蘇成元 楊筱慧 朱道弘

摘要：Wolbachia為節(jié)肢動物等的細胞質(zhì)共生細菌，能對宿主的繁殖模式進行調(diào)控，包括誘導胞質(zhì)不親和、孤雌生殖、雌性化及雄性致死。WO噬菌體是一類侵染節(jié)肢動物體內(nèi)Wolbachia的細菌病毒。為檢測麥氏安癭蜂Wolbachia是否被WO噬菌體侵染，本研究使用WO噬菌體的orf7基因引物，對信陽、六安及長沙3種群的WO噬菌體進行了PCR檢測。結(jié)果顯示，3種群的雌、雄蟲體內(nèi)的Wolbachia均有WO噬菌體的侵染，感染率為100%。獲得的3種群麥氏安癭蜂Wolbachia的WO噬菌體orf7基因序列均為371bp，序列完全一致。其序列與粉斑螟Ephestia cautella的wECau B3-1和wCauA5-1株系、反顎繭蜂Asobara tabida的wAtabA3-3株系的一致性最高，在NJ和ML系統(tǒng)樹中，均聚合在同一分支，屬于WO噬菌體的第Ⅲ大群。

關(guān)鍵詞：麥氏安癭蜂；Wolbachia；WO噬菌體；orf7基因；系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

中圖分類號：Q968

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）03-0227-05

沃爾巴克氏體Wolbachia是一類母系遺傳的細胞質(zhì)共生菌，屬于原核生物界細菌門，變形菌綱的α亞綱，立克次氏體目，立克次氏體科，Wol-bachia族，Wolbachia屬[1]。先前基于單一基因序列，將Wolbachia分為A、B、C、D、E、F、G和H8個群（group）[2]，最近也用多位點分型對其加以了驗證[3]。研究得較多的是A、B大群和C、D大群，前者主要感染節(jié)肢動物[4]，后者主要感染絲狀線蟲[5]。估計超過17%的節(jié)肢動物、幾乎全部的絲狀線蟲都感染了Wolbachia[6～8]。Wolbachia能導致多種的宿主表現(xiàn)型，即在線蟲類中表現(xiàn)為互利共生，而在節(jié)肢動物中則表現(xiàn)為對宿主生殖的調(diào)控。Wol-bachia對節(jié)肢動物宿主的生殖調(diào)控包括：誘導宿主胞質(zhì)不親和（cytoplasmic incompatibility，CI）[9]、孤雌生殖（parthenogenesis induction，PI）[10]、雌性化（feminization of genetic males）[1l]及雄性致死（malekilling，MK）[12]。此外，還發(fā)現(xiàn)Wolbachia對某些膜翅目昆蟲的卵巢成熟有促進作用[13]。但也有一些Wolbachia種群并不導致宿主的生殖異常[14]。

20世紀70年代末在Culex pipiens體內(nèi)檢測到WO類似元件的存在[15]，Masui等首次在Teleo-gryllus taiwanemma感染的Wolbachia中發(fā)現(xiàn)了WO噬菌體[16]。經(jīng)噬菌體衣殼蛋白orf7基因的PCR檢測，發(fā)現(xiàn)超過89%的節(jié)肢動物Wolbachia感染了WO噬菌體[17.18]。由于現(xiàn)在廣泛使用的orf7基因的引物還不是足夠的保守，不能擴增所有的WO噬菌體類型，所以WO噬菌體的實際侵染率可能更高。如利用orf7基因的PCR擴增，僅發(fā)現(xiàn)Wolbachia wRi株系的單一WO噬菌體感染[18]，但對其全基因測序則發(fā)現(xiàn)共含3種噬菌體片段[19]。另一方面，在絲狀線蟲的Wolbachia種群中尚未檢測到WO噬菌體的感染[18]。二十面體結(jié)構(gòu)的WO噬菌體粒子已經(jīng)在一些感染W(wǎng)olbachia的節(jié)肢動物中成功純化，通過透射電鏡觀察，可以發(fā)現(xiàn)WO噬菌體頭部的尺寸約為20～40nm，偶爾可見具備類似于T2噬菌體的蛋白質(zhì)尾部[20，21]。最新的研究表明，WO噬菌體染色體為環(huán)狀，其復制類型類似于λ噬菌體[22]。目前，將WO噬菌體分為WO-A和WO-B兩種類型[23]。利用現(xiàn)有orf7基因引物，僅能擴增到WO-B，基于其基因序列，可將WO-B劃分為3個大群（ group）[17]。

