陳冰心 劉奇暢 鄧喜艷 黃雄軍 劉如石 邱義蘭

摘要：為了探討南高叢藍莓奧尼爾快速增殖的條件，以奧尼爾無菌苗幼嫩莖段為試驗材料，對增殖培養(yǎng)和葉片再生條件進行研究。結(jié)果表明，WPM（改良）+0.5～1.0mg/L ZT的增殖培養(yǎng)基能使增殖系數(shù)提高到5以上，且叢生苗生長健壯和生長速度快；降低鹽濃度和添加玉米素是誘導(dǎo)葉片再生的關(guān)鍵：未切全葉的再生誘導(dǎo)優(yōu)于切斷葉片，前者在1/2WPM+2.0mg/L ZT的培養(yǎng)基中的再生率高達71.4%，且主要形成具有2～4個芽的簇生苗。因此，將最佳的增殖培養(yǎng)和葉片再生相結(jié)合，使南高叢藍莓奧尼爾可持續(xù)快速增殖，為進一步獲得優(yōu)良的奧尼爾種苗及其工廠化生產(chǎn)奠定重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：南高叢藍莓；奧尼爾；增殖；葉片再生

中圖分類號：S663.9

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）03-0246-04

藍莓屬杜鵑花科（Ericaeae）越桔亞科（Vaccin-ioideae）越橘屬（Vaccinium）。藍莓果實富含花青素、不飽和脂肪酸、鞣酸及鈣、鉀、鋅、鐵等元素，B族維生素含量尤為突出，被國際糧農(nóng)組織列為五大健康食品之一，堪稱世界水果之王，是近幾年來發(fā)展最迅速的集營養(yǎng)與保健于一身的第3代果樹品種[1～4]。近幾年來，藍莓鮮果和加工品風(fēng)靡歐美等發(fā)達國家市場，雖然價格昂貴但仍供不應(yīng)求，其傳統(tǒng)的北美產(chǎn)區(qū)的產(chǎn)量已遠不能滿足本地和世界市場的需求，為此世界上其他國家已先后引種。我國有著可以生產(chǎn)藍莓的廣闊天地，南方紅黃壤土地面積達2179600km2，占全國土地面積的22%，其中2040000km2土壤屬酸性，而且很大一部分pH<5.0[5]，由于土壤酸度大和肥力不足，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平較低。藍莓特別適合酸性和強酸性土壤，正是紅黃壤地區(qū)脫貧致富的理想作物。

隨著我國南方對藍莓引種栽培規(guī)模日益擴大，優(yōu)良種苗需求量急劇增加，種苗生產(chǎn)供不應(yīng)求。組織培養(yǎng)憑借其無性繁殖的獨特優(yōu)勢，可以迅速去除病毒和更新品種，保留品種的本來特性，變異性小，并且可在較小空間內(nèi)和較短時間內(nèi)快速地獲得大量無性系組培苗，成為藍莓脫毒和快速繁殖的主要途徑。到目前為止，國內(nèi)外對藍莓組織培養(yǎng)進行了大量的研究，但大多尚處于微繁階段，對離體誘導(dǎo)不定芽再生植株的報道較少。有關(guān)藍莓離體葉片再生的研究表明，影響藍莓離體器官再生的影響因素很多，其中植物激素起決定性的作用，藍莓葉片再生受基因型的限制，不同藍莓品種再生條件及再生頻率存在差異[6～10]。奧尼爾（O'Neal）為南高叢藍莓的代表品種之一，果實大粒、蒂痕小、果粉較少、果肉質(zhì)硬耐儲運、豐產(chǎn)、香味濃，在南高叢藍莓品種中香味評價較高，適宜在我國長江流域大部分地區(qū)種植。有關(guān)奧尼爾離體葉片再生及快速繁殖的研究尚未見報道。因此，我們將增殖培養(yǎng)和葉片再生條件優(yōu)化，獲得奧尼爾快速持續(xù)增殖的關(guān)鍵技術(shù)，為建立適宜于藍莓奧尼爾苗木的工廠化育苗和商品基地建設(shè)奠定堅實基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

植物材料為智博生物科技公司種植園種植的南高從藍莓品種奧尼爾（O'Neal）無菌苗。

1.2方法

1.2.1增殖培養(yǎng)

