堯俊英 馮昕 李景原

摘要：利用掃描電鏡、透射電鏡方法，觀察氮離子束注入對蘆薈細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的影響。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，在離子注入劑量達(dá)1×lOl6N+/cm2時，葉片表面發(fā)現(xiàn)了離子束刻蝕的小洞。透射電鏡半薄切片觀察也發(fā)現(xiàn)離子束轟擊后，蘆薈葉片表皮的橫切面都有不同程度被打爛的情況，初步認(rèn)為是離子束轟擊引起的刻蝕效應(yīng).這與掃描電鏡的觀察結(jié)果相一致。研究結(jié)果可為離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：離子束；蘆薈；掃描電鏡：透射電鏡

中圖分類號：Q336

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）03-0195-04

1986年我國科學(xué)家首先將離子注入技術(shù)作為一種新的輻射誘變手段引入水稻的誘變育種研究領(lǐng)域，表現(xiàn)出許多不同于其他電離輻射的特征[1]。在此基礎(chǔ)上又開展了離子束介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)工作，經(jīng)過20多年的實踐，離子束介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化技術(shù)在水稻、小麥、棉花、煙草、西瓜等多種作物上取得成功[2]。但是目前，離子束與生物體相互作用機理仍存在較大的爭議。在物理機制上，低能離子束在生物組織中的射程和相互作用過程中的動力學(xué)和運動學(xué)行為存在爭議；在生命科學(xué)方面，如何在分子、細(xì)胞等層次說明注入離子對生物組織和生命過程的作用，離子注入誘變育種和介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的理論等還不完善。無論是離子注入誘變，還是離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)外源基因，離子束都必須穿透細(xì)胞壁后才能發(fā)揮作用。因此，如何闡明離子束誘變和轉(zhuǎn)基因的機理對于離子束生物技術(shù)的發(fā)展具有重要意義[3-6]。

蘆薈（Aloe）屬百合科蘆薈屬多年生肉質(zhì)常綠草本植物，含有多種藥用成分。藥理研究和臨床試驗表明，蘆薈具有抗菌、抗病毒、抗輻射、提高人免疫機能等功能[7，8]，因而廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和化妝品工業(yè)。目前，離子束誘變技術(shù)研究集中在農(nóng)作物育種方面，而在藥用植物的研究方面還比較少見。筆者將離子束誘變技術(shù)應(yīng)用于蘆薈的誘變育種，取得了一定的效果。本實驗以藥用植物蘆薈為研究材料，以lxl014、1 xl015、1×l016N+/cm2氮離子束轟擊蘆薈葉片，利用掃描電鏡和透射電鏡觀察離子束轟擊對蘆薈細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的影響，以期從生命科學(xué)的角度為離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)理論的發(fā)展提供參考，同時拓寬了離子束育種的應(yīng)用范圍[9，10]。

1材料與方法

1.1材料

實驗材料選用庫拉索蘆薈（Aloe vera L.），購于鄭州市植物園。選擇長勢良好，比較幼嫩的蘆薈葉片作為氮離子束注入的材料。

1.2方法

1.2.1氮離子束注入蘆薈葉片

取相同葉齡的蘆薈葉片，進(jìn)行氮離子注入處理，注入劑量分別為lxl014、lxl015N+/cm2和1×1016N+/Cm2，同時設(shè)真空對照品，無離子注入。

1.2.2蘆薈葉片表面掃描電鏡觀察

將離子注入后的葉片切成5mm左右的小塊，立即用3%的戊二醛固定2h以上。固定之后，用乙醇梯度脫水：300/0乙醇→500/0乙醇→700/0乙醇→85%乙醇→95%乙醇→100010乙醇（2次）→1/2乙醇+1/2二甲苯→二甲苯→1/2乙醇+1/2二甲苯→100%乙醇（洗凈二甲苯）（每級脫水時間為2h，700/0時可停留過夜）[11]。脫水干燥之后，用JEOL、JEC-560型離子濺射儀濺射碳膜，用JEOL、JEC-1600型離子濺射儀濺射金膜，用JEOL、JSM-6700F型掃描電子顯微鏡觀察、拍照[11-15]。

1.2.3蘆薈葉片表皮橫切面半薄切片觀察

將離子注入后的葉片切成1mm左右的小塊，用戊二醛前固定2h以上。戊二醛固定好以后，將材料取出放入盛有磷酸緩沖液的小瓶中，清洗3～4次，以徹底洗凈戊二醛固定液。洗凈后加入鋨酸后固定，固定時間4～6h。材料固定好之后，用蒸餾水清洗3次以上，用1%的醋酸雙氧鈾染色1h，再用蒸餾水清洗兩次。固定、染色之后的材料用500%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脫水，每級30min。脫水干燥后，將材料用Epon812樹脂包埋，包埋塊于36、45、60℃分別聚合12h。將所得的包埋塊從模板中取出，放入盛有干燥劑的棕色瓶中保存[11]。

包埋塊經(jīng)修塊之后，用Reichert-Jung超薄切片機切半簿切片，切片厚度為1～2μm，切片挑出放在潔凈的載玻片上，于科迪KD-H烘片機上烘干，再用1%的亞甲基蘭染色10min，染色結(jié)束后用蒸餾水沖洗干凈，烘干，用Olympus BX -51顯微鏡觀察并拍照[11，15]。

