華淺近，祖茂衡，胡琳，莊銀蘋

·實驗研究Experimental research·

轉(zhuǎn)化生長因子β1及其受體與高碘促成纖維細(xì)胞增殖作用的相關(guān)性研究

華淺近，祖茂衡，胡琳，莊銀蘋

目的研究轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）及其受體Ⅰ（TGF-βRⅠ）與高碘促成纖維細(xì)胞增殖作用的相關(guān)性，探索布-加綜合征（BCS）隔膜組織形成機(jī)制。方法實驗分為5組，空白對照組、溶媒組、KI組、TGF-βRⅠ抑制劑（SD-208）組和SD-208和碘化鉀（KI）共同作用組。采用CCK-8法檢測TGF-βRⅠ抑制劑對高碘培養(yǎng)環(huán)境中成纖維細(xì)胞增殖率的影響；采用免疫印跡法檢測不同濃度（0、250、500、1 000、2 000、3 000μg/L）碘離子對成纖維細(xì)胞TGF-β1、TGF-βRⅠ蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果①在1 000μg/L碘培養(yǎng)環(huán)境中，KI與SD-208共同作用組成纖維細(xì)胞增殖率（1.29±0.41）高于SD-208組（0.52±0.10），而低于KI組（1.70±0.03），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。②1 000μg/L和2 000μg/L高碘組成纖維細(xì)胞TGF-β1蛋白相對表達(dá)量高于其他各組（P＜0.05）。各組間成纖維細(xì)胞TGF-βRⅠ蛋白相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論①高碘因素可能通過提高成纖維細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)而促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖；②高碘導(dǎo)致的成纖維細(xì)胞增殖可能與BCS隔膜形成相關(guān)。

布-加綜合征；成纖維細(xì)胞；碘；細(xì)胞因子類；隔膜阻塞

隔膜阻塞型布-加綜合征（Budd-Chiari syndrome，BCS）的特征是下腔靜脈和（或）肝靜脈開口處隔膜形成，而隔膜的形成機(jī)制至今尚未闡明［1］。近年來國內(nèi)流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，BCS高發(fā)區(qū)飲用水碘含量超標(biāo)，其發(fā)病率與水碘含量呈正相關(guān)［2］?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，BCS的隔膜組織主要由成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、膠原纖維等構(gòu)成［3］；一定濃度的高碘培養(yǎng)環(huán)境能促進(jìn)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞增殖［4］。另外，隔膜組織中轉(zhuǎn)化生長因子β受體（transforming growth factor-βreceptor，TGF-βR）表達(dá)明顯高于正常血管壁組織［5］。

本研究在體外高碘環(huán)境中培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，研究高碘促成纖維細(xì)胞增殖作用與TGF-β1、TGF-βRⅠ的相關(guān)性，以探討B(tài)CS隔膜形成的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株培養(yǎng)

