李仁茂　黃健華

摘要 [目的]對平菇中的海藻糖進(jìn)行定性和定量分析。[方法]以平菇為試驗材料，以熱乙醇為抽提液，用紙層析進(jìn)行定性分析，以蒽酮比色法進(jìn)行定量測定。[結(jié)果]平菇（含水量為85%）中含有海藻糖，其含量為2.06%，干燥平菇中海藻糖含量則為13.7%。[結(jié)論]該研究可為海藻糖的提取和開發(fā)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 平菇；海藻糖；提取；含量；測定

中圖分類號 S646.1+4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03369-03

Abstract [Objective] To make qualitative and quantitative analysis of trehalose in Pleurotus Ostreatus. [Method] The qualitative analysis was performed by paper chromatography， and the quantitative determination was conducted by anthrone spectrophotometry using Pleurotus Ostreatus as experiment material， hot alcohol as extracting reagent. [Results] The results showed that there is trehalose in Pleurotus Ostreatus which contain 85% water， in which the content of trehalose is 2.06%， while its content in dry Pleurotus Ostreatus is 13.7%. [Conclusion] This study will provide certain basis for extraction and development of trehalose.

Key words Pleurotus Ostreatus； Trehalose； Extraction； Content； Determination

海藻糖是蔗糖的同分異構(gòu)體，基本性質(zhì)同其他雙糖，但海藻糖還有其他不同的功能。

①可以作為生物的碳源和能源。例如在原核生物中，海藻糖可以作為碳源；酵母和真菌中，存在于其孢子、果實體、空氣菌絲和營養(yǎng)細(xì)胞，可作為碳源或能源。

②可以作為蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的穩(wěn)定劑和保護(hù)劑，保護(hù)它們不會脫水。有些生物如低濕生活的生物如植物、酵母細(xì)胞和真菌孢子可以在近乎脫水的情況下仍然可以生存。利用海藻糖使細(xì)胞能夠抗干燥（或其他應(yīng)激的情況）也許是一種古老的適應(yīng)功能，因為古細(xì)菌在應(yīng)激情況下發(fā)現(xiàn)它可以產(chǎn)生并積累海藻糖[3]。明白這些機(jī)制可以使科研人員發(fā)明保存易干燥生物材料的新方法。

海藻糖可以抑制細(xì)胞膜的相轉(zhuǎn)變溫度，該糖可以在缺乏水的情況下維持脂處于液態(tài)的晶體狀態(tài)[4]。X射線衍射研究表明，海藻糖恰到好處地位于細(xì)胞膜極性頭部之間的多個位點處，海藻糖的較強(qiáng)穩(wěn)定效應(yīng)與它的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，這種結(jié)構(gòu)保證了海藻糖能與極性基團(tuán)的頭部匹配[5]。海藻糖也可以在干燥情況下保護(hù)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。它由于沒有還原性不會發(fā)生褐變反應(yīng)，而褐變反應(yīng)會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性。

③防熱。海藻糖在耐熱方面有著關(guān)鍵的作用，在應(yīng)激的情況下海藻糖合成酶會被誘導(dǎo)產(chǎn)生，增加海藻糖的含量。海藻糖在較高溫度下可以通過穩(wěn)定蛋白質(zhì)使細(xì)胞免于熱的損傷。此外，海藻糖還具有抑制已經(jīng)變性蛋白質(zhì)的聚集。在酵母和植物中，海藻糖可以作為信號分子指導(dǎo)和控制某種代謝途徑甚至影響生長。此外，已經(jīng)證明海藻糖可以保護(hù)蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜免于因很多應(yīng)激條件所造成的失活和變性，這些應(yīng)激包括干燥、脫水、熱、寒冷和氧化等[1]。

④免于自由基的損傷。海藻糖可以保護(hù)細(xì)胞不受到氧自由基的損傷，還可以清除氧自由基[6]。⑤防寒。海藻糖在低溫下可以阻止某種蛋白質(zhì)的變性和聚集，穩(wěn)定低溫情況下流動性降低的細(xì)胞膜?？梢杂^察到當(dāng)細(xì)胞膜的兩側(cè)有海藻糖存在時，外源海藻糖可以最大程度地保護(hù)生物免于凍傷。

⑥作為感應(yīng)化合物和生長調(diào)節(jié)劑。海藻糖或者相關(guān)代謝物可以作為植物生長和發(fā)育的調(diào)節(jié)物。這一作用類似于酵母中6磷酸海藻糖對己糖激酶和糖酵解的作用。

