意義的工作[2，6]。

目前認(rèn)為骨髓造血細(xì)胞自身抗體的產(chǎn)生是由于T淋巴細(xì)胞調(diào)控失衡所致。既往有學(xué)者發(fā)現(xiàn)此類患者Thl細(xì)胞與Th2細(xì)胞平衡明顯向Thl細(xì)胞降低傾斜，即Thl細(xì)胞途徑的抑制性負(fù)調(diào)控減低，Th2細(xì)胞途徑的刺激性正調(diào)控增強(qiáng)，細(xì)胞功能亢進(jìn)，更有研究顯示免疫相關(guān)性全血細(xì)胞減少癥骨髓中Th2細(xì)胞高于Thl細(xì)胞3倍[4]，故體液免疫功能亢進(jìn)。Th17細(xì)胞是一種不同于Thl和Th2型的第3類效應(yīng)性T細(xì)胞，主要分泌IL-17、IL-17F及少量IL-6和TNF-a等細(xì)胞因子，其中IL-17是家族中最先發(fā)現(xiàn)的分子，也是Th17細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)及介導(dǎo)疾病的核心因子。該細(xì)胞具有獨(dú)立分化和發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制，在自身免疫性疾病中扮演著重要角色，研究顯示Th17細(xì)胞在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等患者中均發(fā)現(xiàn)其數(shù)量增多、功能亢進(jìn)[5]?？梢?，Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展。來自初始免疫細(xì)胞和調(diào)節(jié)細(xì)胞的TGF-β是促進(jìn)初始CD4+細(xì)胞分化Th17細(xì)胞的始動(dòng)因素，除TGF-β外，IL-6在協(xié)同TGF-β共同誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化方面也發(fā)揮關(guān)鍵作用，TGF-p只有在IL-6協(xié)同下才能誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化[6，7]。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β和IL-6可驅(qū)使原始T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，但與之伴隨產(chǎn)生的IL-10的炎癥抑制效應(yīng)在一定程度上降低了Th17細(xì)胞的致病潛力。IL-23作用于成熟Th17細(xì)胞表面的IL-23R，能夠維持和擴(kuò)大Th17細(xì)胞的分化和功能，而IL-23介導(dǎo)的Th17細(xì)胞分化過程中不生成IL-10但增加IL-17的致病效應(yīng)[8]。

本文采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)確診IRP患者組（A組）、造血衰竭疾病組（B組）、完全緩解組（C組）和正常對(duì)照組的骨髓IL-23R+CD4+/CD4+細(xì)胞比率。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，A組患者IL-23R+CD4+/CD4+比率明顯高于B組患者及正常對(duì)照組，后兩組無顯著性差異。A組陽性患者IL-23R+CD4+/CD4+比率也明顯高于C組。說明IRP患者中Th17細(xì)胞數(shù)量增多、功能活躍，可能與IRP患者的免疫功能相關(guān)，此結(jié)果與既往研究相符[1]。其造血衰竭疾病患者（PNH、AA、MDS）Th17細(xì)胞比率趨于正常，據(jù)此我們可以將免疫相關(guān)性全血細(xì)胞減少癥與其他全血細(xì)胞減少加以區(qū)分。Th17細(xì)胞作為促炎細(xì)胞，能誘導(dǎo)免疫性疾病的發(fā)生，而Treg的功能卻和它截然相反。研究證實(shí)：Th17細(xì)胞和Treg在各自的分化生成、轉(zhuǎn)錄水平上均存在著相互制約關(guān)系，然而在特定的細(xì)胞因子環(huán)境中，Treg可以轉(zhuǎn)化成Th17細(xì)胞[9，10]。

酶聯(lián)免疫法實(shí)驗(yàn)顯示：A組患者骨髓上清液IL-6、IL-17和IL-23水平明顯高于B組和正常對(duì)照組。說明IRP患者骨髓上清液IL-6、IL-17、1L-23水平增高，提示IL-23介導(dǎo)的Th17細(xì)胞分化亢進(jìn)可能是IRP發(fā)病原因之一。免疫干預(yù)治療可以顯著降低Th17細(xì)胞比率及IL-23R，抑制Th17細(xì)胞分化亢進(jìn)可能是治療IRP的一個(gè)靶點(diǎn)。

