范亞軍 倪秀珍

摘要：以豌豆植物為實(shí)驗(yàn)材料建立了一種瞬時(shí)表達(dá)外源蛋白的新方法一發(fā)芽種子真空侵染法。以綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因?qū)υ擉w系進(jìn)行優(yōu)化的結(jié)果表明其最佳工作條件為：菌體工作液濃度OD600=1.0～1.5，真空壓力0.08MPa，真空侵染時(shí)間1min。該方法操作簡(jiǎn)單，可以同時(shí)侵染大量的豌豆植物材料，并將實(shí)驗(yàn)周期縮短為15d，植物侵染后12～14d可收獲外源蛋白，外源蛋白表達(dá)量與葉片注射法相當(dāng)，是一種在豌豆植物中批量生產(chǎn)外源蛋白的新方法。

關(guān)鍵詞：豌豆；瞬時(shí)表達(dá)；發(fā)芽種子；真空侵染

中圖分類號(hào)：Q819

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2014）03-0218-04

豌豆植物早褐病毒（pea early browning virus，PEBV）是一種寄生在豌豆植物體內(nèi)的雙鏈RNA病毒，其中一條RNA鏈負(fù)責(zé)編碼病毒外殼及與線蟲(chóng)傳播相關(guān)的蛋白，而另外一條RAN鏈編碼的蛋白則與病毒的移動(dòng)和復(fù)制有關(guān)。目前經(jīng)過(guò)人工改造的豌豆早褐病毒載體是一種研究豆科植物基因功能及在豆科植物中瞬時(shí)表達(dá)外源蛋白的有效工具[1]。利用植物體瞬時(shí)表達(dá)外源重組蛋白是植物生物反應(yīng)器的一個(gè)重要研究方向，該體系外源蛋白表達(dá)量高，實(shí)驗(yàn)周期短，而且具有相對(duì)操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，但整體來(lái)看接種方式是影響該體系實(shí)驗(yàn)效率的一個(gè)關(guān)鍵因素[2～5]。傳統(tǒng)的接種方式主要有摩擦接種法、葉片注射法和離體植物組織真空侵染法[4～12]，其中摩擦接種法是將含有重組基因的載體在體外轉(zhuǎn)錄，并通過(guò)機(jī)械方式在植物葉片上制造傷口，然后以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物涂抹或噴灑于植物葉片上進(jìn)行接種，該方法操作相對(duì)比較繁瑣，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用較高[4]。目前常用的離體植物組織真空侵染法主要是利用真空壓力對(duì)離體的植物組織如葉片等進(jìn)行接種，此方法操作簡(jiǎn)單，但是在收獲外源蛋白之前保持離體組織的新鮮度具有一定難度[5]。葉片注射接種法是在活體植物葉片上進(jìn)行，要求植物具有2～3片展開(kāi)的葉片，目前此種方法比較常用。利用葉片注射法已經(jīng)成功在豌豆植物中表達(dá)了綠色熒光蛋白及其他重組蛋白[6，7]，但是在實(shí)驗(yàn)操作中發(fā)現(xiàn)此種接種方式很難實(shí)現(xiàn)在植物中批量的生產(chǎn)外源重組蛋白，在此基礎(chǔ)上本研究建立了一種高效地在豌豆中批量表達(dá)外源蛋白的新方法即發(fā)芽種子真空侵染法，并對(duì)此種新的實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)芽種子真空侵染法與葉片注射法外源蛋白的表達(dá)量相當(dāng)，但是發(fā)芽種子真空侵染法縮短了實(shí)驗(yàn)周期，可以批量侵染實(shí)驗(yàn)材料，是一種產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)外源蛋白的新方法。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1質(zhì)粒、菌株、抗體及植物材料

農(nóng)桿菌GV3101由本實(shí)驗(yàn)室保存，豌豆早褐病毒表達(dá)載體pCAPE2-GFP和pCAPEI由丹麥農(nóng)科院惠贈(zèng)，豌豆植物品種為矮秧豌豆（Pisumsativum L.）。綠色熒光蛋白抗體、Rubisco大亞基抗體由東北師范大學(xué)遺傳所制備并提供。

