沈 欣，趙宗平，李德鳳，宗桂珍，何 偉

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700;2.西安千禾藥業(yè)有限責(zé)任公司，西安 710065)

致康膠囊是由西安千禾藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的中藥制劑，由大黃、黃連、三七、白芷、阿膠、龍骨(煅)、白及、醋沒(méi)藥、海螵蛸、茜草、龍血竭等14味中藥組成，其氣微香、味辛涼、微苦，具有清熱涼血、止血化瘀、生肌定痛的功效，可用于創(chuàng)傷性出血、嘔血、崩漏及便血等。該方是在七厘散、腐盡生肌散等經(jīng)典名方基礎(chǔ)上根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)研究而組成，臨床用于婦科、內(nèi)科、外科各種出血性疾病，均有較好的療效和修復(fù)功能。臨床應(yīng)用表明，本藥具有明顯的止血、促進(jìn)組織修復(fù)、消炎功效。圍繞以上功效，本試驗(yàn)擬以大鼠急性軟組織損傷動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步探討其藥效及作用機(jī)制。

1 目的

觀察致康膠囊口服不同劑量，對(duì)大鼠急性軟組織損傷及外傷致血瘀證是否具有抑制腫脹和消散瘀血作用。

2 材料

2.1 動(dòng)物

SD雄性大鼠75只，SPF級(jí)，體質(zhì)量280～300 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證編號(hào)SCXK(京)2012-0001)。

2.2 飼料

飼料購(gòu)自北京市科澳協(xié)力飼料有限公司(產(chǎn)品許可證號(hào) SCXK(京)2009-0012，產(chǎn)品批號(hào)12093211，生產(chǎn)日期20120909)。

2.3 動(dòng)物飼養(yǎng)

試驗(yàn)期間動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所動(dòng)物房(實(shí)驗(yàn)設(shè)施許可證SYXK(京)2010-0032)。動(dòng)物房為屏障系統(tǒng)，人工光照，12 h明暗周期，溫度控制在20～22℃范圍，相對(duì)濕度為40% ～70%，換氣次數(shù)15次/h。動(dòng)物飼養(yǎng)于塑料大鼠飼養(yǎng)籠，每籠5只，每天更換鼠籠墊料1次。用500 ml塑料飲水瓶盛裝純凈水，供動(dòng)物隨意飲用，每日更換新鮮飲水。

2.4 藥物

致康膠囊由西安千禾藥業(yè)有限責(zé)任公司提供(批號(hào)20120611)，云南白藥由云南白藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)(批號(hào)Z12003，生產(chǎn)日期2012年5月23日，有效期至2017年4月)。

2.5 儀器

卡尺(型號(hào)ELECTRONIC DIGITAL CALLIPER，規(guī)格0～150 mm)，香港豐量國(guó)際集團(tuán)有限公司;旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)儀，北京普力生儀器有限公司(型號(hào)LBY-NW1)。

3 方法

3.1 動(dòng)物分組

取健康SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)均勻分成正常對(duì)照組、擊打模型組、擊打加云南白藥組(200 mg/kg)、擊打加致康膠囊高、中、低(給藥劑量分別為680、340、170 mg/kg)6 組，每組12 只。致康高、中、低劑量相當(dāng)于人臨床用量的11、5.5、2.7倍，人臨床用量以每日3次、每次12粒為標(biāo)準(zhǔn)。相當(dāng)于臨床等效劑量的2、1、0.5倍。試驗(yàn)分2 d做，每組各半。各組于擊打后24 h、47h分別給藥1次。

3.2 造模

預(yù)防給藥1 d，第2天右小腿脫毛，先測(cè)量右小腿中部直徑正常值，給藥組給藥1 h后將動(dòng)物腹臥位固定，右小腿中部外側(cè)對(duì)準(zhǔn)擊打處，以自由落體擊打儀擊打右小腿外側(cè)，擊打高度為10.5 cm，重1013 g，擊打2次。

3.3 觀測(cè)指標(biāo)

3.3.1 軟組織腫脹度及瘀斑面積 擊打后2、24、48 h以卡尺測(cè)量右小腿中部直徑和瘀斑面積(長(zhǎng) ×寬)。

3.3.2 血液流變學(xué)指標(biāo) 于末次給藥后1 h以20%烏拉坦腹腔注射麻醉1 g/kg，由腹主動(dòng)脈取血，枸椽酸鈉(3.8%)抗凝(1∶9)，用于血液流變學(xué)指標(biāo)測(cè)定。

3.3.3 血小板聚集測(cè)定 部分血液1000 r/min，離心10 min制備富血小板血漿(PRP)，取出一定量備用。再將剩余部分血清3000 r/min離心15 min制備貧血小板血漿(PPP)。將PRP與PPP按一定比例混合，用血小板聚集儀將透光度調(diào)至4000左右，此時(shí)血小板數(shù)為3×1012/L，ADP(1∶200)為誘導(dǎo)劑，測(cè)定5 min內(nèi)血小板聚集的最大聚集率。

