云丹，劉曉麗，程樂華，周忠良

華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200241

4－二羥基二苯基丙烷，簡稱雙酚 A(bisphenol A，BPA)，系苯酚衍生物，廣泛用于如聚碳酸脂(polycarbonate，PC)、環(huán)氧樹脂(epoxideresin，EP)等化工產(chǎn)品的制造。研究發(fā)現(xiàn)BPA不僅通過與肝臟雌激素受體結(jié)合誘導(dǎo)雄魚產(chǎn)生卵黃蛋白原［1－2］，也干擾魚類性激素調(diào)節(jié)并影響魚類的性別分化［3－4］，是典型的擬雌激素化學(xué)物。BPA對精巢發(fā)育的影響也有大量的報道，BPA能導(dǎo)致精子數(shù)量減少、活力降低、畸形率增加而損害雄性生殖功能［5－6］，損傷生精細(xì)胞、支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，干擾和阻礙精子的發(fā)育和成熟及對精子有直接毒性［7］。然而，BPA對精巢發(fā)育影響的檢測仍停留在組織病理層面，且關(guān)于BPA調(diào)節(jié)精巢發(fā)育的分子機(jī)制以及精巢結(jié)構(gòu)與分子機(jī)制相結(jié)合的研究不多，BPA對精巢結(jié)構(gòu)影響的機(jī)理還不是很清楚。

魚類與所有其他脊椎動物一樣，其性腺發(fā)育過程受性激素的調(diào)節(jié)和控制。在性激素的合成途徑中，細(xì)胞色素 P450酶起著重要的作用。其中，CYP17基因參與精巢中膽固醇轉(zhuǎn)化為睪酮的過程［8］;CYP11B基因能催化雄魚精巢中的睪酮轉(zhuǎn)化為11－KT;CYP19A基因編碼的細(xì)胞色素P450芳香化酶(CYP19A)控制雄激素轉(zhuǎn)換為雌激素的過程。性腺的活動是受下丘腦和垂體分泌激素的控制，下丘腦釋放的促性腺激素釋放激素(GnRHs)，作用于垂體上的受體，從而控制促性腺激素的合成和釋放，包括黃體化激素(luteinizing hormone，LH)和促卵泡激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)［9］。在雄性動物中，F(xiàn)SH可以通過促卵泡激素受體(FSHR)的介導(dǎo)來刺激精子的發(fā)生并促進(jìn)雄激素的合成［10－13］。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境擬雌激素化學(xué)物壬基酚(NP)可影響斑馬魚精巢性激素合成酶基因的表達(dá)。BPA也是擬雌激素化學(xué)物，但分子結(jié)構(gòu)區(qū)別于NP。BPA對精巢發(fā)育的作用途徑至今不很清楚。本文以模式動物斑馬魚(Danio rerio)為實驗對象，通過不同濃度BPA暴露以及同一濃度不同暴露時間的動力學(xué)實驗，以成魚精巢性激素合成酶基因(相關(guān)P450酶基因)及雌雄激素受體基因、促卵泡激素受體基因為靶點，結(jié)合精巢組織病理學(xué)特征，研究BPA對性激素合成酶基因表達(dá)的影響，并深入研究環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對精子發(fā)育和精巢結(jié)構(gòu)影響的作用途徑。

1 材料與方法(Materials and Methods)

1.1 儀器與試劑

儀器:電動勻漿器(Fluko公司)，PCR儀和CEX96TMReal－Time PCR 儀(Bio－Rad)，UV－VIS7500紫外分光光度計(天美公司)，熒光顯微鏡(Leica，DM4000B)。

試劑:雙酚 A(純度 ＞99%，F(xiàn)luka)，RNAiso Plus試劑(TaKaRa)，Prime Script RT Master Mix Perfect Real Time試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa)。

