張麗萍 王玉春,2 趙 勇,3 馬雪征 甄 維 胡孔新

（1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 北京 100123；2.河南師范大學(xué)；3.吉林大學(xué)）

1 前言

原子力顯微鏡（Atomic force microscopy，AFM）是一種適合于觀察非導(dǎo)電物質(zhì)的生物力學(xué)工具，具有很高的分辨率，橫向和縱向分辨率分別可達(dá)2-3nm和0.5nm。其突出特點(diǎn)是制樣簡單，不需要染色、固定以及其他復(fù)雜的制樣過程，并可以在液相實(shí)現(xiàn)觀測。因此AFM非常適合進(jìn)行病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)分析，成為近年來病毒形態(tài)學(xué)研究熱點(diǎn)之一。

新布尼亞病毒（SFTSV）屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，是一種有包膜分階段的負(fù)鏈RNA病毒。病毒基因組包括L、M、S三個(gè)片段，分別編碼RNA依賴的RNA聚合酶和包膜糖蛋白G1、G2以及核蛋白。

中國疾控中心病毒病所通過大量的調(diào)查研究，明確SFTSV致病的臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)特征。該病主要發(fā)生在丘陵、山區(qū)，患者以成年農(nóng)民為主，部分患者有被蜱叮咬史。流行期為4-10月，高峰為5-7月，這也是蜱蟲活躍的時(shí)間段。同時(shí)經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室檢測，在200多位患者的血清標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)70%左右有感染史。這些患者來自湖北、河南、山東、江蘇、安徽和遼寧，分布很廣，這也提示SFTSV的傳播范圍可能廣泛。

目前，SFTSV形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究主要依賴于透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM），利用AFM對SFTSV形態(tài)學(xué)方面的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用AFM和TEM兩種方法對SFTSV HB29株進(jìn)行成像分析，獲得TEM圖像的同時(shí)獲得了該病毒的原子力顯微鏡形貌圖和三維圖、相位圖以及各項(xiàng)表征指標(biāo)，以期探討AFM在SFTSV形態(tài)結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 病毒

SFTSV HB29株為中國疾控中心病毒病預(yù)防控制所提供。

2.1.2 儀器

TECNAI12TEM：美國FEI公司；Nano2Scope (R) Ⅲa和catalystAFM：美國Buruker公司。

2.1.3 試劑

左旋多聚賴氨酸：美國sigma公司。

2.2 方法

2.2.1 TEM的制樣和觀測

采用負(fù)染制片技術(shù)處理病毒培養(yǎng)液及鼠源單抗37℃孵育30min處理的病毒培養(yǎng)液，用PBS緩沖液（pH7.2）適當(dāng)稀釋，將載有碳膜的銅網(wǎng)翻扣插入稀釋液中，用濾紙從邊緣吸去多余的液體，1%的磷鎢酸（pH6.8）染色1min，空氣中自然干燥后通過TEM觀察拍照，加速電壓為80kv。該部分工作在中國疾病預(yù)防控制中心病毒病所完成。

2.2.2 AFM樣品制備

1%左旋多聚賴氨酸浸泡直徑15mm的蓋玻片5min后，取出置暗處晾干，取5μL病毒濃縮液，均勻涂于處理好的蓋玻片限定區(qū)域，靜置5min，濾紙吸去樣本表面多余液體，去離子水洗滌3次，3min/次，氮?dú)獯蹈桑缓髮⑸w玻片固定于鐵片上進(jìn)行掃描觀察；5μL病毒濃縮液，均勻涂于處理好的蓋玻片限定區(qū)域，靜置5min，濾紙吸去樣本表面多余液體，加5μL鼠源單抗均勻涂于樣片限定區(qū)域，37℃濕盒孵育30min，濾紙吸去樣本表面多余液體，去離子水洗滌3次，3min/次，氮?dú)獯蹈?，然后將蓋玻片固定于鐵片上進(jìn)行掃描觀察。

2.2.3 AFM成像

SFTSV HB29株的AFM圖像通過Nano2Scope(R) Ⅲa 和catalystAFM控制器，在室溫大氣條件下以Tapping模式采集圖像，圖像采用高度、振幅與相位3種信號輸出，并經(jīng)Nanoscope Image Analysis分析處理軟件進(jìn)行病毒形貌的截面和粗糙度等參數(shù)的測量和分析。

3 結(jié)果

3.1 TEM觀察結(jié)果

從圖1可以看出，本次試驗(yàn)使用的SFTSV HB29株在電子顯微鏡下可以看到病毒粒子的負(fù)染形態(tài)結(jié)構(gòu)：完整粒子呈球形，粒子在PTA負(fù)染液襯托下呈白色外觀，顆粒周圍可見包膜。鼠源單抗處理的病毒顆粒球形（圖2所示），病毒顆粒周圍可見負(fù)染狀態(tài)下暗色的包膜，電鏡狀態(tài)病毒與抗體處理的病毒形貌未見明顯差異。

圖1 SFTSV HB29株TEM的負(fù)染狀態(tài)

圖2 SFTSV HB29株抗體處理后TEM的負(fù)染狀態(tài)

3.2 AFM觀察結(jié)果

3.2.1 AFM觀察到的SFTSV形貌圖

用E型掃描器，所用探針為由硅制成的RTESP探針，其微懸臂的長度為115-135μm，彈性常數(shù)K為20-80N/nm，共振頻率為200-400kHz，針尖曲率半徑為5-10nm，掃描速度為1Hz和2.8Hz；選取不同掃描范圍的SFTSV HB29株病毒AFM圖片，展示病毒形態(tài)和相關(guān)特性。在367nm×367nm和190nm×190nm范圍掃描的圖片中通過形貌圖、振幅圖和相位圖（圖3）可見SFTSV球形顆粒，邊界清晰，形狀規(guī)則，大小80-100nm。鼠源單抗處理后的SFTSV348nm×348nm和172nm×172nm掃描范圍圖片（圖4）中可見，病毒顆粒形狀不規(guī)則，未見規(guī)則球形病毒顆粒，大小100nm左右，可見邊界不平滑銳利邊緣。

