孫慶國，趙文靜，匡玉吉，李 煒，周翠紅，董麗芳，張寶華

（吉林省肝膽病醫(yī)院，吉林長春130062）

BriCyte E6和FACSCantoⅡ流式細胞儀在淋巴細胞亞群分析中的對比研究

孫慶國＊，趙文靜＊，匡玉吉，李 煒，周翠紅，董麗芳，張寶華

（吉林省肝膽病醫(yī)院，吉林長春130062）

流式細胞術是在上個世紀70年代逐漸發(fā)展起來的一種集光學、電子、流體力學、計算機、生物學等多個學科，能夠對細胞的物理和化學特性進行檢測和分析的一種技術。最初，流式細胞儀的應用范圍主要限于細胞生物學、免疫學、遺傳學、植物學等基礎研究領域。不過隨著基礎研究成果不斷向臨床應用轉化，流式細胞儀也開始從研究領域擴展到臨床領域。

臨床上，流式細胞儀主要應用于淋巴細胞亞群分析。淋巴細胞大致分為T淋巴細胞（CD3＋細胞）、B淋巴細胞（CD3－CD19＋細胞）和NK細胞（CD3－CD16／56＋細胞）3個亞群。此外根據(jù)是否表達CD4和CD8，還可以將T淋巴細胞進一步劃分為輔助／誘導T淋巴細胞（CD3＋CD4＋細胞）和抑制／細胞毒T淋巴細胞（CD3＋CD8＋細胞）。淋巴細胞的分類計數(shù)對于免疫缺陷病、腫瘤、感染性疾病、自身免疫病等疾病的診斷、治療監(jiān)控、預后判斷都具有重要意義。

本研究的主要目的是對BriCyte E6和FACSCantoⅡ流式細胞儀在淋巴細胞亞群檢測中的一致性進行評價。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象 選擇免疫缺陷病、自身免疫病、腫瘤、感染性疾病、器官移植、過敏性疾病等患者及健康體檢者共117例，獲取新鮮抗凝靜脈血樣本。其中男性37例，女性80例，年齡8－84歲，平均年齡50.58±19.39。

1.1.2 材料和方法 按試劑說明書，分別使用深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司（邁瑞）的PerCP－CD45／FITC－CD3／APC－CD4／PE－CD8四色試劑（流式細胞法）、PerCP－CD45／FITC－CD3／APCCD19／PE－CD16＋56四色試劑（流式細胞法）以及BD公司的淋巴細胞亞群檢測試劑盒對外周靜脈血樣本進行處理。處理后的樣本在BriCyte E6和FACSCantoⅡ上分別使用客戶端軟件MRFlow和FACSCantoII Clinical Software進行檢測，獲得CD3＋細胞、CD3＋CD4＋細胞、CD3＋CD8＋細胞、CD3－CD19＋細胞以及CD3－CD16／56＋細胞的百分比和絕對計數(shù)。

1.1.3 統(tǒng)計學分析 對兩臺儀器的結果進行相關分析、線性回歸分析和Bland－Altman分析，計算相關系數(shù)R、回歸方程和偏差。統(tǒng)計分析采用SAS 9.0。

2 結果

2.1 BriCyte E6和FACSCantoⅡ流式細胞儀檢測淋巴細胞亞群的結果圖

MRFlow和FACSCanto Clinical Software均能實現(xiàn)淋巴細胞亞群自動檢測、分析和報告。由于BriCyte E6可以直接測量樣本體積，因此無需在樣本中額外添加參比的熒光微球，即可獲得樣本中細胞的絕對計數(shù)結果（圖1）。相反，F(xiàn)ACSCantoⅡ由于不能測量樣本體積，因此在測定時需要在樣本中添加一定量的熒光微球，然后通過間接計算才能得出絕對計數(shù)結果（圖2）。

圖1 BriCyte E6流式細胞儀檢測淋巴細胞亞群結果圖

圖2 FACSCantoⅡ流式細胞儀檢測淋巴細胞亞群結果圖

2.2 淋巴細胞亞群的百分比

以兩儀器百分比測定結果做線性回歸顯示，兩儀器結果間線性方程的斜率在0.9534－1.0247間，截距在－0.2642～0.6914間，判定系數(shù)（R2）均大于0.96（圖3）。以兩儀器測定結果均值（Average）和差值（Bias）做Bland－Altman分析顯示，儀器測定結果間的差值均值在－1.3692～1.1488，95%一致性界限也在較窄的范圍內（圖4）。

圖3 淋巴細胞亞群百分比（%）的線性回歸圖

圖4 兩種儀器淋巴細胞亞群百分比（%）的Bland－Altman圖

2.3 淋巴細胞亞群絕對計數(shù)