1.2 實驗材料

實驗魚:斑馬魚(Danio rerio)，體長(2.83±0.16)cm，體重(0.40±0.05)g，為性成熟雄性個體，購于上海銀河熱帶魚養(yǎng)殖場，在實驗室馴養(yǎng)兩周后進(jìn)行暴露實驗，馴養(yǎng)魚用水為曝氣除氯后的自來水。

1.3 實驗設(shè)計

濃度－效應(yīng)實驗:設(shè)置4個BPA試驗濃度組，分別為500、1 000、2 000 和4 000 μg·L－1;每個濃度組設(shè)兩平行，丙酮作為溶劑，試劑對照組丙酮濃度為10 μL·L－1;暴露試驗在5 L的玻璃缸中進(jìn)行，放試液3 L，隨機(jī)放入試驗魚8尾;試驗期間每天喂食3次，換1/3試液，持續(xù)增氧，水體溫度控制在(28±1)℃，光照周期為14 h:10 h(光暗比)，暴露期為21 d。取樣時將斑馬魚置于冰面上，凍僵后取精巢，過液氮，－80℃冰箱保存待用;精巢組織學(xué)研究以Bouin液固定。

時間－效應(yīng)實驗:在濃度－效應(yīng)實驗的基礎(chǔ)上，選取 BPA2000 μg·L－1濃度組進(jìn)行時間－效應(yīng)實驗，暴露期間的實驗方法與濃度－效應(yīng)實驗相同。分別在暴露后第6天、12天、18天、21天進(jìn)行取樣，樣本處理同濃度－效應(yīng)實驗。

1.4 實驗步驟

1.4.1 斑馬魚精巢中相關(guān)基因Real－time PCR測定

取50 mg精巢組織加入1 mL RNAiso Plus提取出總RNA，分光光度儀測出RNA濃度(A260/A280在1.8～2.0范圍內(nèi))，UVP凝膠圖像分析儀上觀察RNA完整性及有無降解情況。之后用Prime Script RT Master Mix Perfect Real Time試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA:根據(jù)每20 μL反應(yīng)體系可最大使用1000 ng RNA，計算出加入RNA的體積，加入5×Prime Script RT Master Mix 4 μL，再加入 RNase Free H2O補(bǔ)足至20 μL，混勻后，放入PCR儀，37℃保持15 min，85℃作用5 s。從Genebank獲得斑馬魚ERβ、FSHR mRNA序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計分析得到特異性引物(上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成)，其他引物引用自文獻(xiàn)，具體見表1。Real－time PCR反應(yīng)體系包括SYBR Premix Ex TaqTM 12.5μL，正向引物和反向引物各 0.5 μL(10 μmol·L－1)，樣品 cDNA模板 1 μL，加入 RNase Free H2O 補(bǔ)足至 25 μL。擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性30 s;95℃ 5 s，60℃ 30 s，40次循環(huán);65℃ 5 s至95℃，在最后1個循環(huán)結(jié)束后做溶解曲線驗證引物特異性。實驗數(shù)據(jù)用2－ΔΔCt方法分析，以β－actin為內(nèi)標(biāo)基因，空白對照組為參照因子進(jìn)行計算。

1.4.2 精巢組織石蠟切片

精巢組織學(xué)研究采用常規(guī)石蠟切片:樣品用Bouin氏液固定24 h，各級乙醇沖洗，脫水，經(jīng)二甲苯透明，浸蠟包埋(溫度不超過58℃)，制成5 μm切片，展片，用2%的明膠涂抹的載玻片撈片，30℃恒溫箱烤片過夜，脫蠟復(fù)水，H.E.染色，脫水，中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察并拍照。

表1 引物的序列、序列號和來源Table 1 Sequence of the primers，accession number of primers and references of the primers

1.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。用單因素ANOVA法分析暴露引起的差異，若差異顯著則用Tukey法比較不同暴露組之間的差異(p＜0.05時即被認(rèn)為差異顯著)，實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果(Results)