3.2.2 AFM觀察到的SFTSV的三維立體分析圖

利用AFM對所獲得的結(jié)果進(jìn)行一系列分析，獲得圖中SFTSV的長度約100nm，階高約30nm，表面平均粗糙度和表面均方粗糙度值分別約為0.420nm和0.342nm。圖5為600nm×600nm AFM結(jié)果三維分析圖，顯示病毒的三維相貌，可見病毒球形，邊界清晰，表面不平，可見起伏。截面分析圖獲得顆粒兩端的表面距離為95.33nm，截面水平距離110.45nm，同時(shí)還獲得病毒顆粒的垂直距離等相關(guān)信息。

圖3 不同掃描范圍下的SFTSV形貌圖

圖4 不同掃描范圍下的抗體處理后的SFTSV形貌圖

圖5 600nm×600nm視野下SFTSV的三維立體分析圖

4 討論

SFTSV屬于布尼亞病毒科，白蛉病毒屬，病毒顆粒呈球形，直徑80-100nm，外有脂質(zhì)包膜，表面有棘突，其基因組為單股負(fù)鏈RNA，包含L、M、S3個(gè)片段[1-3]。SFTSV作為一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，其宿主和傳播途徑尚無定論。中國CDC病毒病所李德新等曾經(jīng)在蜱中檢測到SFTSV核酸[1]，江蘇CDC鮑昌俊等在牛、羊、狗血清中檢測到SFTSV抗體[4]，因此SFTSV為人獸共患病。

1986年，Gbinning等在掃描隧道顯微鏡基礎(chǔ)上發(fā)明了一種力學(xué)顯微鏡－AFM，是SPM 家族的主要成員[5]。AFM的分辨率很高，其橫向分辨率為2nm-3nm，縱向分辨率為0.5nm，可直接用來觀察物質(zhì)的分子或原子，是人類探索微觀世界的理想工具。AFM的工作原理是將探針裝在彈性微懸臂的一端，另一端固定，當(dāng)探針在樣品表面掃描時(shí)，探針與樣品表面原子間的排斥力會使得微懸臂輕微變形，這樣，微懸臂的輕微變形就可以作為探針和樣品間排斥力的直接量度。一束激光經(jīng)微懸臂的背面反射到光電檢測器，可以精確測量微懸臂的微小變形，這樣就實(shí)現(xiàn)了通過檢測樣品與探針之間的原子排斥力來反映樣品表面形貌和其他表面結(jié)構(gòu)。

本研究對制備獲得的SFTSV及經(jīng)抗體處理的SFTSV首先進(jìn)行TEM進(jìn)行觀察，獲得成功后再利用AFM對SFTSV病毒進(jìn)行觀察，并和TEM獲得的病毒形態(tài)進(jìn)行比較。TEM電鏡結(jié)果顯示雖然本研究所用的SFTSV標(biāo)本顆粒分散，但可見到完整的球形病毒粒子，且與抗體處理后的病毒顆粒相比，電鏡下未見明顯差異。用AFM觀察SFTSV獲得了比較理想的相位圖，相位圖比高度圖更清晰的展示了病毒表面的精細(xì)結(jié)構(gòu)，通過190nm×190nm視野下相位圖可見球形病毒粒子，表面粗糙，但未見病毒表面的刺突結(jié)構(gòu)；通過172nm×172nm視野下的相位圖可見經(jīng)抗體處理后的SFTSV表面不規(guī)則起伏，邊界不平滑。對于AFM結(jié)果中未見病毒粒子的典型刺突，推測主要原因可能在于探針針尖有一定的寬度，無法獲得小于針尖寬度的病毒表面顆粒，但是粗糙度等量化指標(biāo)以及相位圖展示的病毒表面結(jié)構(gòu)三維圖從另一個(gè)角度描述了病毒形態(tài)。

5 結(jié)論

本研究利用TEM和AFM相結(jié)合的方法首次成功展示了SFTSVHB29株的三維圖并獲得病毒形貌參數(shù)，為SFTSV的形態(tài)研究提供依據(jù)。作為一種新的病毒形態(tài)學(xué)研究工具，AFM在病毒研究中的應(yīng)用還需要進(jìn)一步完善，相信隨著研究的不斷深入，它將會在病毒形態(tài)學(xué)以及相關(guān)研究中發(fā)揮重要作用。

［1］Yu X J,Liang M F,Zhang S F,et al.Fever with Thrombocytopenia Associated with a Novel Bunyavirus in China[J].The new England journal of medicine,2011,364:1523-1532.

［2］李德新.發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒概述[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2011，25（2）：81-84.

［3］張永振，周敦金，熊衍文，等.中國淮陽山地區(qū)新蜱傳布尼亞病毒引起的出血熱[J].中華流行病學(xué)雜志，2011，32（3）：209-220.

［4］Bao C J,Qi X,Wang H.A novel bunyavirus in China[J].N Engl J Med,2011,365(9):862-863.

［5］Nettikadan S R,Johnson J C,Mosher C,et al.Virus particle detection by solid phase immunocapture and atomic force microscopy[J].Biochem Biophys Res Commun，2003,311(2):540-545.