潘章 陳靜 耿軼釗 張輝 紀青

摘要：驅動蛋白的頸鏈是驅動蛋白力產(chǎn)生的關鍵元件。頸鏈與驅動蛋白馬達結構域的對接過程為驅動蛋白沿著微管的向前運動提供了驅動力。驅動蛋白的頸鏈由14～18個氨基酸組成，它連接著馬達結構域和由纏繞螺旋組成的莖部。頸鏈與驅動蛋白馬達結構域的對接過程是通過多種弱鍵相互作用實現(xiàn)的，這些弱鍵相互作用多數(shù)都直接或間接與水分子有關。頸鏈及其相關區(qū)域的極為巧妙的氨基酸結構使得這些弱鍵能夠在細胞環(huán)境下有效地發(fā)揮作用。對頸鏈的結構與功能關系的認識大大提高了我們對驅動蛋白運動機制的理解。

關鍵詞：驅動蛋白；頸鏈；弱鍵作用

中圖分類號：Q6

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）03-0255-05

1驅動蛋白

基于微管運動的驅動蛋白超家族參與細胞內(nèi)的物質運輸、有絲分裂和減數(shù)分裂、控制微管的動態(tài)特征和信號轉導，并與許多神經(jīng)類疾病相關，有著重要的醫(yī)學研究價值[l～3]。驅動蛋白通常被分成14個不同的家族，分別執(zhí)行著不同的胞內(nèi)活動功能[4]。一般來說不同的驅動蛋白家族成員有高度保守的馬達結構域，但是有不同的頸鏈和尾部結構域，使其各自具有獨特的貨物約束力、不同的移動速度、不同的運動方向和移動距離等。驅動蛋白可以單體存在，也可以二聚體、四聚體存在，并且根據(jù)馬達結構域的位置不同可以分為N-端驅動蛋白、C-端驅動蛋白或中間位置驅動蛋白[1～]]。本文著眼于N-端驅動蛋白介紹與其頸鏈相關的當前研究進展。N-端驅動蛋白包括驅動蛋白家族中的Kinesin-l、Kinesin-2、Kinesin-3、Kinesin-5和Ki-nesin-7[2～4，8]。其中Kinesin-l是人們發(fā)現(xiàn)最早的驅動蛋白，也是人們研究最多的驅動蛋白[9，10]，驅動蛋白在細胞內(nèi)行走需要兩個頭部密切配合，相互協(xié)調(diào)，這為分子生物力學研究提供了一個很好的模型。

2頸鏈的結構

頸鏈（neck linker）在驅動蛋白運動過程中起著至關重要的作用，它是研究驅動蛋白力產(chǎn)生機制的關鍵元件（見圖1A）。不同驅動蛋白家族的頸鏈結構有所不同，大約由14～18個氨基酸組成，連接著α6和α7，其中α6是馬達結構域的最后一個α螺旋，α7是纏繞螺旋的第一個α螺旋。Hariharan[11]等通過晶體結構序列分析和二級結構的預測分析兩種方法對Kinesin-l、Kinesin-2、Ki-nesin-3、Kinesin-5和Kinesin-7五家族中頸鏈的氨基酸組成進行了分析。通過比較上述5個家族中驅動蛋白的晶體結構確定，以α6 C-端的賴氨酸為頸鏈的起點，Kinesin-l的頸鏈南14個氨基酸組成，Kinesin-2和Kinesin-3家族的頸鏈由17個氨基酸組成，Kinesin-5和Kinesin-7家族的頸鏈由18個氨基酸組成，見表l。盡管許多驅動蛋白家族的晶體結構已經(jīng)被解析出來，但是文獻中對于頸鏈的起點和終點卻沒有一致的觀點，也就是說哪里作為α6的終點，哪里又是α7的起點在文獻中沒有得到統(tǒng)一。上述頸鏈的起始位置僅是一種觀點或參考。研究表明驅動蛋白頸鏈區(qū)域與馬達N端的βo發(fā)生相互作用，使驅動蛋白頸鏈部分與βo形成有序的β折疊片構象，幫助頸鏈向馬達頭部對接[12]。值得一提的是，研究發(fā)現(xiàn)頸鏈較長的家族，運動性反而較差，這雖然不是絕對的規(guī)律，但驅動蛋白家族在一定程度上有這方面的傾向[11]。