2.1 PA暴露對成年斑馬魚精巢CYP17、CYP11B和CYP19A基因表達(dá)的影響

圖1所示的是不同濃度BPA暴露21d后斑馬魚精巢性類固醇合成相關(guān)細(xì)胞色素P450酶類的基因表達(dá)量。從圖1a中可以看出，CYP17 mRNA的表達(dá)量與BPA的濃度存在一定的負(fù)相關(guān)性，隨著BPA濃度的增加，CYP17mRNA的表達(dá)量下降，分別為對照組的(0.84±0.25)、(0.40±0.15)、(0.32±0.16)和(0.01±0.01)倍。與對照相比，BPA濃度大于1 000 μg·L－1的各實驗組，差異顯著(p ＜0.01)。CYP11B mRNA 的表達(dá)量，除 4 000 μg·L－1外，其余各實驗組雖有變化，但與對照組無顯著性差異(圖1b)。4 000 μg·L－1組的 CYP11B mRNA 的平均表達(dá)量為對照組的(5.50±2.19)倍，可能是組內(nèi)個體差異較大，統(tǒng)計處理未能顯示差異。BPA可誘導(dǎo)CYP19AmRNA的表達(dá)量上調(diào)，其中BPA濃度為2 000 μg·L－1時 CYP19AmRNA 的表達(dá)量最高，為對照組的(2.68 ±0.72)倍(p ＜0.05)，在 4 000 μg·L－1有所下降，但仍高于對照(圖1c)。

圖2 所示為暴露在 BPA 2 000 μg·L－1時，不同時間下斑馬魚精巢性類固醇合成相關(guān)細(xì)胞色素P450酶類的表達(dá)量。從圖2a可以看到，在BPA作用下，CYP17 mRNA的表達(dá)是有波動的，在6 d時最低，為對照組的(0.11±0.01)倍，12 d時平均表達(dá)量有所回升，但始終低于對照組(p＜0.01)。CYP11B mRNA的平均表達(dá)量則有一個先降后上升的調(diào)節(jié)過程。12 d時顯著下調(diào)，為對照組的(0.54±0.05)倍(p＜0.01);18 d時回升到對照水平;21 d時略高于對照，差異均不顯著(圖 2b)。BPA 2 000 μg·L－1誘導(dǎo)精巢CYP19A mRNA的表達(dá)有時間效應(yīng)，暴露18 d的樣本中，部分個體出現(xiàn)上調(diào)，21 d時，大部分個體上調(diào)顯著，平均值為對照組的(2.77±0.50)倍，差異顯著(p＜0.01)。

圖1 BPA暴露對斑馬魚精巢性激素合成相關(guān)酶基因表達(dá)的影響(a.CYP17 mRNA的表達(dá)，b.CYP11B mRNA的表達(dá)，c.CYP19A mRNA的表達(dá)，*p＜0.05，＊＊p＜0.01，n=6)Fig.1 Effects of BPA on the expression of steroidogenic genes in testis of zebrafish(a.expression of CYP17 mRNA，b.expression of CYP11B mRNA，c.expression of CYP19A mRNA，*p＜0.05，＊＊p＜0.01，n=6)

圖2 不同暴露時間下BPA對斑馬魚精巢性激素合成相關(guān)酶基因表達(dá)的影響(a.CYP17 mRNA的表達(dá)，b.CYP11B mRNA的表達(dá)，c.CYP19A mRNA的表達(dá)，*p＜0.05，＊＊p＜0.01，n=6)Fig.2 Effects of BPA on the expression of steroidogenic genes in testis of zebrafish under different exposure times(a.expression of CYP17 mRNA，b.expression of CYP11B mRNA，c.expression of CYP19A mRNA，*p＜0.05，＊＊p＜0.01，n=6)

