王一光，林羽，陳方永，楊小平*

(1.溫州市農(nóng)業(yè)局特產(chǎn)站，浙江 溫州 325000；2.浙江省柑橘研究所，浙江 臺州 318020)

楊梅(Myrica rubra Sieb.et Zucc)果實酸甜適中，具有獨特風味[1]。隨著楊梅種植面積的擴大，危害楊梅的病害逐漸增多，嚴重影響了楊梅的產(chǎn)量和品質(zhì)。這些病害主要包括干枯病(Myxosporium corticola Rostr.)、褐斑病(Mycosphaerela myricae Saw.)、赤衣病(Corticim saimonicolor Berk.)、炭疽病(Glomerella mume (Hori)Hemmi)和枝腐病(Valsa coronata (Hoffm)Fr.)等[2–5]。浙江省溫州市瑞安是許多楊梅主栽品種的原產(chǎn)地。近年來，多次發(fā)現(xiàn)楊梅不明原因的枝條枯死，而且施用多菌靈、代森錳鋅等多種殺菌劑均沒有效果。為弄清該地區(qū)楊梅枝條枯萎病病原種類，筆者采用組織分離法對枯死的楊梅枝條進行病原分離，獲得了1種主要真菌分離物HN–01，并進行了鑒定。為有效防治該病，篩選4種殺菌劑進行了室內(nèi)毒力測定。

1 材料與方法

1.1 材 料

從浙江溫州市瑞安楊梅生產(chǎn)基地采集的楊梅枯死枝條。

采用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL。

供試藥劑：430 g/L 戊唑醇水分散劑(WG)和50%咪鮮胺可濕性粉劑(WP)(均為拜耳作物科學公司產(chǎn)品)；80% 代森錳鋅 WP(南通德斯益農(nóng)化工有限公司產(chǎn)品)；50%烯酰嗎啉 WP (河北恒達利農(nóng)藥化工有限公司產(chǎn)品)。

1.2 方 法

1.2.1 枯死枝條的癥狀觀察及保濕培養(yǎng)

觀察楊梅枯死枝條及葉片的病部特征，詳細記錄癥狀特點，用保濕培養(yǎng)法[6]對枯死枝條及葉片進行表面帶菌檢驗。

1.2.2 病原菌的分離和純化

病原物的分離參照文獻[7]和[8]的方法進行。病原物的純化，主要通過切取菌絲段或挑取單孢進行純培養(yǎng)，純化后的菌種轉(zhuǎn)移到PDA斜面培養(yǎng)基上保存。

1.2.3 分離病原菌的鑒定

培養(yǎng)性狀及形態(tài)學觀察，根據(jù)分離真菌在PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長情況和孢子顯微形態(tài)鑒定。

病原菌的分子生物學鑒定，按照文獻[9]的方法進行。

1.2.4 柯赫氏法則驗證

根據(jù)柯赫氏法則，將純化菌株菌絲塊回接至離體的健康楊梅枝條上，脫脂棉保濕，25 ℃恒溫培養(yǎng)，選取出現(xiàn)相同枯死癥狀的枝條進行病原菌的再次分離鑒定。

1.2.5 殺菌劑的室內(nèi)毒力測定

參照文獻[10]方法進行。每種藥劑分別取不同的濃度，在49 mL PDA培養(yǎng)基(55 ℃)中加入1 mL藥劑，分別倒入3個直徑為90 mm的培養(yǎng)皿內(nèi)(3次重復)，靜置30 min后在平板中央放菌餅，于25 ℃下倒置培養(yǎng) 6 d，量取各平板中菌落的直徑，與空白對照比較，計算菌絲生長抑制率[11]和EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊梅枯死枝條癥狀及保濕培養(yǎng)結(jié)果

調(diào)查發(fā)現(xiàn), 楊梅枯死的枝條上有淡褐色圓形病斑，后漸變?yōu)榛尹S色或灰白色。保濕培養(yǎng)后，在枝干和葉片上出現(xiàn)白色絮狀霉層，其上散生粗而稀疏的黑色小點(分生孢子盤)。

2.2 病原菌分離結(jié)果

對8份枯死楊梅枝條樣品，分別采用組織分離法進行分離和純化，得到1種主要病原分離物，編號為菌株HN–01(圖1)。根據(jù)分離物的培養(yǎng)性狀、孢子大小，結(jié)合顯微鏡檢測和分子生物學ITs序列測定結(jié)果，該菌株被鑒定為聚多擬盤多毛孢(Pestalotiopsis sydowiana)。

圖1 菌株HN–01的菌落特征Fig. 1 Colony characteristics of strain HN–01

菌株HN–01的菌落在PDA培養(yǎng)基上生長較快，25 ℃下，6 d能長滿培養(yǎng)皿，呈云紋狀向外擴展，初期至后期均為白色，6 d后，在平板上可見黑色的小顆粒(分生孢子盤)。鏡檢分生孢子呈紡錘形，直或微彎，有4個隔膜，中間有色細胞長 13～16 μm，深橄欖色，上2個細胞琥珀色；兩端細胞無色，頂生2～3根無色刺毛。菌株HN–01測序所得序列全長為582 bp(圖3)。將菌株的ITs序列與BLAST搜索到的相近菌株進行比對分析，并用MEGA3軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。結(jié)果表明，該菌株與聚多擬盤多毛孢(P. sydowiana)及異色擬盤多毛孢(P. versicolor )的ITS序列相似性均達到99%。但P. versicolor的培養(yǎng)特性和分生孢子特征為：在PDA培養(yǎng)基上，菌落白色絮狀；子實體墨汁狀，排列比較稀疏，數(shù)量較少，但顆粒特別大；分生孢子異色，上部2個有色細胞顏色為茶黃褐色或煤煙黑色，下部1個有色細胞顏色為橄欖褐色，大小為15～30 μm[12–14]，與菌株HN–01的特征差異較大，因此，將HN–01菌株鑒定為聚多擬盤多毛孢。

圖2 菌株HN–01的孢子形態(tài)Fig. 2 Spore morphology of strain HN–01

圖3 菌株HN–01的PCR凝膠電泳結(jié)果Fig. 3 Gel electrophoresis of PCR products from strain HN–01

圖4 菌株HN–01的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of strain HN–01

2.3 柯赫氏法則驗證結(jié)果

用純化的菌株回接健康的楊梅枝條，表現(xiàn)出相同的枯死癥狀。從枯死枝條上再分離的菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性與純化菌株一致，鏡檢后觀察到相同形態(tài)特征的分生孢子，故判斷引起浙江臺州市黃巖區(qū)楊梅枝條枯死的病原菌就是聚多擬盤多毛孢。

2.4 殺菌劑的室內(nèi)篩選結(jié)果

室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明，4種藥劑對擬盤多毛孢均有一定的抑制作用，且隨著濃度的增加抑制作用增強，其相關(guān)系數(shù)均在0.95以上(表1)。但不同藥劑之間的抑制作用差異較大，其中50%咪鮮胺WP的抑制作用最強，EC50值為1.21 mg/L；其次是430 g/L戊唑醇WG，EC50值為3.86 mg/L；80%代森錳鋅WP的效果最差。

表1 4種藥劑對擬盤多毛孢的室內(nèi)毒力測定結(jié)果Table 1 Regression equation for toxicity of four kinds of pesticides on P. sydowiana

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