綜上所述，本文推測(cè)Th17細(xì)胞在IRP患者中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理可能是：IRP患者體內(nèi)IL-6水平增加，其協(xié)同TGF-β誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化，同時(shí)IL-23作用于成熟的Th17細(xì)胞，進(jìn)一步維持和擴(kuò)大Th17細(xì)胞的分化和功能，引起Th17細(xì)胞數(shù)量增多、功能亢進(jìn)，進(jìn)而其分泌的細(xì)胞因子IL-17增多，1L-17激活細(xì)胞表面對(duì)應(yīng)受體（IL-17R），導(dǎo)致趨化因子、集落刺激因子和粘附分子的表達(dá)或釋放，招募炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞，進(jìn)而引起細(xì)胞侵潤和組織破壞，影響感染、腫瘤和自身免疫的病理過程。結(jié)合Th17細(xì)胞的生物學(xué)作用分析，IRP患者骨髓造血細(xì)胞自身抗體的產(chǎn)生可能與Th17細(xì)胞數(shù)量增多和功能亢進(jìn)存在一定相關(guān)性，但深入的相關(guān)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)（ References）：

[1]VELDHOEN M， HOCKING R J，ATKINS C J，el al.TGFbetain the conlext of an inflammatory cytokine milieu supports denovo differentiation of IL-17-producing T cell[J]. Immunity，2006， 24（2）：79-189.

[2]付蓉，王紅蕾，陳瑾，等.骨髓單個(gè)核細(xì)胞Coormbs試驗(yàn)（+）血細(xì)胞減少癥患者Th17細(xì)胞數(shù)量及功能研究[J].中華血液學(xué)雜志（FU Rong， WANC Hong-Lei， CHEN Jin，et al.Bonemarrow mononuclear cells Coombs test（+） patienls with cytopeniacell number and function of Th17[J]. Chinese Journal of Hematol-ogy）， 2010， 31（10）：684-687.

[3]邵宗鴻，付蓉免疫相關(guān)性血細(xì)胞減少癥一一種新認(rèn)知的疾病（下）[J]中國醫(yī)刊（SHAO Zong-hong， FU Rong. Immune-related pancytopenia -A new cognitive disorders （PartⅡ）[J].Chinese Joumal of Medicine）， 2005， 40（2）：70-73.

[4]張之南，沈悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M]北京：科學(xué)出版社（ZHANG Zhi-nan， SHEN Ti. Blood disease diagnosis andtreatment standards[M]. Beijing： Science Press）， 1998.74-78.

[5]曾慧，何廣勝，付蓉，等.免疫相關(guān)性傘血細(xì)胞減少癥患者骨髓Th細(xì)胞比率及功能變化[J]江蘇醫(yī)藥（ZHENG Hui， HEGuang-sheng， FU Rong， et al.Pancytopenia in patients withimmune-related cells in the bone marrow Th ratios and func-tional changes[J]. Jiangsu Pharmaceutical）， 2006， 32（5）：401-403.

[6]ZHU J，PAUL WE. CD+Tcells：fates， functions， and faults[J].Blood， 2008， 112：1557-1569.

[7]BETTELLI E，CARRIER Y，GAO W，et al. Reciprocal devel-opmental pathways for the generation of pathogenic effectorTh17 and regulatory cells[J]. Nature， 2006， 441（7090）：235-238.

[8]KIMURA A，NAKA T，KISHIMOTO T.IL-6一dependent and-independent pathways in the development of interleukinl7-producing T helper cells[J]. Proceedings of the National Academyof Sciences， 2007， 104（29）：12099-12104.

[9]MCGEACHJ M J，BAK-JENSEN K S，CHEN Y，et al.TGF-beta and IL-6 drive the production of IL-17 and IL-1O by Tcells and restrain T（H）-17 cell-mediated pathology[J].NatureReviews Immunology， 2007， 8（12）：1390-1397.

[10]ZHOU L，LOPES J E，CHONC M M，et al.TGF-beta-in-duced Foxp3 inhibits T（H）17 cell differentiation by antagoniz-ing RORgammat function[J]. Nature， 2008， 453（7192）：236-240.

[11]XU L，KITANI A，F(xiàn)USS I，et al.Cutting edge：regulatory Tcells induce CD4+CD25-Foxp3-T cells or are self-induced tobecome Th17 cells in the absence of exogenous TGF-beta[J].Journal of Immunology， 2007， 178（11）：6725-6729.