2.2 BPA暴露對成年斑馬魚精巢性激素受體及促卵泡激素受體基因表達(dá)的影響

圖3顯示了暴露于不同濃度BPA21 d后斑馬魚精巢內(nèi)雌激素受體(ERα和ERβ)、雄激素受體(AR)和促卵泡激素受體(FSHR)mRNA的相對表達(dá)量。從圖中可看到，BPA 濃度大于 2 000 μg·L－1時，精巢ERα的表達(dá)量明顯上調(diào)，與對照組相比有顯著性差異(p＜0.05)，對ERβ也有影響，但上調(diào)的量少于ERα(圖 3a，b)。BPA 濃度大于 1 000 μg·L－1個試驗組樣品，精巢AR mRNA的表達(dá)略有上調(diào)(圖3c)，但與對照組差異不顯著。BPA對精巢FSHR mRNA表達(dá)影響的濃度－效應(yīng)曲線呈倒“U”字型(圖3d)。500 μg·L－1組FSHR mRNA表達(dá)量顯著大于對照(p＜0.05);1 000 μg·L－1組最高，為對照組的(6.31 ±1.13)倍;而 2 000 μg·L－1組的表達(dá)量雖明顯大于對照，但低于 1 000 μg·L－1組。濃度 4 000 μg·L－1組中部分個體的表達(dá)量低于對照，其平均表達(dá)量與對照無差異。

圖4 所示為暴露在 BPA2 000 μg·L－1時，不同時間下斑馬魚精巢內(nèi)的ERα mRNA、ERβ mRNA、AR mRNA和FSHR mRNA的表達(dá)量。如圖4a、4b，BPA的暴露時間對ERα mRNA和ERβ mRNA的表達(dá)產(chǎn)生了明顯的累積效應(yīng)，隨著暴露時間的增加，ERα mRNA和ERβ mRNA的表達(dá)量逐漸升高，在18 d時分別為對照組的(1.98±0.87)、(1.32±0.27)倍(p＜0.05)，在21d時分別為(4.36±2.12)倍(p＜0.05)和(2.02±0.47)倍(p＜0.01)。從圖4c可以看出，AR mRNA的表達(dá)量與對照組沒有差異性.圖4 d顯示，F(xiàn)SHR mRNA的表達(dá)量隨著暴露時間的延長而增加，在暴露21 d時，與對照組差異顯著，為對照組的(2.8±0.81)倍(p＜0.05)。

2.3 BPA暴露對成年斑馬魚精巢組織結(jié)構(gòu)的影響

圖5a所示為正常精巢生精小管的結(jié)構(gòu)，在組織切片中可以看到精子(Sp)均勻的分布于管腔中央，緊貼同一生精小管管壁排列緊密的是多個精小囊，每個精小囊中內(nèi)有處于精原細(xì)胞(Sg)、初級精母細(xì)胞(PS)、次級精母細(xì)胞(SS)、精細(xì)胞(St)等不同發(fā)育時期的生殖細(xì)胞。圖5b、5c所示為暴露于BPA引起的斑馬魚精巢組織學(xué)變化。圖5b顯示，暴露于2 000 μg·L－1BPA 引起斑馬魚精巢生精小管內(nèi)非細(xì)胞區(qū)域增加，精子濃縮嚴(yán)重，精原細(xì)胞(Sg)和精母細(xì)胞(PS 和 SS)數(shù)目都有所減少;BPA 4 000 μg·L－1組斑馬魚精巢退化(圖5c)，精小囊破裂，各個時期的細(xì)胞散亂分布在精小管中。

圖3 BPA暴露對斑馬魚精巢性激素受體基因表達(dá)的影響(a.ERα mRNA的表達(dá)，b.ER mRNA的表達(dá)，c.AR mRNA的表達(dá)*p＜0.05，n=6)Fig.3 Effects of BPA on the expression of AR mRNA and ERα mRNA in testis of zebrafish(a.expression of ERα mRNA，b.expression of ERβ mRNA，c.expression of AR mRNA*p＜0.05，n=6)