3頸鏈的功能

驅動蛋白的功能主要有兩個方面。首先驅動蛋白能夠抵抗一定的阻力沿微管向前行走，行走時處在前面的頭部需要產(chǎn)生足夠的力使后面的頭部從微管蛋白上分離，同時拖動負載向前運動。這個過程中驅動蛋白的頸鏈與馬達結構域的對接是驅動蛋白力產(chǎn)生機制的關鍵所在。這一過程已經(jīng)被很多學者所關注，Rice等[14]在1999年提出，驅動蛋白上連結馬達結構域和馬達莖區(qū)的頸鏈在馬達沿微管向前的運動上起重要的作用。Case等[15]在2000年提出，對驅動蛋白頸鏈做突變，會導致馬達行動能力的喪失，并且馬達頭部與微管結合和與ATP結合的能力都受到影響。Sindelar等[16]在2002年的研究成果顯示，在馬達頭部結合了ATP的狀態(tài)下頸鏈像“拉鏈”一樣與馬達頭部對接的過程是使驅動蛋白前進的力產(chǎn)生的步驟。2008年Karplus小組[17]對驅動蛋白的頸鏈對接過程進行的分子動力學模擬揭示出，馬達頭部N-端的β0對頸鏈對接的過程是非常重要的。驅動蛋白頸鏈對接過程的拉鏈區(qū)域主要包括β0、β3、Ll0、α4、L13、α6、β9和β10。按照2KIN的氨基酸編號，主要涉及到的氨基酸序列為，β0上Asp3到Ile9，β3上Gly77到Asn79，Ll0上Glu221到Ser225，α4上Ile266到Ala270，L13上Ser291到Arg297和頸鏈上面的Lys325到Thr338[18]。其次，驅動蛋白可以在微管上連續(xù)行走上百步，學者認為驅動蛋白只有采用門控機制才能保證驅動蛋白在高效運動過程中不出現(xiàn)偏差。2011年，Clancy等對驅動蛋白的門控機制進行了詳細的討論。他們通過對頸鏈部分氨基酸進行突變，并應用單分子光學捕捉以及熒光技術對驅動蛋白進行觀測，發(fā)現(xiàn)驅動蛋白頸鏈的結構及取向對它的門控機制有著重要的調(diào)節(jié)作用[19]。

3.1與頸鏈相關的弱鍵相互作用

頸鏈與馬達結構域的對接使驅動蛋白產(chǎn)生了前進的動力，其過程是通過頸鏈氨基酸和馬達頭部氨基酸間弱相互作用的相互配合實現(xiàn)的。在頸鏈拉鏈的對接過程中起作用的主要有氫鍵、鹽鍵和疏水相互作用。

3.1.1氫鍵

氫鍵是典型的弱鍵，在蛋白質的形成和功能方面起著重要的作用。通常氫鍵具有X-H…A的形式，其中虛線代表氫鍵，實線代表化學鍵。X和A是兩個電負性較高的原子（如氮原子和氧原子），X與H之間已經(jīng)產(chǎn)生了化學鍵。氫鍵的鍵能通常比熱運動的能量高一個量級，比化學鍵低一個量級，典型的氫鍵鍵能大多在20～40kJ/mol之間，鍵長在1.2埃和3.2埃之間，鍵角人于90°[20]，見表2。

3.1.2疏水相互作用

疏水相互作用主要和系統(tǒng)熵的變化有關系。當兩個疏水基團之間的距離小于一定程度時，由于結合的水分子的脫離引起熵的增加，由熵增加得到的自由能降低促使兩個疏水基團之間的距離變得更近。發(fā)生疏水相互作用時，兩個疏水基團之間的距離約為3.6埃到7.8埃之間[21]。

3.1.3鹽鍵

鹽鍵又稱鹽橋或離子鍵，是蛋白質分子中帶有正、負電荷的側鏈基團互相接近，通過靜電吸引而形成的，如羧基和氨基、胍基、咪唑基等基團之間的作用力。鹽鍵的吸引力與電荷電量的乘積成正比，與荷電集團間的距離平方成反比。在溶液中此吸引力隨周圍介質的介電常數(shù)增大而降低。鹽鍵的形成不僅是靜電吸引而且也是熵增加的過程。升高溫度時鹽橋的穩(wěn)定性增加，鹽鍵因加入非極性溶劑而加強，加入鹽類而減弱。在水環(huán)境下，通常兩個帶相反電荷的集團之間的距離小于l8埃[22]為鹽鍵的有效作用距離。