3.3.4 全血黏度測(cè)定 700 μL全血緩慢加入旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)儀器測(cè)定杯中37℃預(yù)溫1min，測(cè)定10 S－1、50 S－1、200 S－1切變率的全血黏度。

3.3.5 血漿黏度測(cè)定 將200 μL血漿吸入毛細(xì)管中，測(cè)定37℃時(shí)的血漿黏度。

3.3.6 紅細(xì)胞壓積測(cè)定 用微量毛細(xì)管吸入一定時(shí)的血液高速離心機(jī)12000 r/min離心15 min，以專用計(jì)數(shù)板讀出紅細(xì)胞壓積百分?jǐn)?shù)。

3.3.7 血漿纖維蛋白原(FIB)含量測(cè)定 采用Clauss凝固法原理按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法在PRECIL C2000-4血凝儀上測(cè)定。

3.3.8 病理組織學(xué)檢查 將麻醉取血后的動(dòng)物右小腿皮膚、肌肉組織于10%福爾馬林中固定，浸蠟包埋、切片、蘇木素/伊紅染色、光學(xué)樹(shù)脂封片、光學(xué)顯微鏡下觀察、照相。肉眼大體病變程度分級(jí)和顯微鏡下病變分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)同大鼠軟組織損傷實(shí)驗(yàn)。

3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，比較用t檢驗(yàn)，等級(jí)處理用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 致康膠囊對(duì)大鼠急性軟組織損傷的影響

陽(yáng)性藥、致康膠囊3個(gè)劑量組均減輕大鼠急性軟組織損傷腫脹程度和損傷瘀斑面積，作用時(shí)間48 h較為明顯，說(shuō)明本品能明顯減輕急性外傷所致動(dòng)物軟組織損傷程度。

表1 致康膠囊對(duì)大鼠急性軟組織損傷腫脹度的影響(n=12)

表2 致康膠囊對(duì)大鼠急性軟組織損傷瘀斑面積的影響(n=12)

4.2 致康膠囊對(duì)大鼠急性軟組織損傷后血流變的影響

在對(duì)大鼠急性軟組織損傷后血液流變學(xué)5個(gè)指標(biāo)(血小板聚集、全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積、血漿纖維蛋白原)測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，致康膠囊與模型組比較，致康膠囊高劑量血小板聚集、PT均有明顯升高，致康膠囊高、中劑量纖維蛋白、全血黏度明顯升高，均有利于外傷動(dòng)物模型止血和促進(jìn)損傷修復(fù)。

表3 致康膠囊對(duì)大鼠急性軟組織損傷血液流變學(xué)指標(biāo)的影響(s)

表3 致康膠囊對(duì)大鼠急性軟組織損傷血液流變學(xué)指標(biāo)的影響(s)

注:與模型組比較:*P＜0.05

組 別 劑量(mg/kg)動(dòng)物數(shù)(只)紅細(xì)胞壓積(%)全血黏度10 S－1(mPa·s)全血黏200 S－1(mPa·s)血漿黏度(mPa·s)PT(s)纖原含量(g/L)血小板聚集(%)空白對(duì)照組 10 44.68±1.24 6.91±0.45 3.79±0.18 1.00±0.03.03 12.87±0.48 4.70±0.29 52.62± 7.18 13.85±1.08 4.00±0.43 48.22± 5.82模 型 組 12 41.91±1.52 6.56±0.69 3.70±0.20 1.03±0.04 12.88±0.68 4.68±0.45 50.28± 8.87云南白藥組 200 12 41.27±1.93 6.49±0.61 3.65±0.14 1.03±0.03 12.63±0.32 4.98±0.23* 50.49± 8.46致康膠囊組 680 12 41.40±1.91 6.39±0.65 3.91±0.27* 1.03±0.04 13.64±0.85* 4.77±0.35* 58.43± 8.85*340 12 41.86±2.49 7.42±1.34 3.94±0.24* 1.04±0.03 12.82±0.86 4.88±0.41* 59.51±11.52 170 12 41.72±2.35 6.60±0.78 3.69±0.23 1.01±0

