董 昀，張 銘△，沙慧芳，楊曉華，金長娟

(1.上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海 200030;2.上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院腫瘤研究所，上海 200030)

肺癌已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類生命健康，確診后5年生存率僅15%左右?；熓侵委煼伟┑闹饕侄沃?，而肺癌細(xì)胞多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的出現(xiàn)大大降低了其療效[1]，能否有效地逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞的MDR已成為影響治療成功的關(guān)鍵因素之一。越來越多的研究表明，中藥逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞MDR具有潛在的優(yōu)勢。中藥七葉靈顆粒是在中醫(yī)辨證論治基礎(chǔ)上研制的抗腫瘤藥物。前期研究表明，中藥七葉靈顆粒組方不僅有抑瘤作用，同時還能減輕化療副作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，升高白細(xì)胞[2～4]。我們將MDR-1基因?qū)胄∈驦ewis肺癌細(xì)胞株(3LL)，建立了能穩(wěn)定表達(dá)P-gP并對泰素、長春生物堿類、鬼臼毒素類藥物具有顯著耐藥性的細(xì)胞株(3LL-MDR-1)[5]。在體外實驗中觀察到，中藥七葉靈顆粒對Lewis肺癌耐藥細(xì)胞株3LL-MDR-1具有逆轉(zhuǎn)作用[6～9]。本研究通過體內(nèi)實驗，利用Lewis肺腺癌細(xì)胞(3LL)和Lewis肺癌耐藥細(xì)胞(3LLMDR-1)構(gòu)建裸小鼠皮下移植瘤模型，探討中藥七葉靈顆粒逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞耐藥的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物 中藥七葉靈顆粒組成:生黃芪30 g，黃精30 g，天花粉30 g，女貞子15 g，靈芝15 g，石見穿30 g，七葉一枝花 20 g，山慈菇 15 g，骨碎補30 g，陳皮9g，由上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院生產(chǎn)(滬衛(wèi)藥劑)。蒸餾水溶解，每毫升含生藥2 g，4℃保存。泰素(Taxol)由施貴寶公司生產(chǎn)，臨時配置為1 mg/ml水溶液。

1.1.2 源細(xì)胞株 Lewis肺癌細(xì)胞(3LL)、Lewis肺癌耐藥細(xì)胞(3LL-MDR-1)為上海市胸科醫(yī)院腫瘤實驗室提供。

1.1.3 實驗動物 BALB/C-nu/nu雄性裸鼠80只，6周齡(16±2)g，飼養(yǎng)于上海市胸科醫(yī)院腫瘤實驗室實驗中心SPF級動物房，室溫25℃，濕度70%，自由進(jìn)食與飲水。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇后的Lewis肺癌細(xì)胞(3LL)和Lewis肺癌耐藥細(xì)胞(3LL-MDR-1)用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃ 5%CO2飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)。傳代時，用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞按1∶3比例傳代。

1.2.2 建立裸小鼠皮下移植瘤模型 將3LL和3LL-MDR-1細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后，胰酶消化收集細(xì)胞。PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞濃度為10×106/0.1ml，注射于裸鼠右腋部皮下。

1.2.3 動物分組及給藥 造模后的動物按隨機數(shù)字表法分為模型組、七葉靈組、化療組和七葉靈+化療組，每類細(xì)胞株4組，每組10只。2周后觀察到裸鼠皮下有結(jié)節(jié)長出后即開始給藥，給藥劑量根據(jù)人數(shù)體表面積折合法計算。再將每組裸鼠隨機分為A組和B組。A組給藥時間為14 d，B組給藥時間為28 d。

①模型組:生理鹽水0.3 ml每日灌胃1次;A組14 d，B組28 d;②七葉靈顆粒組:七葉靈顆粒0.3 ml(含生藥0.6 g)每日灌胃1次;A組14 d，B組28 d;③化療組:第 1、3、5 天 Taxel溶液 0.5 ml(含Taxel 0.5 mg)腹腔注射，生理鹽水0.3 ml每日灌胃1次;A組14 d，B組28 d;④七葉靈顆粒+化療組:第1、3、5 天 Taxel溶液 0.5 ml(含 Taxel 0.5 mg)腹腔注射，七葉靈顆粒0.3 ml(含生藥0.6 g)每日灌胃1次;A組14 d，B組28 d。

1.2.4 標(biāo)本制備 實驗各組停藥后第2天，即第15天、第29天脫頸椎處死荷瘤裸鼠，剝離瘤塊、剔除筋膜，置于凍存管內(nèi)，迅速放入液氮中保存。

1.2.5 各組瘤重和腫瘤抑制率 各組瘤重用電子天平稱重;抑瘤率按下列公式計算:抑瘤率(%)=(模型組平均瘤重－實驗組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

1.2.6 Real-time Quantitative PCR檢測腫瘤細(xì)胞中耐藥相關(guān)基因MDR-1、MRP、LRP的mRNA表達(dá) 根據(jù)試劑盒的操作順序，Total RNA提取和鑒定后合成cDNA。PCR反應(yīng)各個基因的引物序列及分析條件見下表?；靹蚝蠓殖?份，每個樣品做3個重復(fù)對照。上機擴(kuò)增檢測。在PCR任意循環(huán)中，當(dāng)熒光強度值大于由儀器自帶軟件計算出的閾值(threshold value，CT)時，樣本被認(rèn)為陽性，mRNA 表達(dá)量用2-△CT表示(2-△CT即比值，△CT由CT值減去GAPDH的CT值)，實驗重復(fù)測量3次，取比率的平均值作為最后表達(dá)水平。引物序列如下:MDR-1:sense:5'-CTTCACCCAGGCCATGATGT-3'，anti-sense:5'-GGCACCA AA GA CA ACAGCAG-3';MRP:sense:5'-GCGCTGTCTATCGTAAGGCT-3'，anti-sense:5'-AGAGGGGCTGACCAGATCAT-3';LRP:sense:5'-GTATCCCC ATGAGC TGGACG-3'，anti-sense:5'-GCAGAACTTGTTGCAGTGGG-3';GAPDH:sense:5'-GGCAAATTCAACGGCACAGT-3'，anti-sense:5'-GTCTCG CTCCTGG AAG ATGG-3'。