癭蜂科為癭蜂總科（Cynipoidea）中的植食性類群，一般于為害部位形成蟲癭，已知約l400種，可劃分為兩個亞科，即古癭蜂亞科Hodiernocynip-lnae和癭蜂亞科Cynipinae，癭蜂亞科包含6個族，即櫟癭蜂族Cynipini、客癭蜂族Synergini、豆癭蜂族Eschatocerin、薔薇癭蜂族Diplolepidini、槭癭蜂族Pediaspidili及草癭蜂族Aylacinj[24，25]。已證實草癭蜂族、薔薇癭蜂族、櫟癭蜂族和客癭蜂族的部分種類有Wolbachia的感染[26～29]。麥氏安癭蜂Andricus mairei Kieffer屬于癭蜂亞科癭蜂族（Cynip-ini），寄主為短柄袍櫟QMercus glandulifera var. bre-vipetiolata Nakai，于春季在寄主的枝條上形成蟲癭，楊筱慧等證實其具Wolbachia感染，感染的Wolbachia屬于A大群[30]。本研究于河南信陽、安徽六安及湖南長沙采集了麥氏安癭蜂蟲癭，并獲得羽化成蟲。利用WO噬菌體的orf7基因特異性引物，通過PCR法擴增了其基因片段，測定了目的基因片段的DNA序列，證實了麥氏安癭蜂體內(nèi)共生的Wolbachia具WO噬菌體侵染。通過與已知昆蟲種類的orf7基因序列的一致性比對，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，確定了其WO噬菌體的進化地位。

1材料與方法

1.1供試樣品的采集

麥氏安癭蜂的蟲癭于2012年5月分別采集自河南信陽、安徽六安和湖南長沙，采集信息見表1。蟲癭寄主為短柄袍櫟Quercus glandulifera var.brevipetiolata Nakai。采集的蟲癭飼養(yǎng)于常溫條件，待成蟲羽化后以無水乙醇浸泡，-40℃條件備用。

1.2總DNA提取

取麥氏安癭蜂不同地理種群的雌成蟲各30頭、雄成蟲各10頭，用超純水洗滌2次后，分別放置到預先裝有100μL STE緩沖液的離心管中。為方便搗碎，將裝有樣本的離心管置于-20℃冰箱中冷凍25min，充分搗碎后加入10μL的10% SDS緩沖液，繼續(xù)研磨1min，加入蛋白酶K（20mg/mL）2μL，充分混勻后56℃水浴2h。加入等體積的酚氯仿異戊醇，充分混勻，5000r/min離心10min，取上清液，重復離心2次。在第2次取得的上清液中加入10μL的醋酸鈉混勻，再加250μL的冰無水乙醇于-20℃過夜。4℃ 14000r/min離心20min，棄上清液。加200μL 75%冷乙醇洗滌，離心棄上清液。待其干燥后加入50μL的TE緩沖液溶解，置于4℃保存。

1.3WO的orf7基因片段的PCR擴增及檢測

擴增WO噬菌體orf7基因（WO噬菌體編碼衣殼蛋白基因）的特異性引物序列是：WO-F：5'-CCCACATGACCAATGACGTCTG-3'和WO-R：5'-CGTTCGCTCTGCAAGTAACTCCATTAAAAC-3'，PCR反應(yīng)體系為25μL包括：14.8μL H2O，2.5μLlOxbuffer，2μL dNTPs，2.5μL MgCl2（25mmol/L），0.2μL Taq DNA polymerase（lU），上下游引物各0.5μL和2μL DNA模板。PCR反應(yīng)程序：94℃3min；94℃ 30s，66℃ 30s，72℃ 30s，30個循環(huán)；最后72℃延伸5min。

取擴增產(chǎn)物5μL點樣于1.0%的瓊脂糖凝膠，置于o.5xTBE緩沖液中電泳，在70V條件下電泳45min。電泳完成后用溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測。

1.4orf7基因片段的測序及分析

將目的基因片段的PCR產(chǎn)物回收、純化，委托上海英駿生物技術(shù)有限公司進行雙向測序。從NCBI網(wǎng)站下載其他昆蟲WO噬菌體的orf7基因序列，并利用Blast進行一致性比較。使用Clustal X2.0軟件將這些序列進行完全排列。最后將排列好的基因序列數(shù)據(jù)輸入MEGA5.0軟件，根據(jù)Kimu-ra's 2-parameter模型計算遺傳距離，參照Model-Test 3.7最優(yōu)進化模型設(shè)定Gamma參數(shù)，并進行1000次自導復制，使用鄰位相連法（neighbor-joining method）構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹。

2結(jié)果與分析

2.1麥氏安癭蜂Wolbachia的WO噬菌體的感染率

使用編碼衣殼蛋白基因orf7的引物WO-F和WO-R，檢測了WO噬菌體在麥氏安癭蜂信陽、六安和長沙種群Wolbachia中的感染。各地理種群分別檢測了雌成蟲30個體、雄成蟲10個體，均獲得了長度約為400的基因片段，且三地理種群的感染率均為100%，證實了WO噬菌體在麥世安癭蜂Wolbachia中的感染（表1）。

