黃 璐，歐小懂，古 力，劉麗華，黃炳坤

（1.河源市中心血站，廣東河源517000；2.河源市人民醫(yī)院，廣東河源517000）

ABO疑難血型鑒定情況分析

黃 璐1，歐小懂1，古 力1，劉麗華1，黃炳坤2

（1.河源市中心血站，廣東河源517000；2.河源市人民醫(yī)院，廣東河源517000）

ABO血型是輸血醫(yī)學(xué)中最重要的血型系統(tǒng)，ABO血型誤定極易引發(fā)溶血性輸血反應(yīng)，由此造成貧血、腎衰竭、休克甚至死亡。有資料顯示ABO血型誤定，理論上導(dǎo)致無效輸血的可能＞4%［1］。因此，正確鑒定ABO血型是保障臨床輸血安全有效的前提。筆者就日常工作中發(fā)現(xiàn)的ABO定型困難的標(biāo)本，以血清學(xué)為血型鑒定的基礎(chǔ)，結(jié)合聚合酶鏈反應(yīng)－序列特異性引物擴(kuò)增（PCR－SSP）方法進(jìn)行ABO血型基因分型，解決了因血型正反定型不符而導(dǎo)致難以定型的難題，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

以往積累的ABO血型定型困難無償獻(xiàn)血者標(biāo)本20例（從37 264名獻(xiàn)血者血液中發(fā)現(xiàn)），醫(yī)院送檢標(biāo)本1例，共21例樣本。其中抗原減弱的3例獻(xiàn)血者血液在街頭紙板法初篩正定時(shí)均被誤定為O型。

1.2 血清學(xué)試劑與方法

單克隆抗A、抗B、抗－IgG、篩選細(xì)胞與譜細(xì)胞均為上海血液公司產(chǎn)品，抗A1、抗AB、抗H為美國Immucor公司產(chǎn)品，反定型紅細(xì)胞為長春博德公司產(chǎn)品。血型正反定型、直接抗人球蛋白試驗(yàn)、抗體篩選及鑒定試驗(yàn)、吸收放散試驗(yàn)、唾液血型物質(zhì)凝集抑制試驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法［2］。

1.3 PCR－SSP基因分型

采用QIAGEN試劑盒抽提樣本基因組DNA，采用美國G＆T公司ABO基因PCR－SSP分型試劑盒進(jìn)行常規(guī)等位基因分型，試劑盒可檢測出A1、B、O1、A201 4個(gè)等位基因，內(nèi)對照為擴(kuò)增人類生長激素（HGH）基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，大小為207bp，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物參考見表1。反應(yīng)體系9μl，試劑分4管擴(kuò)增，采用熱啟動(dòng)技術(shù)即95℃預(yù)溫5min，然后95℃30s，60℃30s，72℃90s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物檢測：3%瓊脂糖，10v／cm電泳35min。紫外燈下凝膠成像確定結(jié)果。

表1 PCR產(chǎn)物參數(shù)

2 結(jié)果

2.1 21例ABO疑難血型標(biāo)本血清學(xué)檢測結(jié)果見表2、表3。表2提示抗－M抗體與非特異性冷凝集素是影響當(dāng)?shù)責(zé)o償獻(xiàn)血者血液ABO血型，導(dǎo)致定型困難的主要因素。

表2 血漿中存在不規(guī)則抗體導(dǎo)致ABO正反定型不符18例

表3 亞型引起RBC表面抗原減弱3例

2.2 對被抗體致敏的18號標(biāo)本及抗原減弱的19－21號標(biāo)本進(jìn)行ABO血型PCR－SSP基因分型驗(yàn)證，結(jié)果18、19、20號為A／O1型，21號為B／O1型，與血清學(xué)分型結(jié)果相吻合（見圖1）。1－17號標(biāo)本未進(jìn)行基因分型，因?yàn)樵谘逯姓业讲灰?guī)則抗體且紅細(xì)胞未被致敏，排除ABH抗原異常的原因。

3 討論

ABO疑難血型常表現(xiàn)為：正定型與反定型不一致；血型“改變”，兩次定型不一致；弱凝集，難判斷＋／－；與ABO“同型血”，交叉配血不合；與ABO“同型血”交叉配血“相合”，但輸血時(shí)發(fā)生了輸血反應(yīng)；與ABO“同型血”交叉配血相合，輸血無反應(yīng)，但Hb升高值未達(dá)到預(yù)期效果等等［3］。常規(guī)的ABO血型血清學(xué)技術(shù)一般以紅細(xì)胞表面的抗原與抗體反應(yīng)的凝集試驗(yàn)為基礎(chǔ)，采用正反定型進(jìn)行檢測。