1.1.2試劑

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用抗生素利福平、卡那霉素、四環(huán)素及乙酰丁香酮均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，DNA2000 Marker、蛋白質(zhì)低分子質(zhì)量Marker購(gòu)自日本TakaRa公司，蛋白質(zhì)雜交所用二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。

用來(lái)鑒定豌豆早褐病毒載體pCAPE2-GFP的引物為：5'-CGGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTT-TT-3'5'-GGGGTACCTTATTTGTATAGTTCATCCATG-C-3'

用來(lái)鑒定pCAPEl載體的引物為：5'-CGTTAGATTGCGCTGTGG-3'5'-TGCCTTTGCTACGAACCT-3'

以上引物由上海生物工程有限公司合成。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用菌體重懸液各成分：100μmol/L乙酰丁香酮、10mmol/L NaCl、1.75 mmol/L CaCl、250μL Tween 20、pH5.6的無(wú)菌水溶液。蛋白質(zhì)提取緩沖液各成分（1L）：KC1 0.2g、NaCl 8g、KH2PO40.27g、Na2HPO4 1.42g、pH7.4。

1.2方法

1.2.1豌豆早褐病毒載體的鑒定

分別以豌豆早褐病毒載體pCAPE2-GFP和pCAPEl為模板進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min； 94℃50s，50℃ 50s.72℃50s，33個(gè)循環(huán)；72℃ 8min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.2菌種工作液及植物材料的處理

將豌豆早褐病毒載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，在含有卡那霉素（50mg/L）、利福平（50mg/L）和四環(huán)素（25mg/L）的液體LB培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)OD600值為0.8～1.0時(shí)收集菌體并以菌體重懸液調(diào)節(jié)菌體工作液濃度，將含有兩種載體的農(nóng)桿菌按濃度比1：1混合后于室溫靜置90min備用。將豌豆種子在清水中浸泡4～5h，當(dāng)種子吸水膨脹后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽培養(yǎng)，芽長(zhǎng)為1～2cm的豌豆種子置于上述菌體工作液中進(jìn)行真空侵染。

1.2.3豌豆發(fā)芽種子真空侵染體系的建立及優(yōu)化

本研究選擇真空處理時(shí)間、菌體工作液濃度及真空壓力3個(gè)因子對(duì)該體系進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達(dá)率（表達(dá)綠色熒光蛋白的植株占總株數(shù)的比率）來(lái)評(píng)價(jià)該體系的工作效率，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，每次處理種子數(shù)目不少于20粒，結(jié)果取平均值。

1.2.3.1真空壓力對(duì)工作效率的影響

在菌體工作液濃度（OD00=1.0～1.5）和真空處理時(shí)間（1min）恒定的條件下選擇真空壓力分別為：0.02、0.04、0.06、0.08MPa對(duì)發(fā)芽的豌豆種子進(jìn)行真空侵染，侵染后播種于土壤中，幼苗出土后紫外燈下跟蹤綠色熒光蛋白的表達(dá)情況并記錄。

1.2.3.2真空處理時(shí)間對(duì)工作效率的影響

在真空壓力（0.08MPa）和菌體工作液濃度（OD00=1.0～1.5）恒定的條件下選擇真空處理時(shí)間分別為：1、10、15min對(duì)豌豆種子進(jìn)行真空侵染，侵染后播種于土壤中，幼苗出土后紫外燈下跟蹤綠色熒光蛋白的表達(dá)情況并記錄。

1.2.3.3菌體工作液濃度對(duì)工作效率的影響

在真空壓力（0.08MPa）和真空處理時(shí)間（1min）恒定的條件下選擇菌體工作液濃度分別為：OD600=0.3、0.6、0.9、1.2、1.5對(duì)豌豆種子進(jìn)行真空侵染，侵染后播種于土壤中，幼苗出土后紫外燈下跟蹤綠色熒光蛋白的表達(dá)情況并記錄。