⑦作為細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)組分。在分枝桿菌和棒狀桿菌中海藻糖是許多細(xì)胞壁脂類的基本組分[7]。

在動物界中，成年蛔蟲和蛔蟲卵含有大量海藻糖（占干重的6%～9%）[8]。至今為止還沒有在高等脊椎動物中發(fā)現(xiàn)海藻糖，在人的腎和小腸只是發(fā)現(xiàn)了海藻糖酶[9-10]。

⑧其他功能。在大腸桿菌中海藻糖是高滲透壓的產(chǎn)物[11]，在嗜鹽微生物和藍(lán)細(xì)菌中也可以作為一種結(jié)構(gòu)組分或相應(yīng)的溶質(zhì)[8]。

由于海藻糖具有上述良好的功能和性質(zhì)，使它在分子生物學(xué)、食品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)等基礎(chǔ)科學(xué)研究和應(yīng)用領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。它具有良好的防腐儲存作用，賦予生物體抵抗干燥、干旱、寒冷等惡劣環(huán)境的能力，為其在生物制品活性保存以及食品、化妝品方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[12-13]。目前，獲得海藻糖的主要材料是面包酵母，從其他生物體中提取海藻糖的研究報道較少。筆者以平菇為材料，對平菇中的海藻糖進(jìn)行定性分析和定量分析，以期為海藻糖的提取、開發(fā)及應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 提取材料平菇[Pleurotus ostreatus（Jacq.ex Fx）kummer]從湛江當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)貿(mào)市場上購得。

主要試劑：活性碳、732強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂、717強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂、海藻糖等，均為國產(chǎn)分析純。標(biāo)準(zhǔn)海藻糖溶液：海藻糖的水溶液，濃度為10 mg/ml。海藻糖鑒定用試劑： A液，AgNO3的水-丙酮飽和溶液，水∶丙酮=1∶200（V/V）；B液，將1 g NaOH晶體溶于100 g乙醇水溶液中，乙醇∶水=1∶1（W/W）。 蒽酮試劑：100 mg蒽酮溶于100 ml 98%H2SO4，呈淡黃色。

1.2 方法

1.2.1 粗提[14]。

稱取20 g平菇（含水量約為85%），將其在研缽中磨成勻漿，然后加40 ml 70% 乙醇，于80 ℃熱水中抽提1.5 h，并且不時攪拌。3 000 r/ min離心10 min，取上清液，殘渣用5 ml 70% 乙醇洗滌2次，合并上清液。

1.2.2 除雜質(zhì)、脫色[15]。在上清液中加入30 ml 20%ZnSO4溶液，以飽和Ba（OH）2調(diào)節(jié)pH到8，再加入5 g活性炭，于70 ℃熱水中加熱10 min并不時攪拌，3 000 r/min 離心10 min，取上清液加熱濃縮至10 ml。

1.2.3 平菇提取液中離子的去除[16]。 取50 ml 732強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，預(yù)先處理成H+型，樹脂均勻裝填于1 cm×40 cm的層析柱中，將10 ml提取液全部轉(zhuǎn)移到此離子交換樹脂面上，以蒸餾水洗脫（流速不能太快，用恒流泵控制流速2.5 ml/min），用燒杯收集洗脫液，直至流出液無糖為止（以蒽酮試劑檢查）。并用上法去除陰離子。量取洗脫液體積，取其1/10放在表面皿上，以沸水浴蒸發(fā)至干，所得干燥樣品用1 ml蒸餾水溶解，此1 ml經(jīng)離子交換樹脂純化的樣品溶液相當(dāng)于2 g平菇提取所得到的海藻糖液。

1.2.4 平菇提取液中糖的分離鑒定[17]。取7 cm×20 cm層析濾紙1張，用海藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液4 μl（濃度為10 mg/ml）點樣，同時點取2個不同量的平菇提取液樣點。以正丁醇∶丙酮∶水∶醋酸=10∶6∶6∶2（V/V）的混合液為展層液，將濾紙置于層析缸中，在室溫下當(dāng)樣品上行到距原點15 cm的前沿上，取出，自然風(fēng)干后，先在濾紙條上均勻地噴上A液，晾干后再均勻地噴上B液，并將濾紙條于暗處放置10 min，然后觀察結(jié)果。