將無菌苗切成單芽莖段后轉(zhuǎn)接于不同激素濃度的WPM[11]（改良）培養(yǎng)基（各處理激素濃度組合見表1）+20g/L蔗糖+8.8g/L日產(chǎn)瓊脂粉的增殖培養(yǎng)基（pH=5.2）中進行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)40d后觀察芽的生長狀況和計算增殖系數(shù)。光照培養(yǎng)條件為：溫度25+2℃，光強2500Lx，光周期16h光照/8h黑暗，下同。WPM培養(yǎng)基具體改良方法：以Ca（NO3）2·4H2O、KNO3分別代替原WPM培養(yǎng)基中的CaCl2、K2SO4。增殖系數(shù)=增殖芽總數(shù)/接種單芽莖段總數(shù)。

1.2.2葉片誘導(dǎo)再生

選取增殖培養(yǎng)的無菌苗植株第3～6節(jié)葉片，3種外植體包括未切全葉、離葉尖端的1/3處橫切葉片形成的葉尖端葉片和葉柄端葉片，均按照背面朝下分開放置接種于不同鹽濃度（各處理鹽濃度見表2）和不同ZT濃度（各處理ZT濃度見表3）的WPS（改良）培養(yǎng)基+20g/L蔗糖+9g/L瓊脂粉（pH=5.2）的培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶各10片左右，每個處理重復(fù)12瓶。先進行20d的暗培養(yǎng)（溫度25±2℃），隨后進行光照培養(yǎng)。30d后統(tǒng)計葉片出芽率及每個葉片相應(yīng)形成的苗數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1增殖培養(yǎng)

將無菌苗切成單芽莖段轉(zhuǎn)接到不同激素濃度的增殖培養(yǎng)基上進行優(yōu)化，結(jié)果見表1。從表1可以看出，ZT的增殖效果明顯優(yōu)于6-BA和TDZ，且不定芽的發(fā)生率與培養(yǎng)基中的ZT濃度有密切的關(guān)系。當(dāng)ZT質(zhì)量濃度為0.5mg/L時，培養(yǎng)10d左右在莖基部產(chǎn)生黃綠色的愈傷組織，葉節(jié)處出現(xiàn)叢生芽，28d后增殖系數(shù)達到5.02，且主要為主枝芽，叢生芽粗壯，生長勢頭好，呈鮮嫩狀。當(dāng)ZT質(zhì)量濃度升高到1mg/L時，開始生長和分化的時間與ZT 0.5mg/L時相差不大，其增殖系數(shù)稍有所增加。當(dāng)ZT質(zhì)量濃度等于或大于2mg/L時，再生苗開始生長和分化現(xiàn)象提前，多數(shù)分化出來的新梢枝上出現(xiàn)2次分枝，增殖系數(shù)達到10左右，由于側(cè)枝芽多使苗長勢較弱易出現(xiàn)玻璃化苗現(xiàn)象。WPM與其它激素組合效果均差于WPM+ZT組合。使用6-BA時，外植體不萌芽生長，生長停滯。使用TDZ時，10d后在外植體基部形成少量愈傷，雖然能萌芽，但萌芽率低且生長緩慢。因此，增殖培養(yǎng)基以WPM+0.5～1.0mg/L ZT為適宜。

2.2葉片誘導(dǎo)再生

2.2.1鹽濃度對葉片再生誘導(dǎo)的影響

離葉尖1/3處橫切葉片成葉尖端部分和葉柄端部分，以及未切全葉，均按照葉片背面朝下接種于含有不同鹽濃度的培養(yǎng)瓶內(nèi)，30d后統(tǒng)計葉片再生率，結(jié)果見表2。從表2中可以看出，高鹽濃度不利于葉片的再生，其誘導(dǎo)再生苗率僅為0%～2.7%。將大量元素濃度減少一半，能明顯促進葉片的再生，葉片誘導(dǎo)再生苗率提高至23.1%～70.9%。在葉片不同部位中，葉尖端的再生苗誘導(dǎo)率最低，葉柄端居中，未切全葉的誘導(dǎo)率最高。