對于疑難血型標(biāo)本進(jìn)一步做不規(guī)則抗體篩查、吸收放散、唾液血型物質(zhì)凝集抑制等試驗(yàn)項(xiàng)目［4］。這時(shí)一般可解決本文出現(xiàn)的抗－M，抗－P1和非特異性冷凝集等意外抗體造成ABO血型鑒定困難問題。在特殊情況下，如紅細(xì)胞被自身抗體致敏、表型被疾病干擾、ABO亞型、RhD變異體如弱D、極弱D（De1）等血型在應(yīng)用血清學(xué)方法的檢測結(jié)果存在疑問時(shí)，再進(jìn)行分子生物學(xué)基因分型方法是正確判定血型不可缺少的輔助手段［5］。

目前實(shí)驗(yàn)室反定型細(xì)胞都是采用混合細(xì)胞，其ABO以外的抗原成分非常復(fù)雜，標(biāo)本血清中含有不規(guī)則抗體時(shí)很容易和反定型細(xì)胞發(fā)生多凝集反應(yīng)，從而影響血型鑒定的結(jié)果，對與O細(xì)胞發(fā)生凝集的標(biāo)本，其反定型的結(jié)果是不可靠的。血清中存在不規(guī)則抗體的標(biāo)本，應(yīng)在不規(guī)則抗體鑒定的基礎(chǔ)上，選用不規(guī)則抗體相應(yīng)抗原陰性的紅細(xì)胞進(jìn)行ABO反定型試驗(yàn)。對存在冷凝集素的標(biāo)本，紅細(xì)胞用溫浴至37℃的生理鹽水反復(fù)洗滌5－6次，直至顯微鏡下觀察不到有紅細(xì)胞凝集后進(jìn)行ABO正定型試驗(yàn)；血清在4℃用O型洗滌紅細(xì)胞吸收1－2次后進(jìn)行反定型試驗(yàn)，可排除冷凝集素的干擾，從而正確鑒定標(biāo)本ABO血型。

18號標(biāo)本紅細(xì)胞被自身抗體致敏，經(jīng)基因分型后確定為A／O1型，與血清學(xué)分型吻合。對于含自身抗體的標(biāo)本，因紅細(xì)胞被致敏，血漿中存在自身抗體，無論是血清學(xué)檢測還是臨床的配合性試驗(yàn)，都是非常棘手的問題，尤其對吸收放散效果不佳的樣本，結(jié)合基因分型技術(shù)，能起到有效的輔助作用。

圖1 ABO基因擴(kuò)增片段電泳圖譜

19－21號標(biāo)本經(jīng)吸收放散實(shí)驗(yàn)均檢出A或B抗原，而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［6］有罕見的缺乏261核苷酸位G缺失的O基因細(xì)胞表面可產(chǎn)生弱A表現(xiàn)型，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染mRNA，表達(dá)出的相應(yīng)抗原均表現(xiàn)出Ael血清學(xué)的特性，可能抑制抗－A抗體的產(chǎn)生，所以對于血清學(xué)中最為敏感的抗原檢測方法吸收放散實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的陽性結(jié)果也應(yīng)保持謹(jǐn)慎的態(tài)度。21號標(biāo)本在唾液血型物質(zhì)凝集抑制試驗(yàn)中未檢出B抗原物質(zhì)，如未進(jìn)一步行基因分型檢測，則在實(shí)驗(yàn)室極易誤定為O型，最終結(jié)合血型血清學(xué)與基因分型結(jié)果分析，該樣本的血型定為Bx亞型。如果被誤定血型的獻(xiàn)血者血液輸注給患者，患者血漿中含供者相應(yīng)抗原的抗體，則會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的輸血反應(yīng)。因此，在ABO血清學(xué)基礎(chǔ)上結(jié)合基因定型方法，對疑難的血型正確定型，對保證輸血安全極為重要。

綜上所述，鑒定ABO疑難血型，在傳統(tǒng)血清學(xué)鑒定技術(shù)基礎(chǔ)上結(jié)合ABO基因分型檢測，能簡便、快速、準(zhǔn)確地鑒定疑難ABO血型，不受自身抗體干擾、不必作家系調(diào)查、不必重復(fù)采血、不必考慮是否為分泌型，順利解決疑難血型鑒定問題，彌補(bǔ)傳統(tǒng)血型血清學(xué)鑒定技術(shù)的缺陷。

致謝：本課題得到深圳市血液中心盧亮副主任、蘇宇清教授、喻瓊教授、梁延連教授的技術(shù)支持與幫助，在此一并表示感謝！

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2013－07－27）

1007－4287（2014）07－1190－02

2010年度河源市科技計(jì)劃項(xiàng)目