2結(jié)果與分析

2.1掃描電鏡觀察

從掃描電鏡表面觀察結(jié)果可以看出，蘆薈表皮細(xì)胞形狀清晰可見，呈四～六邊形，如圖1A所示，在葉的表面覆蓋著一層厚厚的角質(zhì)層，尤其是氣孔器周圍蠟質(zhì)堆積現(xiàn)象明顯，角質(zhì)層的紋飾也比較規(guī)則，掃描電鏡下，整個表皮細(xì)胞表面是比較平滑的（見圖1B）。在低劑量氮離子束（lxl014 N+/cm2和1xl015 N+/cm2）注入后，蘆薈葉片表面總體變化不大，如圖1B所示，細(xì)胞表面依舊是比較平滑的。但是當(dāng)注入劑量達(dá)到1×l016 N+/cm2，在蘆薈葉片上發(fā)現(xiàn)了離子束刻蝕的痕跡以及小洞（見圖1D、F），這與泰國清邁大學(xué)的L.D.Yu等的研究結(jié)果相似[l6]。從圖1F中畫出的標(biāo)尺上可以看出，洞的直徑大小達(dá)到了240nm左右，這個大小足以使外源DNA能夠穿過。通過掃描電鏡的觀察，初步證實了離子束介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移在理論上具有一定的可行性，為目前所開展的離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供了一定的實驗參考依據(jù)，但具體機理還有待于進(jìn)一步深入的研究。

2.2半薄切片觀察

透射電鏡半薄切片觀察結(jié)果顯示，未經(jīng)離子注入的對照組蘆薈葉片表皮橫切面都很光滑，如圖2A和圖2B所示，顯微鏡下觀察到表皮細(xì)胞的橫切面是一條光滑的曲線。而對離子注入過的蘆薈葉片表皮的橫切面的觀察則發(fā)現(xiàn)，葉片表皮上出現(xiàn)了不同程度被打爛的情況，如圖2C和圖2D所示，顯微鏡下觀察到表皮的橫切面不再是一條光滑的曲線，已經(jīng)不能夠染上均勻的顏色。初步認(rèn)為是離子束注入引起的刻蝕效應(yīng)，這與前文中掃描電鏡的觀察結(jié)果相一致。

3結(jié)論與討論

離子束是指一束具有一定能量的質(zhì)量數(shù)小于或等于4的帶電離子束，離子束注入技術(shù)是生物物理技術(shù)，具有生理損傷小、突變譜廣和突變頻率

圖l蘆薈葉片掃描電鏡圖譜

（A）、（B）對照組；（C）～（F）離子束轟擊蘆薈葉片表面掃描電鏡觀察

Fig.l

The picture of Aloe by scanning electron microscope

（A），（B）：The Aloe leaf surface of the control group under the SEM；（C）～（F）：The Aloe leaf surface treated with ion beam un-der the SEM

圖2蘆薈葉片半薄切片觀察圖

（A）、（B）對照組蘆薈葉片的半薄切片（表皮橫切面）觀察；（C）、（D）離子束轟擊后蘆薈葉片透射電鏡半薄切片（表皮橫切面）觀察

Fig.2

The picture of Aloe leaf semithin section by microscope

（A），（B） The observation of Aloe leaf epidermis transverse section of the control group； （C）， （D） The observation of Aloe leaf-epidermis trarnsverse section after ion beam bombardment高等特點。離子束與生物體的相互作用是我國具有獨立知識產(chǎn)權(quán)的生物物理技術(shù)，我國科學(xué)家在20世紀(jì)80年代已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了離子束注入的生物效應(yīng)，并將這一原理應(yīng)用于植物誘變育種。到目前為止，已有十幾項創(chuàng)新成果和一批具有重要價值的育種材料獲得認(rèn)定[2]。

實驗通過掃描電鏡和透射電鏡的方法觀察了離子束轟擊對蘆薈細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的損傷效應(yīng)，掃描電鏡觀察結(jié)果表明，低劑量離子束注入對蘆薈葉片結(jié)構(gòu)影響不大，但當(dāng)注入劑量達(dá)到lxl016 N+/cm2時，則在葉片表面發(fā)現(xiàn)了離子束刻蝕的痕跡以及小洞，初步證實了離子束轟擊對生物材料的刻蝕現(xiàn)象。離子束轟擊后對蘆薈葉表皮橫切面的半薄切片觀察也發(fā)現(xiàn)，對照組的表皮橫切面都很光滑，而離子注入過的表皮的橫切面則出現(xiàn)了不同程度被打爛的情況，進(jìn)一步證實了離子束轟擊引起的刻蝕效應(yīng)。實驗過程中，透射電鏡的觀察部分只做到了半薄切片的觀察，后續(xù)的工作將通過透射電鏡進(jìn)行超薄切片的觀察，以闡明離子束轟擊對細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)的影響，為離子束誘變技術(shù)應(yīng)用于藥用植物的遺傳育種提供一定的參考依據(jù)。

研究結(jié)果從理論上進(jìn)一步證實了離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的可行性。但是，離子束誘變或轉(zhuǎn)基因是一項非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，其具體機理還有待于進(jìn)一步深入的研究。目前開展的離子束生物工程技術(shù)較側(cè)重于應(yīng)用，其誘變及轉(zhuǎn)基因的機理還沒有闡明清楚，因此，在開展應(yīng)用研究的同時，還應(yīng)投入一定的精力于基礎(chǔ)研究，闡明該技術(shù)的機理，從而使其更好地應(yīng)用于生產(chǎn)。

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