這幾種弱相互作用中，氫鍵的力程非常短（一般小于3.2埃），疏水相互作用的力程適中（大約為7埃），而帶電氨基酸之間的庫侖相互作用是一個長程相互作用（大約為18埃）。驅動蛋白正是通過氨基酸的特定排列而有效利用了弱鍵相互作用的這些性質。特別應該指出的是，在頸鏈的區(qū)域，疏水相互作用和氫鍵相互作用相互增強。當一個氫鍵暴露在水環(huán)境中時，由于受到水分子的攻擊，氫鍵并不穩(wěn)定，不會持續(xù)很長的時間。但是，在氫鍵周圍疏水區(qū)域的形成，可以保護蛋白質內(nèi)部的氫鍵，使其強度和壽命都得到增加。同時，氫鍵能使兩個疏水基團之間的距離更近，也增強了疏水基團之間的疏水相互作用。

3.2驅動蛋白頸鏈對接機制分析

在驅動蛋白的周期性運動中，頸鏈對整個驅動蛋白的運動有著極為重要的影響。了解頸鏈部分與馬達頭部的對接過程是揭開驅動蛋白運動機制的關鍵之處。頸鏈可以分為三個部分，第一部分是頸鏈的前3個氨基酸（Lys325、Thr326和Ile327），第二部分是β9，第三部分是β10。頸鏈與馬達頭部對接過程正是按照上述三個部分依次對接完成的。對接的第一步是頸鏈的前3個氨基酸在α6的末端形成半螺旋結構，這啟動了整個的對接過程。半螺旋結構的形成過程中，由Ile327與馬達頭部疏水氨基酸形成的疏水力起到了重要作用；對接的第二步是β9的對接。Hwang等[12]通過分子動力學模擬和實驗的方法研究了頸鏈與馬達頭部的相互作用，發(fā)現(xiàn)馬達頭部N端的βo與頸鏈部分的β9會形成“cover-neck bundle”（CNB）結構。由于CNB結構本身的彎曲作用，帶動著β9實現(xiàn)了向馬達頭部的對接。類似的結構在Ki-nesin-5家族成員Eg5中也可以觀察到[23]；第三步是β10的對接，對接過程中βl0上Asn334氨基酸起著重要的作用。Hwang等的工作中將Asn334氨基酸的作用比作“ASN latch”，它的主要作用是與馬達頭部的Gly77氨基酸形成骨架氫鍵。這個骨架氫鍵的作用很強，在Hwang等的模擬中用了大于400pN的力才在Ins之內(nèi)把這個氫鍵打開。β10上的Glu336氨基酸與馬達頭部的Lys223氨基酸之間也形成了氫鍵和鹽鍵，但是，與“ASNlatch”相比這兩個氨基酸之間的相互作用卻很容易被破壞。為什么“ASN latch”會產(chǎn)生如此強的相互作用仍需要進一步的分析。

3.3水分子在驅動蛋白對接過程中的作用分析

頸鏈的對接過程是在復雜的環(huán)境下自動進行的機械過程。對接過程中所有涉及到的氫鍵、鹽鍵和疏水相互作用以非常精巧的方式相互配合，來完成頸鏈與馬達頭部的對接。在對接過程中水分子起著非常重要的作用。為了研究水分子在拉鏈區(qū)域的作用，我們以驅動蛋白2KIN的晶體結構為基礎建立了分子動力學模型[24]。通過InsightII進行結構優(yōu)化，分子力場為AMBER力場，結構優(yōu)化的結果中與頸鏈的拉鏈區(qū)有關的部分結構如圖1B所示。圖中以棍狀模式顯示了頸鏈區(qū)域所有的氨基酸，水分子以球棍模式顯示，黑色虛線表示氫鍵。圖1B中顯示的水分子均與氨基酸直接或間接形成了氫鍵，頸鏈以黑線表示，它包括了前3個氨基酸形成的半螺旋、β9和βl0。模擬結果表明拉鏈區(qū)域除了包括頸鏈外，還包括馬達頭部的β0以及β7、β3、β8和β4的部分氨基酸。頸鏈區(qū)域與馬達頭部共形成9個骨架氫鍵，這些氫鍵在頸鏈對接過程中起著關鍵作用。氫鍵的形成需要氫鍵受體和氫鍵供體的距離滿足一定的距離要求（一般小于3.2埃），但頸鏈氨基酸與馬達頭部的一些氨基酸的距離并沒有滿足這一點，水分子對它們間的氫鍵形成起到了很大的作用。從圖1B中可以看出，水分子與頸鏈區(qū)域的氨基酸直接或間接形成了許多氫鍵，在拉鏈區(qū)域大約有20個束縛水分子，我們把這20個水分子分成3組進行分析。