1.2.4發(fā)芽種子真空侵染法與葉片注射法的比較

選擇相同的菌體工作液濃度，分別采用葉片注射法及發(fā)芽種子真空侵染法進(jìn)行接種，紫外燈下跟蹤觀察GFP的表達(dá)情況并拍照記錄。在外源蛋白表達(dá)高峰期分別收集可溶性總蛋白，15%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)膜，并以Rubisco大亞基作為內(nèi)參，以GFP抗體檢測(cè)外源蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。

2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1豌豆早褐病毒載體的PCR鑒定結(jié)果

豌豆早褐病毒的兩個(gè)載體同時(shí)接種植物才能完成正常的侵染工作，通過(guò)PCR法對(duì)pCAPE2-GFP載體上的GFP基因片段和pCAPEI上的特異片段進(jìn)行鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，結(jié)果如圖1所示。

2.2.2發(fā)芽種子真空侵染體系的優(yōu)化

侵染后在紫外燈下跟蹤觀察GFP的表達(dá)情況（從CFP開(kāi)始表達(dá)連續(xù)跟蹤觀察15d），雖然真空處理的時(shí)間不同，但是GFP的表達(dá)率及表達(dá)趨勢(shì)基本一致，均是在真空侵染一周后（豌豆幼苗出土）綠色熒光蛋白開(kāi)始表達(dá)，隨后GFP表達(dá)率升高，在侵染后第12～14d時(shí)表達(dá)率能達(dá)到90%，結(jié)果如圖2A所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)真空壓力的大小是影響實(shí)驗(yàn)體系工作效率的重要因素，在侵染時(shí)間及工作液濃度一致的條件下，真空壓力為0.02MPa時(shí)幾乎沒(méi)有植株表達(dá)綠色熒光蛋白，隨著真空壓力增大GFP表達(dá)率增高，在0.08MPa時(shí)GFP表達(dá)率最高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2B所示。

菌體工作液濃度是影響體系工作效率的另一個(gè)重要因素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GFP的表達(dá)率隨著菌體工作液濃度的增大而升高，當(dāng)菌體工作液濃度為OD600=0.9～1.5時(shí)有90%的豌豆植株表達(dá)綠色熒光蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2C所示。

2.2.3發(fā)芽種子真空侵染法與葉片注射法的比較

實(shí)驗(yàn)中以相同的菌體工作液分別采用了真空侵染法及葉片注射法進(jìn)行接種，接種后跟蹤觀察GFP表達(dá)情況，兩種方法均在接種后第8d開(kāi)始表達(dá)綠色熒光蛋白，真空侵染法的植物材料出土后植物莖最先表達(dá)綠色熒光蛋白，隨后出現(xiàn)在新生葉片的主脈和側(cè)脈，在侵染后12～14d時(shí)GFP在葉肉中大量表達(dá)并擴(kuò)散；葉片注射法的植物材料綠色熒光蛋白首先在注射的葉片中開(kāi)始表達(dá)，隨后擴(kuò)散至鄰近的主莖中并相繼出現(xiàn)在鄰近及新生葉片的主脈和側(cè)脈，侵染后12～14d GFP在葉肉中大量表達(dá)，如圖3所示。

12～15d時(shí)提取豌豆植物可溶性總蛋白，以Rubisco大亞基作為內(nèi)參通過(guò)蛋白雜交法比較兩種接種方法外源蛋白的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，Rubisco大亞基雜交結(jié)果表明各泳道（5～7）植物蛋白質(zhì)上樣量基本一致，GFP雜交結(jié)果表明兩種接種方法外源蛋白的表達(dá)量相當(dāng)。