HFL1人肺成纖維細(xì)胞（目錄號GNHu28）購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。細(xì)胞培養(yǎng)于Corning培養(yǎng)皿中，使用F12K培養(yǎng)基（美國Sigma公司），加10%胎牛血清（美國Gibco公司）。于37℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，至細(xì)胞貼壁生長匯合即可傳代，選取第5～6代細(xì)胞用于實驗。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況取對數(shù)生長期的成纖維細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后制備成細(xì)胞懸液。用細(xì)胞計數(shù)板作細(xì)胞計數(shù)，測定細(xì)胞密度，再使用培養(yǎng)基稀釋至5×104個/ml。將TGF-βRⅠ抑制劑SD-208（Sigma公司）用二甲基亞砜（DMSO）溶解后再加入雙蒸水配成8.5mg/L工作溶液。將分析純碘化鉀（KI）配制成I-濃度為24 mg/L的工作溶液。將細(xì)胞懸液接種至96孔板中（密度約為5 000個/孔），分為5組：①空白對照組（每孔加入100μl細(xì)胞懸液和20μl F12K培養(yǎng)基），②溶媒組（每孔加入100μl細(xì)胞懸液、19μl F12K培養(yǎng)基和1μl DMSO），③KI組（每孔加入細(xì)胞懸液100μl、F12K培養(yǎng)基15μl和KI 5μl），④SD-208組（每孔加入細(xì)胞懸液100μl、F12K培養(yǎng)基15μl和SD-208 5μl），⑤SD-208和KI共同作用組（聯(lián)合組，每孔加入細(xì)胞懸液100μl、F12K培養(yǎng)基10μl、SD-208 5μl、KI 5μl）。以上各組均作6個復(fù)孔。其中③、⑤組I-終濃度為1 000μg/L，④、⑤組SD-208終濃度為1μmol/L。隨后于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16 h，更換新的F12K培養(yǎng)基，每孔再加入CCK-8工作液10μl，孵育40min。以1個F12K培養(yǎng)基加CCK-8工作液孔作為本底調(diào)零，于450 nmol/L波長處測定各孔吸光度（A）值，間接反映細(xì)胞數(shù)量，各組A值均去除1個最高值和1個最低值。以上實驗重復(fù)3次。1.2.2 Western印跡法檢測TGF-β1、TGF-βRⅠ蛋白表達(dá)取對數(shù)生長期成纖維細(xì)胞1∶6傳代，培養(yǎng)48代后換液，設(shè)空白對照組和高碘組?？瞻讓φ战M直接使用F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)；高碘組在F12K培養(yǎng)基中分別加入碘化鉀，使I-終濃度分別為250、500、1 000、2 000和3 000μg/L，再將細(xì)胞于培養(yǎng)箱中孵育12 h。用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA法測蛋白濃度、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和免疫反應(yīng)。TGF-β1一抗（Abcam公司）以1∶500稀釋，TGF-βRⅠ一抗（Abcam公司）以1∶250稀釋，二抗稀釋比均為1∶1 000。顯色方法為5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/氯化硝基四氮唑藍(lán)（BCIP/NBT）發(fā)色顯色法。以上條帶均以β-actin作為內(nèi)參照。掃描后采用IPP6.0圖像分析軟件對特異性條帶進(jìn)行半定量分析，以TGF-β1/β-acting，TGF-βRⅠ/β-acting的灰度值比值評定TGF-β1及TGF-βRⅠ蛋白表達(dá)水平。以上實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS16.0軟件。檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），多個實驗組與對照組比較采用最小顯著差法（LSD），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同條件影響成纖維細(xì)胞的增殖情況

空白對照組與溶媒組細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；KI組細(xì)胞增殖率明顯高于對照組，SD-208組細(xì)胞增殖率明顯低于對照組，聯(lián)合組細(xì)胞增殖率高于對照組但低于KI組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同條件影響成纖維細(xì)胞的增殖情況（±s）

表1 不同條件影響成纖維細(xì)胞的增殖情況（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05

組別標(biāo)本數(shù)成纖維細(xì)胞增殖率（A值）空白對照組18 1.06±0.13溶媒組18 1.02±0.11 KI組18 1.70±0.03aSD-208組18 0.52±0.10a聯(lián)合組18 1.29±0.41a

2.2 不同濃度I-對TGF-β1、TGF-βRⅠ蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，不同I-濃度組的TGF-βRⅠ蛋白相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；但1 000、2 000μg/L I-濃度組的TGF-β1蛋白相對表達(dá)量明顯提高（P＜0.05），1 000μg/L與2 000μg/L I-濃度組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2，圖1～3。