圖4 不同暴露時間下BPA對斑馬魚精巢性激素受體基因表達(dá)的影響(a.ERα mRNA的表達(dá)，b.ERβ mRNA的表達(dá)，c.AR mRNA的表達(dá)*p＜0.05，n=6)Fig.4 Effects of BPA on the expression of AR mRNA and ERα mRNA in testis of zebrafish under different exposure times(a.expression of ERα mRNA，b.expression of ERβ mRNA，c.expression of AR mRNA*p＜0.05，n=6)

圖5 暴露于BPA對斑馬魚精巢結(jié)構(gòu)的影響(a. 對照;b.2 000 μg·L-1;c.4 000 μg·L-1;Sg 精原細(xì)胞;PS 初級精母細(xì)胞;SS次級精母細(xì)胞;St精細(xì)胞;Sp精子;SC支持細(xì)胞;LC間質(zhì)細(xì)胞;ST生精小管;標(biāo)尺=10μm)Fig.5 The effects of BPA on the testis of zebrafish(a.Control;b.2 000 μg·L－1;c.4 000 μg·L－1;Sg Spermatogonium;PS Primary Spermatocyte;SS Secondary Spermatocyte;St Spermatids;Sp Spermatozoa;SC Sertoli Cells;LC Leydig Cells;ST Seminiferous Tubules;Scale bar=10μm)

3 討論(Discussion)

魚類性腺發(fā)育受到下丘腦－垂體－性腺(HPG)信息通路的調(diào)節(jié)和控制，激素及其受體在信息傳遞中起重要作用，也成為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EDCs)作用的主要靶點［17］。細(xì)胞色素P450系列酶參與了類固醇激素的合成過程。其中，由CYP17基因編碼的細(xì)胞色素 P450 17α－羥化酶(17α－h(huán)ydroxylase)、17，20－裂解酶(17，20－lyase)能參與精巢中膽固醇轉(zhuǎn)化為睪酮的過程，控制著精巢中性激素合成的總量［8］;CYP11B基因編碼的P45011β－羥化酶(P45011β)能催化雄魚精巢中的睪酮轉(zhuǎn)化為11－酮基睪酮(11－KT);P450芳香化酶(P450arom)是調(diào)控脊椎動物體內(nèi)雌激素形成的關(guān)鍵酶，魚類CYP19A基因編碼性腺中的P450arom，主要分布于卵巢［18］，在精巢間質(zhì)細(xì)胞中有少量表達(dá)，調(diào)控原始精原細(xì)胞的增殖［13］。

小鼠研究表明，E2可干擾精巢CYP17 mRNA的表達(dá)，抑制睪酮的合成［19］。在魚類中也存在類似結(jié)果，暴露于 E2和 EE2可導(dǎo)致雄性黑頭呆魚(Pimephalespromelas)CYP17mRNA表達(dá)下調(diào)［20－21］，暴露于 250 μg·L－1壬基酚(NP)的斑馬魚精巢CYP17 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)［14］。本研究結(jié)果顯示，暴露于 1 000 μg·L－1BPA 也可使斑馬魚精巢CYP17 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，且具有顯著的劑量－效應(yīng)關(guān)系?？梢酝茢?，BPA抑制斑馬魚精巢CYP17基因表達(dá)是一種擬雌激素效應(yīng)。BPA對斑馬魚精巢的擬雌激素效應(yīng)還體現(xiàn)在對編碼雌激素受體ER基因，ERα mRNA和ERβ mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)。本研究結(jié)果顯示，BPA 濃度為 2 000 μg·L－1時，斑馬魚精巢ERα mRNA和ERβ mRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)，且存在著明顯的時間累積效應(yīng)。這種現(xiàn)象與 E2［22］及NP［14］暴露結(jié)果是相似的。