4.3 致康膠囊對(duì)大鼠急性軟組織損傷組織病理學(xué)影響

4.3.1 皮膚 空白對(duì)照組動(dòng)物的皮膚各層結(jié)構(gòu)清晰，表皮、真皮及皮下組織未見(jiàn)異常;模型組、云南白藥組及致康膠囊各劑量給藥組真皮及皮下組織內(nèi)可見(jiàn)不同程度的出血、滲出及單個(gè)核炎細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。上述病變模型組、云南白藥組及各劑量給藥組與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;皮膚出血病變致康膠囊高劑量組較模型組有所減輕，其余各給藥組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;皮膚炎癥病變各給藥組與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4.3.2 肌肉 空白對(duì)照組肌肉的肌外膜、肌束膜及肌內(nèi)膜結(jié)構(gòu)清晰，肌纖維未見(jiàn)明顯異常;模型組、云南白藥組及致康膠囊各劑量給藥組肌肉的肌外膜、肌束膜及肌纖維間均有不同程度的出血、滲出和單個(gè)核炎細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肌纖維間距增大，存在不同程度的變性、壞死和巨噬細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。上述病變模型組、云南白藥組及致康膠囊各劑量給藥組與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;肌纖維變性壞死病變?cè)颇习姿幖爸驴的z囊高劑量組有所減輕，其余各組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;肌外膜、肌束膜及肌纖維間出血、滲出病變與模型組比較，致康膠囊高劑量組明顯減輕且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，云南白藥組有所減輕但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;肌纖維炎癥浸潤(rùn)病變，與模型組比較各組均有所減輕。各組的具體病變分級(jí)情況見(jiàn)表4～8，肌肉病變病理見(jiàn)圖1。

表4 致康膠囊對(duì)大鼠皮膚出血病變的影響

表5 致康膠囊對(duì)大鼠皮膚炎癥病變的影響

表6 致康膠囊對(duì)大鼠肌肉變性壞死病變的影響

表7 致康膠囊對(duì)大鼠肌肉出血滲出病變的影響

表8 致康膠囊對(duì)大鼠肌肉炎癥病變的影響

圖1 模型組(皮膚，HE×200)真皮及皮下組織內(nèi)可見(jiàn)大量紅細(xì)胞滲出及輕微單個(gè)核炎細(xì)胞為主的炎性浸潤(rùn)，皮膚附屬毛囊結(jié)構(gòu)正常;圖2 云南白藥組(皮膚，HE×200)真皮及皮下組織內(nèi)可見(jiàn)小片狀紅細(xì)胞滲出及單個(gè)核炎細(xì)胞為主的炎性浸潤(rùn);圖3 致康膠囊(皮膚，HE×200)真皮及皮下組織內(nèi)可見(jiàn)散在少量紅細(xì)胞滲出及輕微的單個(gè)核炎細(xì)胞為主的炎性浸潤(rùn);圖4 模型組(肌肉，HE×200)可見(jiàn)大片肌纖維變性壞死，巨噬細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)及輕微的肌纖維間出血;圖5云南白藥組(肌肉，HE×200)可見(jiàn)片狀肌纖維變性壞死，巨噬細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)及輕微的肌纖維間出血;圖6 致康膠囊(肌肉，HE×200)可見(jiàn)片狀肌纖維變性壞死，巨噬細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)及輕微的肌纖維間出血

5 結(jié)論

軟組織由于機(jī)械性損傷能使組織斷裂或細(xì)胞破裂，擊傷的強(qiáng)弱和持續(xù)時(shí)間的不同引起的后果也不同。本實(shí)驗(yàn)采用直接擊傷的方法造成動(dòng)物軟組織損傷，所選用的打擊勢(shì)能是根據(jù)動(dòng)物的體質(zhì)量確定，擊傷后不久大鼠的傷肢出現(xiàn)腫脹、皮下瘀血及軟組織損傷，局部皮膚、皮下、深部肌組織、小血管受損，嚴(yán)重者可出現(xiàn)肌纖維、膠原纖維的斷裂;毛細(xì)血管破裂、血管壁通透性增加、血管內(nèi)液外滲組織間隙，導(dǎo)致腫脹和組織充血、壞死。同時(shí)血液流變學(xué)各指標(biāo)的改變具有明顯的時(shí)相關(guān)系，即外傷后1 h之內(nèi)為高凝狀態(tài)，外傷后3 h即轉(zhuǎn)入低凝狀態(tài)。本試驗(yàn)表明，致康膠囊對(duì)動(dòng)物傷肢腫脹均有明顯的防治作用，并具有一定的化瘀止血功能，與模型組比較，纖維蛋白原、血小板聚集、PT以及血液黏度的升高都有助于止血，對(duì)機(jī)體軟組織損傷起到明顯的改善和修復(fù)作用。具體表現(xiàn)在對(duì)炎癥組織消腫吸收，以及使凝血狀態(tài)下血流變學(xué)指標(biāo)趨向于正?；癄顟B(tài)，這與我們臨床應(yīng)用所得到結(jié)論是一致的。以上結(jié)果表明，致康膠囊具有以下較明顯的藥理作用:一是消腫生肌作用，可明顯降低模型動(dòng)物軟組織腫脹及損傷程度;二是活血化瘀作用，改善模型動(dòng)物局部組織充血、瘀血狀況，減少出血;三是修復(fù)作用，通過(guò)改善提高局部血液流變以促進(jìn)損傷修復(fù)。

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