1.2.5 平菇提取液中海藻糖含量的測定[17-18]。

1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。取1張層析濾紙，距離濾紙末端5 cm畫一起始線做7個點樣用標(biāo)記，左右兩末端分別點10 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)海藻糖溶液3～4 μl作為參照點，其含海藻糖30～40 μg；中間5個標(biāo)記上分別點上1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 μl的標(biāo)準(zhǔn)海藻糖溶液作為測量點，使其分別含有15、30、45、60、75 μg的海藻糖，如上述方法一樣展層。層析后對左右兩端含有參照樣品的濾紙進(jìn)行顯色，根據(jù)已經(jīng)顯色的斑點位置及大小剪下濾紙中間相應(yīng)的未顯色的測量點斑點，并在斑點附近剪同樣大小的空白濾紙作為比色測定的對照。將濾紙片剪碎置于試管中，加10 ml 0.1 mol/L的鹽酸洗脫20 h，然后取濾液2 ml加4 ml蒽酮試劑，沸水浴加熱15 min，冷卻后在波長620 nm處讀取OD值。以海藻糖含量為橫坐標(biāo)，OD620為縱坐標(biāo)，制作海藻糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.2 樣品海藻糖含量的測定。

按適宜的點樣量在濾紙上點上4點平菇提取液，濾紙左右2端各設(shè)1個點樣點作為參照點，同“1.2.5.1”層析后對濾紙左右兩側(cè)含有參照點的樣品染色，根據(jù)顯色位置在濾紙上剪下未顯色的斑點，同時剪下相同大小的空白濾紙做比色測定對照用。濾紙片剪碎后分別用10 ml 0.1 mol/L的鹽酸抽提20 h，抽提液用蒽酮比色法測定海藻糖的含量。根據(jù)測定結(jié)果可計算出海藻糖的含量，換算出1 g平菇中所含海藻糖的含量。

1.2.6 海藻糖生物學(xué)性質(zhì)的測定。

向編號為1～3的試管中分別加入4 ml的10%（W/V）的奶粉溶液，在編號1的試管中加入標(biāo)準(zhǔn)海藻糖溶液（濃度為100 mg/ml）2 ml，向2號試管中加入2 ml海藻糖提取液，3號試管作為對照，常溫下放置3 d后計算總菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

試驗得海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。由圖2可知，其回歸系數(shù)為0.997 8，線性良好，可以作測定海藻糖之用。

2.3 平菇中海藻糖含量 根據(jù)以上方法測定海藻糖的含量，測定的值經(jīng)計算得到的結(jié)果見表1。

海藻糖含量可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出，經(jīng)過計算取其平均值，1 μl提取液中含有41.2 μg。按公式：

1 g平菇中海藻糖含量（%）=1 μl提取液中海藻糖含量×1 000/2×1 000 000×100%可算出平菇（含水量為85%）中海藻糖的含量為2.06%，則1 g干燥平菇中的海藻糖含量為13.7%。

2.4 海藻糖的生物活性 試驗得出，1、2、3號試管的總菌數(shù)分別為2.2×107、2.8×107、7.1×107個/ml。由此可見，加標(biāo)準(zhǔn)海藻糖和加平菇提取液的奶粉溶液所含總菌數(shù)比空白對照的總菌數(shù)少，這說明提取液中含有與海藻糖相同的生物活性，也說明平菇中含有海藻糖。

3 討論

紙層析法是一種古老的分析手段，具操作簡單、費用低，操作易行等特點，至今仍被廣泛采用，特別是在糖類分析中廣泛應(yīng)用。其Rf值重現(xiàn)性比薄層層析法好，更適合于海藻糖定性分析[19-20]，如果是定量分析其準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性差[21]。然而王蘭等通過點樣量、展層體系、洗脫體系的確定，解決了利用紙層析法定量測定海藻糖誤差大、重現(xiàn)性差的問題[22]。因此，如果嚴(yán)格按照試驗步驟操作的話，紙層析完全可以對海藻糖進(jìn)行定量分析，并且其準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性都好[20]。雖然高效液相色譜法是海藻糖定量分析的首選方法，但不具備高效液相色譜時，紙層析法也可較好地用于海藻糖的定量分析。

由于展層體系是紙層析定量分析方法的關(guān)鍵。因此，筆者采用的展層劑系統(tǒng)為正丁醇∶丙酮∶水∶醋酸=10∶6∶6∶2（V/V）[22]，顯色劑由A液（AgNO3的水-丙酮飽和液）和B液（NaOH的乙醇水溶液）組成，此展層體系能將海藻糖和葡萄糖以及其他還原糖分開。由此可看出，海藻糖在此展層溶液中的分離效果好，顯色效果明顯，棕黃色的底色顯示出棕黑色的斑點。但是顯色后的濾紙不能長期保存，是由于A液中的AgNO3見光氧化成黑色，從而使棕黃色的底色變成黑色，掩蓋了顯示效果。