11－KT是魚類以及其他脊椎動物維持雄性功能的關(guān)鍵激素，調(diào)節(jié)精原細(xì)胞的減數(shù)分裂［23－24］，以及精子形成等關(guān)鍵步驟［13］。自然條件下隨著精巢的發(fā)育、精子的形成直到排精，血漿11－KT的含量逐步升高［23，25］。有報道稱，青鳉(Oryzias latipes)、斑馬魚精巢中CYP11B mRNA表達(dá)可被外源擬雌激素化合物戊基酚(PP)、NP 抑制［14，26］，并呈現(xiàn)濃度－效應(yīng)關(guān)系。本實驗結(jié)果顯示，BPA暴露21 d時，斑馬魚精巢CYP11B mRNA的表達(dá)不僅沒有被抑制，而最高濃度組(4 000 μg·L－1)的表達(dá)顯著上調(diào)(圖 1b);時間效應(yīng)結(jié)果顯示，暴露在 BPA 2 000 μg·L－1，斑馬魚精巢CYP11B mRNA呈現(xiàn)先抑后升的變化，在12d時該基因表達(dá)顯著下調(diào)，隨后逐步回升，21 d時則高于對照(圖2b)。由此可見，雖然 NP、PP和BPA都是公認(rèn)的環(huán)境擬雌激素化合物，但是在對魚類精巢的作用可能存在不同的途徑。BPA不直接干擾睪酮轉(zhuǎn)化成11－KT的過程。

外源內(nèi)分泌干擾物對魚類CYP19A影響的研究多集中于卵巢，對精巢CYP19A影響報道較少。劉曉麗等［14］報告NP對斑馬魚精巢中CYP19A mRNA影響，125 μg·L－1NP 可使其表達(dá)上調(diào)。Hatef等［2］報告BPA暴露可使金魚(Carassius auratus)精巢雄激素受體以及芳香化酶基因轉(zhuǎn)錄增加，并支持BPA通過抗雄激素和雌激素雙重途徑導(dǎo)致金魚精子數(shù)量減少的觀點。本實驗中結(jié)果支持這個觀點。2 000 μg·L－1BPA 暴露 18 d 時斑馬魚精巢 CYP19A及ER基因表達(dá)明顯增加(圖 2c、4a、4b)，此外，雖然BPA沒有改變 ARmRNA的表達(dá)(圖3c)，但是CYP17 mRNA表達(dá)顯著抑制。因此，可以認(rèn)為BPA對斑馬魚精巢發(fā)育的影響存在雌激素和抗雄激素雙重效應(yīng)，不僅直接作用于雌激素受體，也可能通過提高CYP19A基因表達(dá)促進(jìn)內(nèi)源雌激素的合成，增強(qiáng)雌激素效應(yīng)。

下丘腦－垂體－性腺軸的控制不是單向的，腦垂體通過分泌LH和FSH作用于性腺，而性腺類固醇激素的變化對下丘腦也有反饋作用。實驗結(jié)果顯示，BPA暴露6 d斑馬魚精巢CYP17 mRNA表達(dá)受到明顯抑制，其下游基因CYP11B的抑制發(fā)生在暴露后的12 d左右，其后逐漸回升，精巢中FSHR mRNA的表達(dá)量增加發(fā)生在暴露后的18 d左右(圖4d)。Baudiffier等［27］在研究抗真菌藥物克霉唑?qū)Π唏R魚精巢類固醇合成影響時，發(fā)現(xiàn)斑馬魚垂體的FSH與精巢的FSHR基因表達(dá)都隨之發(fā)生上調(diào)，認(rèn)為克霉唑?qū)е碌木?1－KT合成減少激活了FSH/FSHR通路，引起腦垂體對精巢雄性激素合成的補(bǔ)償調(diào)節(jié)作用。BPA暴露是否也引發(fā)類似的補(bǔ)償機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

Lahnsteiner等［28］認(rèn)為，高劑量的E2可使成熟雄魚精液量下降，精子密度增加，并有可能導(dǎo)致不育。Hatef等［2］認(rèn)為BPA的干擾效應(yīng)使金魚精子數(shù)量減少。本實驗結(jié)果顯示，BPA暴露對斑馬魚成魚精巢組織有傷害。2 000 μg·L－1濃度組斑馬魚精巢組織中精液減少，精子濃縮，生精小管內(nèi)非細(xì)胞區(qū)域增加。類似的現(xiàn)象在NP暴露試驗中也有報道［14］。