2.2麥氏安癭蜂與其他昆蟲Wolbachia的WO噬菌體orf7基因的序列一致性

檢測的信陽、六安和長沙種群麥氏安癭蜂Wolbachia的WO噬菌體，均獲得了371bp的相同orf7基因片段，已提交GenBank注冊，登錄號為KJ609514。由于麥氏安癭蜂Wolbachia屬于A大群，本文將獲得WO噬菌體命名為wAmaiAl-l株系。使用NCBI網(wǎng)站的Blast工具，對麥氏安癭蜂及GenBank已登錄的其他代表性昆蟲種類的Wolbachia的WO噬菌體orf7基因序列進行了一致性分析（表2）。wAmaiAl-l株系與其他昆蟲的Wolbachia的WO噬菌體orf7基因一致性介于77%～99%之間，與粉斑螟Ephestia cautella的wECauA5一l株系、反顎繭蜂A.sobara tabida的wAtabA3-3株系等的orf7基因序列的一致性最高，達99%，與麗蠅蛹集金小蜂Nasonia vitripennis的wNvitBl-l和wNvitA4-1株系的一致性最低，為77%。

2.3麥氏安癭蜂與其他昆蟲Wolbachia的WO噬菌體系統(tǒng)樹的構(gòu)建

基于orf7基因序列，分別使用NJ法和ML法構(gòu)建了麥氏安癭蜂與其他昆蟲WO噬菌體的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1、2）。獲得的NJ和ML系統(tǒng)樹除一些小的分支存在細微差異之外，基本一致。麥氏安癭蜂Wolbachia所感染的WO噬菌體屬于第Ⅲ大群，與粉斑螟Ephestia cautella的wECauB3—1和wCauA5-1株系、反顎繭蜂Asobara tabida的wAtabA3-3株系聚合在同一分支。

在進行序列比對時，可見三大群之間的序列差異性存在區(qū)域特異性，I大群主要在序列的3'端存在差異，而Ⅱ和Ⅲ大群主要在序列的5'端存在差異。按Jukes和Cantor的方法，計算了不同株系間orf7基因的序列差異性，三大群之間orf7基因的序列差異性明顯高于群內(nèi)：I和Ⅱ大群為20.6%、Ⅱ和Ⅲ為18.4%、I和Ⅲ為30.0%；I～Ⅲ大群內(nèi)的序列差異性分別為6.8%、8.O%和4.4%。

3討論

在獨立生活的細菌中，噬菌體元件往往能占其基因總量的lo%～20%，而專性的細胞質(zhì)共生菌往往保持最為簡潔的基因組，僅包括一些基本的功能基因，這可能是由于細胞質(zhì)共生菌能從宿主細胞獲得大多數(shù)的必需品而不需自身合成[31，32]。因此，通常認為細胞質(zhì)共生菌缺乏噬菌體元件[33，34]。但是，通過對Wolbachia專性噬菌體WO的PCR檢測，以及近幾年對Wolbachia全基因組的測序分析，均證實了Wolbachia中噬菌體元件的存在[17～19，23]。并且，WO噬菌體的豐度大，超過89%的節(jié)肢動物Wolbachia均有其侵染[35，36]。在膜翅目昆蟲中，除幾種赤眼蜂Wolbachia中未發(fā)現(xiàn)之外，其他種類的Wolbachia中均檢測到了WO噬菌體的感染，且個體感染率多為100%[17]。Wolbachia能對節(jié)肢動物的生殖方式進行調(diào)控，但其調(diào)控機制尚不清楚。最近的研究發(fā)現(xiàn)，WO噬菌體所攜帶的錨蛋白基因（ankyrin repeat-encoding genes）與尖音庫蚊Culex pipiens的胞質(zhì)不親和有關(guān)[37]。一些學者因而推測WO噬菌體可能在Wolbachia調(diào)控節(jié)肢動物的生殖之中，扮演一種調(diào)節(jié)者的角色。換言之，WO噬菌體或許攜帶生殖調(diào)控的關(guān)鍵基因[17，19]。節(jié)肢動物-Wolbachia-WO噬菌體三者間的相互關(guān)系，確實是令人感興趣的問題。

本研究通過對WO噬菌體衣殼蛋白基因orf7的PCR擴增，證實了麥氏安癭蜂Wolbachia中WO噬菌體的感染，信陽、六安和長沙種群的感染率均為100%，獲得的3種群麥氏安癭蜂Wolbachia的WO噬菌體orf7基因序列完全一致。其序列與粉斑螟Ephestiacautella的wECauB3-1和wCauA5-l株系、反顎繭蜂Asobara tabida的wAtabA3-3株系的一致性最高，在NJ和ML系統(tǒng)樹中，均聚合在同一分支。為進一步探討癭蜂-Wolbachia-WO噬菌體的互作關(guān)系提供了基礎(chǔ)。

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