該試驗測得的海藻糖Rf值約為0.29，與劉傳斌等[17]所測得的Rf值約為0.25有所不同。這可能是展層液的pH、展開方式、溫度、濾紙等因素引起，其主要原因可能是濾紙的不

同造成的[20]。濾紙本身的pH及含水量對Rf值的影響很大，不同的濾紙得到不同的Rf值，不同的斑點形狀。紙內(nèi)含水量的多少隨溶劑與紙對水的親和力大小而異，質(zhì)地不均一的濾紙常使溶劑擴(kuò)展不一致，沿濾紙纖維的方向流動紊亂。紙的含水量不均一，不能得到理想的分離效果。除此之外，提取液中的雜質(zhì)也會對Rf值有影響，造成Rf值與劉傳斌等測定的不同。

參考文獻(xiàn)

[1]

ELBEIN A D，PAN Y T，PASTUSZAK I，et al.New insights on trehalose：a multifunctional molecule[J].Glycobiology，2003，13：17R-27R.

[2] RICHARDS A B，KRAKOWA S，DEXTER L B，et al.Trehalose：a review of properties，history of use and human tolerance，and results of multiple safety studies[J].Food Chem Toxicol，2003，40：871-898.

[3] NICOLAUS B，GAMBACORTA A，BASSO A L，et al.Trehalose in Archaebacteria systems[J].Appl Microbiol，1988，10：215-217.

[4] CROWE L M，CROWE J H.Trehalose and dry dipalmitoyl phosphatidylcholine revisited[J].Biochim Biophys Acta，1988，946：193-201.

[5] RUDOLPH A S，CHANDRASEKHAR E，GABER B P，et al.Molecular modeling of saccharidelipid interactions[J].Chem Phys Lipids，1990，53：243-261.

[6] BANAROUDJ N，LEE D H，GOLDBERG A L.Trehalose accumulation during cellular stress protects cells and cellular proteins from damage by oxygen radicals[J].J Biol Chem，2001，276：24261-24267.

[7] LEDERER E.Cord factor and related trehalose esters[J].Chem Phys Lipids，1976，16：91-106.

[8] ARGUELLES J C.Physiological roles of trehalose in bacteria and yeasts：a comparative analysis[J].Arch Microbiol，2000，174：217-224.

[9] MERCER J，EAGLES M E，TALBOT I C.Brush border enzymes in coeliac disease：histochemical evaluation[J].J Clin Pathol，1990，43：307-312.

[10] SASAITAKEDATSU M，TAKETANI S，NAGATA N，et al.Human trehalase：characterization，localization，and its increase in urine by renal proximal tubular damage[J].Nephron，1996，73：179-185.

[11] KEMPF B，BREMER E.Uptake and synthesis of compatible solutes as microbial stress responses to highosmolality environments[J].Arch Microbiol，1998，170：319-330.

[12] WHATMORE A M，REED R H.Deter mination of turgor pressure in Bacillus subtilis：a possible role for Kt in turgor regulation[J].J Gen Microbiol，1990，136：2521-2526.

[13] RUEDA B，MIGUELEZ E M，HARDISSON C，et al.Changes in glycogen and trehalose content of Streptomyces brasiliensis during growth in liquid cultures under sporulating and nonsporulating conditions[J].FEMS Microbiol Lett，2001，194：181-185.

[14] 葛文光，于曉雨，唐傳核.海藻糖提取工藝的研究[J].食品科學(xué)，1998，19（5）：21-24.

[15] 譚佩幸.現(xiàn)代化學(xué)試劑手冊第三分冊[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1996：1.

[16] 蔡武城，袁厚積.生物物質(zhì)常用化學(xué)分析方法[M].北京：科學(xué)出版社，1982：59-60.

[17] 劉傳斌，云戰(zhàn)友，魯濟(jì)青，等.海藻糖的分析方法[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1998，24（5）：40-42.

[18] 張志良.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].3版.北京：高等教育出版社，2003：127-130.

[19] 郭勇.現(xiàn)代物化技術(shù)[M].廣州：華南理工大學(xué)出版社，1995：6.

[20] 繆靜.海藻糖分析方法的研究[J].微生物學(xué)通報，2004，31（5）：96-100.

[21] 干賓賓.高效液相色譜法測定海藻糖[J].化工技術(shù)與開發(fā)，2003，32（1）：22-23.

[22] 王蘭，肖冬光.紙層析分離洗脫法定量測定海藻糖[J].生物技術(shù)，2002，12（3）：27-29.