綜上所述，BPA對斑馬魚精巢發(fā)育的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)是雙重的。通過誘導(dǎo)ER和CYP19A基因表達(dá)以增加雌激素作用;抑制CYP17基因表達(dá)以干擾雄激素的生成。性激素的紊亂最終可導(dǎo)致斑馬魚精巢發(fā)生組織傷害。性腺雄激素合成的減少有可能啟動下丘腦－垂體－性腺(HPG)軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。通訊作者簡介:周忠良(1957—)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事魚類學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)研究。

［1］黃曄，任華，孫竹筠，等.壬基酚和雙酚A對雄性斑馬魚 (Danio rerio)卵黃蛋白原mRNA的誘導(dǎo)效應(yīng)［J］.生態(tài)毒理學(xué)報，2008，3(3):274－279 Huang Y，Ren H，Sun Z Y，et al.Vitellogenin mRNA expression in male zebrafish(Danio rerio)induced by nonylphenol and bisphenol－A ［J］.Asian Journal of Ecotoxicology，2008，3(3):274－279(in Chinese)

［2］Hatef A，Zare A，Alavi S M，et al.Modulations in androgen and estrogen mediating genes and testicular response in male goldfish exposed to bisphenol A ［J］.Environmental Toxicology and Chemistry，2012，31(9):2069－2077

［3］Rhee J S，Kim R O，Seo J S，et al.Bisphenol A modulates expression of gonadotropin subunit genes in the hermaphroditic fish，Kryptolebias marmoratus ［J］.Comparative Biochemistryand Physiology， PartC，2010，152:456－466

［4］Rhee J S，Kim B M，Lee C J，et al.Bisphenol A modulates expression of sex differentiation genes in the selffertilizing fish，Kryptolebias marmoratus［J］.Aquatic Toxicology，2011，104:218－229

［5］孫延霞，劉基芳.雙酚A對雄性小鼠血清中NO，NOS及睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響［J］.中國實驗診斷學(xué)，2008，12(2):196－198 Sun Y X，Liu J F.The damnification of bisphenol A by liqid peroxide and pathologic change on male mice test［J］.Chinese Journal of Laboratory Diagnosis，2008，12(2):196－198(in Chinese)

［6］呂毅，呂海霞，王洪海，等.雙酚A對雄性仔鼠生殖功能的影響［J］.吉林大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2008，34(4):618－620 Lu Y，Lu H X，Wang H H，et al.Effects of bisphenol－A on reproductive function in young male mice ［J］.Journal of Jilin University:Medicine Edition，2008，34(4):618－620(in Chinese)

［7］Aluru N，Leatherland J F，Vijayan M M.Bisphenol A in oocytes leads to growth suppression and altered stress performance in Juvenile rainbow trout［J］.Plos One，2010，5(5):e10741.1 e10741.10

［8］Schulz R W，Vischer H F，Cavaco J E B，et al.Gonadotropins，their receptors，and the regulation of testicular functions in fish ［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology，2001，129B:407－417

［9］Burns K H，Matzuk M M.Minireview:Genetic models for the study of gonadotropin actions［J］.Endocrinology，2002，143:2823 2835

［10］Garcia－Lopez A，Bogerd J，Granneman J C M，et al.Leydig cells express follicle－stimulating hormone receptors in African catfish［J］.Endocrinology，2009，150:357 －365

［11］Garcia－Lopez A，de Jonge H，Nobrega R H，et al.Studies in zebrafish reveal unusual cellular expression patterns of gonadotropin receptor messenger ribonucleic acids in the testis and unexpected functional differentiation of the gonadotropins ［J］.Endocrinology，2010，151:2349－2360