第1組包含4個水分子（W14、W77、W79、W190），這些水分子直接與骨架原子形成氫鍵，而且這些氫鍵像骨架氫鍵一樣重要，它們的形成對頸鏈與馬達頭部的對接以及免受外圍水分子的攻擊方面起著重要的作用。這組中最特殊的一個水分子是W14，它與蛋白骨架上的兩個原子形成兩個氫鍵，同時與其他側鏈分子形成兩個氫鍵。W14正好處于頸鏈的β9和β10之間，當頸鏈的前一部分與馬達對接完成后，水分子與頸鏈上的氨基酸形成氫鍵，幫助頸鏈的其他部分達到正確的位點，完成后面的頸鏈與頭部的對接過程；第2組包含著水分子（W150、W153、W182、W192），這些水分子與拉鏈區(qū)域兩側的氨基酸形成氫鍵。其中W153與W14一樣，是這組水分子中最重要的水分子，它與頸鏈上的VAL333以及β3上的TYR78形成氫鍵。氫鍵的形成拉近了拉鏈區(qū)域兩端的距離，促使了骨架氫鍵的形成。需要說明的是，由于這組氫鍵暴露在外圍水分子中，所以這組氫鍵沒有第一組水分子形成的氫鍵穩(wěn)定；第3組包括除了第1組和第2組之外的其他水分子，這些水分子與頸鏈間接形成氫鍵，通過這種方式有助于調(diào)整在拉鏈區(qū)域氨基酸殘基的位置和方向，使它們能夠更有效地形成氫鍵或產(chǎn)生其它相互作用。這一組中最典型的是最右側的兩個結合水（W145、W184），這兩個水分子間形成了氫鍵，并與頸鏈上的氨基酸也形成了氫鍵。

眾所周知蛋白質與其周圍的水分子可以形成水合層，圖1B中我們只描繪了與頸鏈上氨基酸形成氫鍵的周圍水分子以及束縛水。在水合層的水分子對頸鏈的結構和動力學行為產(chǎn)生著重要的影響。首先，它們可以和束縛水一樣與頸鏈氨基酸直接形成氫鍵。在圖1B中周圍的水分子W1748雖然不是穩(wěn)定的束縛水，但它與兩個殘基（Asn79、Asn334）形成3個氫鍵。這對于頸鏈的對接有著很大的促進作用；其次，疏水相互作用可以使體系的自由能進一步降低，疏水氨基酸在水環(huán)境中的疏水相互作用在對接過程中十分重要。頸鏈部分Ile327、Va1331、Va1333以及Leu335產(chǎn)生的疏水相互作用以及形成的疏水空間區(qū)域有效地促進了氫鍵的形成，同時使蛋白質內(nèi)部的氫鍵免受水分子攻擊。疏水相互作用在蛋白質運動過程中可能發(fā)揮的作用比我們想象的更重要，值得我們進一步深入研究。

4小結

驅動蛋白分子組成了一個精巧的納米機械，頸鏈對接過程是驅動蛋白運動過程中重要的一步。頸鏈的對接過程是許多分子內(nèi)和分子間弱相互作用的結果，這些相互作用多數(shù)都直接或間接地與水有關。特別是疏水作用與氫鍵作用的特殊配合達到了特殊的力學效果。我們通過驅動蛋白頸鏈的結構一功能關系得到的認識對于深入理解驅動蛋白的運動機理有著重要的作用。

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