3 討論

我們曾檢測74例下腔靜脈隔膜阻塞型BCS患者下腔靜脈血液中TGF-β1濃度，發(fā)現(xiàn)明顯高于非BCS患者［6］。結(jié)合已發(fā)現(xiàn)的隔膜組織中TGF-βR表達(dá)明顯高于正常血管壁組織的結(jié)果［5］，我們認(rèn)為TGF-β家族與BCS隔膜形成存在密切關(guān)系。TGF-β是一類促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞因子超家族，是目前公認(rèn)的對纖維化最重要的調(diào)控因子［7］。TGF-β1能促進(jìn)成纖維細(xì)胞過度增殖、分化，繼而促進(jìn)膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在肺間質(zhì)和肺泡間過度積聚［8］。

本研究中使用的SD-208為TGF-βRⅠ激酶抑制劑［9-10］，結(jié)果顯示KI組細(xì)胞增殖率明顯高于對照組，與張海濤等［4］發(fā)現(xiàn)的碘離子濃度≤3 000μg/L具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡作用的結(jié)果相符。本文中SD-208組細(xì)胞增殖率明顯低于對照組，表明成纖維細(xì)胞增殖依賴于TGF-β1和（或）TGF-βRⅠ作用。聯(lián)合組細(xì)胞增殖率低于KI組但仍高于對照組，表明高碘對成纖維細(xì)胞的促增殖作用不僅通過對TGF-β/TGF-βRⅠ途徑刺激而實現(xiàn)，還存在其他作用途徑。我們前期研究高碘促成纖維細(xì)胞增殖作用與堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblastgrowth factor，bFGF）、成纖維細(xì)胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）關(guān)系發(fā)現(xiàn)，高碘因素可通過對FGF/FGFR途徑刺激而促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖［11］。

碘對成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡具有雙向效應(yīng)，較低濃度的碘離子對成纖維細(xì)胞增殖起明顯的促進(jìn)作用，隨著碘離子濃度的升高促進(jìn)作用逐漸消失，碘離子濃度較高時成纖維細(xì)胞增殖活性受到抑制。前期研究中發(fā)現(xiàn)高碘對成纖維細(xì)胞FGFR2蛋白表達(dá)也存在劑量-效應(yīng)關(guān)系［11］。本研究中，Western印跡結(jié)果顯示，I-濃度1 000和2 000μg/L組TGF-β1蛋白表達(dá)明顯提高，表明高碘可通過上調(diào)TGF-β1蛋白表達(dá)量對成纖維細(xì)胞產(chǎn)生促增殖作用，但I(xiàn)-濃度3 000μg/L組的TGF-β1蛋白表達(dá)量低于1 000μg/L和2 000μg/L組，與對照組比較無明顯差異，說明高碘對成纖維細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)的影響也存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。各組中成纖維細(xì)胞TGF-βRⅠ蛋白表達(dá)量比較無明顯差異，表明高碘對成纖維細(xì)胞產(chǎn)生促增殖作用并非通過提高TGF-βRⅠ蛋白表達(dá)量實現(xiàn)。高碘對TGF-βR其他亞型的蛋白表達(dá)是否存在影響還需進(jìn)一步證實。

表2 不同濃度I-對TGF-β1、TGF-βRⅠ蛋白表達(dá)的影響

圖1 TGF-β1、TGF-βRⅠ蛋白在不同中I-濃度中的表達(dá)