2.2.2不同激素濃度對葉片誘導(dǎo)再生的影響

不同激素濃度對葉片不同部位的再生苗誘導(dǎo)效果不同。TDZ不能誘導(dǎo)葉片形成再生苗，葉片培養(yǎng)10d后在切口處形成愈傷組織，隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織慢慢褐化，未見再生苗形成。ZT對葉片再生苗誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于TDZ，不定芽的發(fā)生率與培養(yǎng)基中的ZT有密切的關(guān)系。不同部位葉片的再生苗誘導(dǎo)率存在明顯差異，葉尖端的誘導(dǎo)率最低，葉柄端的居中，全葉的誘導(dǎo)率最高（表3）。ZT對葉片再生苗誘導(dǎo)存在明顯的濃度效應(yīng)，低濃度ZT主要誘導(dǎo)形成單生苗，而高濃度ZT有利于簇生苗的形成（表3，圖1A～D）。葉尖端葉片誘導(dǎo)的再生苗主要形成于切口處，葉柄端和全葉誘導(dǎo)的再生苗主要形成于葉柄一側(cè)。葉尖端在0.5mg/LZT時誘導(dǎo)率為0，隨著ZT濃度的升高誘導(dǎo)率逐漸增加，在5mg/L ZT時的誘導(dǎo)率達到32.3%；葉柄端和全葉的誘導(dǎo)率均隨ZT質(zhì)量濃度的升高逐漸增加，在2.0mg/L ZT時誘導(dǎo)率均達到最高，葉柄端和全葉的再生苗誘導(dǎo)率分別為54.3%和71.4%，5mg/LZT時的誘導(dǎo)率卻均下降（表3，圖1A～D）。綜合以上結(jié)果，選用全葉進行葉片再生苗誘導(dǎo)，其再生苗誘導(dǎo)的最佳ZT質(zhì)量濃度為2.0mg/L。

3討論

已有研究表明，藍莓快繁的培養(yǎng)基以WPM的效果最好[6]，且在芽的誘導(dǎo)和增殖中細胞分裂素的作用至關(guān)重要[7，10]。ZT是一種高活力的細胞分裂素，具有打破植株頂端優(yōu)勢、促進腋芽萌發(fā)、誘導(dǎo)不定芽形成的作用。因此，我們主要采用了WPM培養(yǎng)基，重點探討了ZT的效應(yīng)。本研究表明，利用0.5mg/L ZT進行增殖培養(yǎng)，增殖系數(shù)達到5以上，且叢生芽生長健壯，生長速度快，通過2～3次繼代，其增殖系數(shù)可達50—60；1mg/L ZT的增殖系數(shù)稍高于0.5mg/L ZT； ZT質(zhì)量濃度大于等于2mg/L時增殖系數(shù)高達10倍左右，叢生苗太多生長速度慢，同時玻璃化現(xiàn)象的出現(xiàn)使有效苗數(shù)減少。由于ZT價格貴，從生產(chǎn)成本、增殖系數(shù)和苗的生長狀況進行綜合考慮，0.5mg/L ZT的增殖效果最佳。

葉片離體培養(yǎng)的相關(guān)研究證實了藍莓可通過器官發(fā)生途徑誘導(dǎo)再生植株[12～14]。本研究發(fā)現(xiàn)高叢藍莓奧尼爾葉片在高鹽濃度和單獨添加TDZ均不能誘導(dǎo)植株再生，降低鹽濃度和添加ZT是誘導(dǎo)葉片再生的關(guān)鍵因素；未切葉的誘導(dǎo)率優(yōu)于切斷葉，在1/2 WPM+2.0mg/L ZT條件下完整葉的再生率最佳，高達71.4%，且主要形成具有2～4個芽的簇生苗。該結(jié)果與兔眼藍莓[16]和高叢藍莓[8，14～16，18]有關(guān)的誘導(dǎo)葉片植株再生的條件不同，表明藍莓葉片離體再生植株通過器官發(fā)生途徑可能因培養(yǎng)體系、品種等的不同而存在差異。本研究建立了高叢藍莓奧尼爾優(yōu)良的繼代增殖培養(yǎng)體系和葉片再生體系，使之能陜速持續(xù)增殖，其增殖系數(shù)非?？捎^，遠遠高于前人在高叢藍莓增殖研究中的結(jié)果[8，14～19]，為進一步建立適宜于藍莓奧尼爾苗木的工廠化育苗和商品基地建設(shè)奠定堅實基礎(chǔ)。

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