以兩儀器絕對計數(shù)測定結果做線性回歸分析顯示，兩儀器結果間線性方程的斜率在0.9348－0.9856間，截距在－10.9201～15.9736間，判定系數(shù)（R2）均大于0.96（圖5）。以兩儀器測定結果均值（Average）和差值（Bias）做Bland－Altman分析顯示，儀器測定結果間的差值均值在－41.6958～－8.5849，95%一致性界限也在較窄的范圍內（圖6）。

圖5 淋巴細胞亞群絕對計數(shù)（＃）的線性回歸圖

圖6 兩種儀器淋巴細胞亞群絕對計數(shù)（＃）的Bland－Altman圖

3 討論

不同的流式細胞儀在使用不同的試劑進行淋巴細胞亞群分析時，可能會存在較大的偏差，因此臨床上建議實驗室使用同廠配套的試劑系統(tǒng)進行樣本處理［1］。為了減少不同試劑系統(tǒng)對于檢測的影響，本研究在對BriCyte E6和FACSCanto II的一致性評價中也采用了儀器生產(chǎn)商推薦的同廠試劑。從結果可以看出，兩種儀器的淋巴細胞亞群檢測結果間具有較好的線性關系，且結果間的差值也較小，說明兩種儀器在淋巴細胞亞群分析上具有良好的一致性。

在流式細胞儀上進行細胞絕對計數(shù)可以分為雙平臺法和單平臺法。雙平臺法從流式細胞儀上獲得淋巴細胞亞群的百分比，同時從血細胞分析儀獲得淋巴細胞的絕對值，并通過細胞絕對值與百分比的乘積得出各類淋巴細胞亞型的絕對計數(shù)。單平臺法則不用借助血細胞分析儀的結果，僅從流式細胞儀單一平臺上就可以獲得細胞絕對計數(shù)。單平臺法也包括兩種絕對計數(shù)測量方式：一種是流式細胞儀通過直接測量樣本體積，然后以測量細胞數(shù)除以樣本體積就可直接獲得細胞的絕對計數(shù)（如邁瑞、Partec和Merck Millipore的產(chǎn)品）；另一種方式則需要在樣本中添加一定數(shù)量的絕對計數(shù)參比微球，然后通過復雜計算來間接獲得細胞的絕對計數(shù)（如BD和Beckman Coulter的產(chǎn)品）。有研究者曾對這兩種方式的CD3＋CD4＋細胞絕對計數(shù)做過比較，結果表明兩種方式的測定值呈現(xiàn)良好的相關性，測定值間的偏差也較?。?－5］。本研究也顯示，基于體積和基于參比微球的兩種單平臺測量方式，不僅在CD3＋CD4＋細胞檢測上具有較高的相關系數(shù)和較低的偏差，而且在其他淋巴細胞亞群的檢測上也體現(xiàn)了良好的一致性。此外，相對于使用參比微球，直接測量體積的單平臺方法測試成本更低，操作也更為簡單，對于改善國內基層醫(yī)院以及國際上經(jīng)濟發(fā)展落后國家和地區(qū)的診療水平也具有重要意義。

［1］黃春梅，郭 野，陳 倩，等.不同流式細胞分析系統(tǒng)對外周血淋巴細胞亞群分析結果的影響［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2011，34（5）：403.

［2］Dieye TN，Vereecken C，Diallo AA，et al.Absolute CD4T－cell counting in resource－poor settings：direct volumetric measurements versus bead－based clinical flow cytometry instruments［J］.J Acquir Immune Defic Syndr，2005，39（1）：32.

［3］Pattanapanyasat K，Phuang－Ngern Y，Lerdwana S，et al.Evaluation of a single－platform microcapillary flow cytometer for enumeration of absolute CD4＋T－lymphocyte counts in HIV－1infected Thai patients［J］.Cytometry B Clin Cytom，2007，72（5）：387.

［4］Pattanapanyasat K，Phuang－Ngern Y，Sukapirom K，et al.Comparison of 5flow cytometric immunophenotyping systems for absolute CD4＋T－lymphocyte counts in HIV－1－infected patients living in resource－limited settings［J］.J Acquir Immune Defic Syndr，2008，49（4）：339.

［5］Zijenah LS，Kadzirange G，Madzime S，et al.Affordable flow cytometry for enumeration of absolute CD4＋T－lymphocytes to identify subtype C HIV－1infected adults requiring antiretroviral therapy（ART）and monitoring response to ART in a resourcelimited setting［J］.J Transl Med，2006，45：433.

2013－06－27）

1007－4287（2014）07－1196－04

＊通訊作者