3討論

利用植物瞬時(shí)表達(dá)外源蛋白最主要的優(yōu)勢(shì)是操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短及外源蛋白表達(dá)量高，目前已有的幾種接種方式各有利弊，本研究以豌豆植物為實(shí)驗(yàn)材料建立了一種新的接種方式，菌體工作液濃度OD600=1.0～1.5時(shí)0.08MPa真空處理1min為該體系的最適條件，真空壓力及菌體濃度是影響該實(shí)驗(yàn)體系的關(guān)鍵因素，當(dāng)真空壓力及菌體工作液濃度很低時(shí)幾乎沒(méi)有GFP表達(dá)，隨著壓力及工作液濃度升高GFP表達(dá)率增加，當(dāng)真空壓力為0.08Mpa，菌體工作液濃度為OD6oo=1.0～1.5時(shí)有90%以上的豌豆植株表達(dá)綠色熒光蛋白。該方法與常用的葉片注射法進(jìn)行比較：葉片注射法在接種前需要豌豆植物具有2～3片完全展開(kāi)的葉片（播種后2～3周），接種時(shí)需要逐株逐個(gè)葉片進(jìn)行接種，而豌豆發(fā)芽種子真空侵染法直接以發(fā)芽的豌豆種子為材料進(jìn)行侵染，可以在同一時(shí)間內(nèi)批量地進(jìn)行接種；葉片注射法獲得外源蛋白的周期約為30d，而發(fā)芽種子真空接種法獲得外源蛋白的實(shí)驗(yàn)周期約為15d；兩種方法均是在侵染后12～14d外源蛋白表達(dá)量最高，蛋白質(zhì)定量分析結(jié)果表明二者外源蛋白表達(dá)量相當(dāng)，通過(guò)兩種不同接種方式的比較我們認(rèn)為發(fā)芽種子真空侵染法是一種可以批量在豌豆植物中快速表達(dá)外源蛋白的新方法。

參考文獻(xiàn)（References）：

[1]CONSTANIN G D，KRATH B N，MACFARLANE S A.et alVirus-induced gene silencing as a tool for functional genomicsin a legume species[J]. The Plant Journal， 2004， 40（4）：622-631.

[2]RAMWSSAR K，SABALZA M，CAPELL T，et al.Maize plants：An ideal production platform for effective and safe molecularpharming[J]. Plant Science， 2008， 174（4）：409-419.

[3]FISCHER R，STOGER E，SCHILLERC S，et al.Plant basedproduction of biopharrnaceuticals[J]. Current Opinion in PlantBiology， 2004， 7（2）：152-158.

[4]DAWSON W O，BECK D L，KNORR D A.et al.cDNAcloning of the complete genome of tobacco mosaic virus andproduction of infectious transcripts[J]. Proceedings of the Na-tional Academy of Science of USA， 1986， 83（6）：1832-1836.

[5]VALENTINE N，GALINA E，HYUNG-IL L，et al.Highly effi-cient transient expression of runctional recombinant antibodiesin lettuce[J]. Plant Science， 2005， 169（2）：433-438.

[6]LIU J Y，MA P D，SUN Y，et al.Expression of human acidicfibroblast growth factor in Nicotiana benthamiana with a pote-to-virus-X-based binary vector[J]. Biotechnology and AppliedBiochemistry， 2007， 48（3）：143-147.

[7]FAN Y J，LI W，ZHU X J，et al.Transient expression of fi—broblast growth factor in pea （Pisum sativum L）plants[J]. AfricanJournal of Biotechnology， 2012， 11（20）：6060-6063.

[8]GREEN B J，F(xiàn)UJIKI M，METT V，et al.Transient protein ex-pression in three Pisum sativum （green pea） varieties[J].Biotech-nology Joumal， 2009，4（2）：230-237.

[9]JIA H，PANG Y，F(xiàn)ANG R.Agroinoculation as a simple way todeliver a tobacco mosaic virus-based expression vector[J].Ac-to Botanica Sinica， 2003， 45（7）：770-773.

[10]11 Y，GENG Y F，SONG H H，et al.Expression of a humanlactoferrin N-lobe in Nicotiana henthmiana with potato virusX-based agroinfection[J]. Biotechnology letters， 2004， 26（12）：953-957.

[11]FERRARO G，BECHER M L，ANGEL S O.et al.Efficientexpression of a Toxoplasma gondii dense granule Cra4 antigenin tobacco leaves[J]. Experimenlal Parasitology， 2008，120（1）：118-122.

[12]LEUZINGER K，DENT M，HURTADO J，et al.Efficitent a—groinfiltration of planls for high-level transient expression ofrecombinant proteins[J].Journal of Visualized Experiments， 2013，23（77）： dio：10.3791/50521.