圖2 不同I-濃度對TGF-βRI蛋白相對表達(dá)量的影響

圖3 不同I-濃度對TGF-β1蛋白相對表達(dá)量的影響

TGF-β1的過度表達(dá)可強(qiáng)化TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，能夠刺激成纖維細(xì)胞有絲分裂促進(jìn)其增殖，并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞而產(chǎn)生ECM［12］。另一方面，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9等合成，促進(jìn)蛋白酶抑制劑的合成以阻止基質(zhì)降解，并調(diào)節(jié)細(xì)胞表面整合素的表達(dá)，以增強(qiáng)新生基質(zhì)與細(xì)胞的黏附和組合，使新生基質(zhì)得以穩(wěn)定和積聚［13］。TGF-β1的高表達(dá)可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化導(dǎo)致ECM合成和沉積，穩(wěn)定新生基質(zhì)，最終導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)高碘通過提高成纖維細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)量促進(jìn)其增殖，這與BCS隔膜組織檢測到增殖的成纖維細(xì)胞、BCS患者下腔靜脈血液中高濃度TGF-β1結(jié)果相一致。另外，韓新強(qiáng)等［14］發(fā)現(xiàn)下腔靜脈隔膜阻塞型（MOVC）BCS患者下腔靜脈血液中VEGF的含量明顯高于正常人，而TGF-β1在刺激成纖維細(xì)胞增殖同時還能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分泌內(nèi)源性和外源性VEGF［15］。我們推測由于肝靜脈開口處的血流切應(yīng)力、膈肌損傷等因素引起肝靜脈開口處血管壁損傷［16］，而患者血液中高碘因素促進(jìn)損傷處成纖維細(xì)胞FGFR2蛋白表達(dá)量［11］和TGF-β1分泌，并通過細(xì)胞因子間的交互作用促進(jìn)VEGF等表達(dá)提高，進(jìn)而共同促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移。因此，高碘導(dǎo)致的成纖維細(xì)胞增殖可能與隔膜形成存在相關(guān)性。

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The effect of TGF-β1，TGF-βRI and high concentration iod ine in the promotion of fibroblast proliferation：correlation study

HUA Qian-jin，ZU Mao-heng，HU Lin，ZHUANG Yin-ping. Department of Interventional Radiology，the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu Province 22l002，China

ZUMao-heng，E-mail:cjr.zumaoheng@vip.163.com

ObjectiveTo study the relationship between transforming growth factor-β1（TGF-β1），transforming growth factor-βreceptorⅠ（TGF-βRⅠ）and high concentration iodine in promoting fibroblast proliferation so as to explore the pathogenesis of the membranous formation in Budd-Chiari syndrome.M ethods The experiment included five groups：blank control group，solvent group，KI group，TGF-βRⅠinhibitor group（SD-208）and SD-208 plus KI combination group.①Fibroblasts were cultured in high content of iodine and treated with TGF-βRI inhibitor then the fibroblast proliferation activity was determined by CCK-8 assy.②The protein expressions of TGF-β1 and TGF-βRⅠof fibroblasts in different concentrations of iodine（0，250，500，1 000，2 000 and 3 000 ug/L）were determined by Western-blotmethod.Results①When the culture solution was of 1 000 ug/L iodine concentration，the cell proliferation rate of the SD-208 plus KI combination group（A：1.29±0.41）was significantly higher than that of the control group（0.52± 0.10），but significantly lower than that of the KIgroup（1.70±0.03）with P＜0.05.②Fibroblast TGF-β1 protein relative expression levels in the groups with the iodine concentration of 1 000 ug/L and 2 000 ug/L were significantly higher than those of the other groups（P＜0.05）.No significant difference in fibroblast TGF-βRⅠprotein relative expressions existed between each other groups（P＞0.05）.Conclusion①High concentration of iodinemay promote the proliferation of fibroblasts through raising TGF-β1 protein expression.②Theproliferation of fibroblasts caused by high concentration of iodinemay be related to themembranous formation in Budd-Chiarisyndrome.（JIntervent Radiol，2014，23：431-434）

Budd-Chiari syndrome；fibroblast；iodine；cytokine；membranous obstruction

R543.6

B

1008-794X（2014）-05-0431-04

2013-10-22）

（本文編輯：侯虹魯）

江蘇省科技創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化專項基金資助項目（BL2012021）；徐州醫(yī)學(xué)院研究生科技創(chuàng)新工程研究項目（XYLC-1220）

10.3969／j.issn.1008-794X.2014.05.016

221002徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院介入放射科（華淺近、祖茂衡、胡琳）；徐州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像學(xué)院布-加綜合征實驗室（莊銀蘋）

祖茂衡E-mail：cjr.zumaoheng@vip.163.com