［12］Ohta T，Miyake H，Miura C，et al.Follicle－stimulating hormone induces spermatogenesis mediated by androgen production in Japanese eel，Anguilla japonica ［J］.Biology of Reproduction，2007，77:970－977

［13］Schulz R W，de Fran?a L R，Lareyre J J，et al.Spermatogenesis in fish ［J］.General and Comparative Endocrinology，2010，165:390－411

［14］劉曉麗，汪奇，賈林芝，等.壬基酚對斑馬魚精巢組織及性激素合成酶基因表達(dá)的影響［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2011，31(11):2523－2529 Liu X L，Wang Q，Jia L Z，et al.Alterations in testicular histology and the mRNAs of enzymes responsible for sex steroid synthesis in the zebrafish Danio rerio exposed to nonyphenol［J］.Acta Scientiae Circumstantiae，2011，31(11):2523－2529(in Chinese)

［15］Shi X，Du Y，Lam P K S，et al.Developmental toxicity and alteration of gene expression in zebrafish embryos exposed to PFOS ［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，2008，230:23－32

［16］Hoffmann J L，Oris J T.Altered gene expression:A mechanism for reproductive toxicity in zebrafish exposed to benzo［a］pyrene ［J］.Aquatic Toxicology，2006，78:332－340

［17］Kallivretaki E，Eggen R，Neuhauss S，et al.Aromatase in zebrafish:A potential target for endocrine disrupting chemicals［J］.Marine Environmental Research，2006，62:S187－S190

［18］Tong S K，Chung B C.Analysis of zebra fish cyp19 promoters［J］.Journal of Steroid Biochemistry ＆ Molecular Biology，2003，86:381－386

［19］Nakamura D C，Yanagiba Y k，Duan Z W，et al.Bisphenol A may cause testosterone reduction by adversely affecting both testis and pituitary systems similar to estradiol［J］.Toxicology Letters，2010，194:16 －25

［20］Filby A L，Thorpe K L，Tyler C R.Multiple molecular effect pathways of an environmental oestrogen in fish［J］.Journal of Molecular Endocrinology，2006，37:121－134

［21］Filby A L，Thorpe K L，Maack G，et al.Gene expression proles revealing the mechanisms of anti－androgenand estrogen－induced feminization in fish ［J］.Aquatic Toxicology，2007，81:219－231

［22］Menuet A，Pellegrini E，Anglade I，et al.Molecular characterization of three estrogen receptor forms in zebrafish:binding characteristics，transactivation properties，and tissue distributions［J］.Biology of Reproduction，2002，66:1881－1892

［23］Miura T，Yamauchi K，Takahashi H，et al.Hormonal induction of all stages of spermatogenesis in vitro in the male Japanese eel(Anguilla japonica)［J］.Physiology/Pharmacology，1991，88:5774－5778

［24］Amer M A，Miura T，Miura C，et al.Involvement of sex steroid hormones in the early stages of spermatogenesis in Japanese huchen(Hucho perryi)［J］.Biology of Reproduction，2001，65:1057－1066

［25］Zhang W L，Zhou L Y，Senthilkumaran B，et al.Molecular cloning of two isoforms of 11β－h(huán)ydroxylase and their expressions in the Nile tilapia，Oreochromis niloticus ［J］.General and Comparative Endocrinology，2010，165:34－41

［26］Yokota H，Abe T，Nakai M，et al.Effects of 4－tertpentylphenol on the gene expression of P450 11betahydroxylase in the gonad of medaka(Oryzias latipes)［J］.Aquatic Toxicology，2005，71(2):121 －132

［27］Baudiffier D，Hinfray N，Vosges M，et al.A critical role of follicle－stimulating hormone(Fsh)in mediating the effect of clotrimazole on testicular steroidogenesis in adult zebrafish［J］.Toxicology，2012，298:30－39

［28］Lahnsteiner F，Berger B，Kletzl M，et al.Effect of 17βestradiol on gamete quality and maturation in two salmonid species［J］.Aquatic Toxicology，2006，79:124 －131