表1 3LL模型各組裸鼠皮下移植瘤瘤重及抑瘤率(s)

表1 3LL模型各組裸鼠皮下移植瘤瘤重及抑瘤率(s)

注:與模型組比較:*P＜0.05;與七葉靈顆粒組比較:△P＜0.05

組別A組(14 d)B組(28 d)例數(shù) 瘤重(g)抑瘤率(%)例數(shù) 瘤重(g)抑瘤率(%)模型組53.3

1.2.7 Western-blot檢測瘤細(xì)胞中耐藥相關(guān)基因MDR-1、MRP、LRP的蛋白表達(dá) 蛋白質(zhì)抽提和濃度測定A562，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度。將準(zhǔn)備好的樣品和蛋白質(zhì)marker分別上樣、電泳。取出凝膠，去除所有濃縮膠，將凝膠浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中5 min。準(zhǔn)備好膜后，將膜置于反應(yīng)盒中(印跡蛋白的一面朝上)，加0.5 ml麗春紅染色30 s，觀察轉(zhuǎn)印效果。去除染液，雙蒸水洗膜3次，每次5 min。在TBST中加入脫脂奶粉至終濃度為5%(w/v)，封閉時，將膜浸入到封閉液中，室溫下振蕩1 h。加入稀釋好的一抗抗體(1∶500)，4℃過夜。TBST洗膜3次(每次5 min)。加入稀釋好的二抗抗體(1∶5000)，室溫1 h振蕩孵育。TBST洗膜3次(每次5 min)。洗好膜以后，取出ECL發(fā)光試劑，取A液和B液各1ml混合。將膜放入曝光儀器中，滴加發(fā)光液，曝光3次，每次5 min，選擇3次曝光的重疊值。同時以各個細(xì)胞蛋白中GAPDH作為內(nèi)參照，通過與內(nèi)參照的比較確定MDR-1、MRP、LRP相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以方差分析檢驗各組均數(shù)間的差異性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 七葉靈顆粒對裸鼠皮下移植瘤生長影響

3LL皮下移植瘤模型中，A組(14 d后):七葉靈顆粒組、化療組、七葉靈顆粒+化療組瘤重均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中七葉靈顆粒+化療組瘤重最小，抑瘤率為34.5%;B組(28 d后):七葉靈顆粒組、化療組、七葉靈顆粒+化療組瘤重也均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中七葉靈顆粒+化療組瘤重最小，抑瘤率為53.3%。

表1、2顯示，3LL-MDR-1皮下移植瘤模型中，A組(14 d后):七葉靈顆粒組、化療組、七葉靈顆粒+化療組瘤重均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中七葉靈顆粒+化療組瘤重最小，抑瘤率為34.8%;B組(28 d后):七葉靈顆粒組、化療組、七葉靈顆粒+化療組瘤重也均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中七葉靈顆粒+化療組瘤重最小，抑瘤率為23.7%。

表2 3LL-MDR-1模型各組裸鼠皮下移植瘤瘤重及抑瘤率(s)

表2 3LL-MDR-1模型各組裸鼠皮下移植瘤瘤重及抑瘤率(s)

注:與模型組比較:*P＜0.05;與七葉靈顆粒組比較:△P＜0.05

組別A組(14 d)B組(28 d)例數(shù) 瘤重(g)抑瘤率(%)例數(shù) 瘤重(g)抑瘤率(%)模型組23.7

2.2 七葉靈顆粒對3LL模型中耐藥相關(guān)基因MDR-1、MRP和LRP表達(dá)的影響

A組(14 d后):七葉靈顆粒組的MDR-1、MRP、LRP基因mRNA表達(dá)水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為P＜0.01、P＜0.001和P＜0.001);化療組的MDR-1、MRP、LRP基因 mRNA表達(dá)水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均為P＜0.001);七葉靈顆粒 +化療組的 MDR-1、MRP、LRP基因mRNA表達(dá)水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均為P＜0.001);七葉靈顆粒組、化療組、七葉靈顆粒+化療組的MDR-1、MRP、LRP蛋白表達(dá)與模型組比較均下調(diào)。

B組(28 d后):七葉靈顆粒組的MDR-1、MRP、LRP基因mRNA表達(dá)水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均為P＜0.001);化療組的MDR-1、MRP、LRP基因mRNA表達(dá)水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001、P＜0.01和P＜0.05);七葉靈顆粒 +化療組的 MDR-1、MRP、LRP基因mRNA表達(dá)水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均為P＜0.001);七葉靈顆粒組、化療組、七葉靈顆粒+化療組的MDR-1、MRP、LRP蛋白表達(dá)與模型組比較均下調(diào)(圖1、圖2)。

圖1 不同干預(yù)對3LL模型MDR-1、MRP、LRP基因mRNA表達(dá)的影響

2.3 七葉靈顆粒對3LL-MDR-1模型中耐藥相關(guān)基因MDR-1、MRP和LRP表達(dá)的影響

圖2 不同干預(yù)對3LL模型MDR-1、MRP和LRP基因蛋白表達(dá)的影響

A組(14 d后):七葉靈顆粒組和七葉靈顆粒+化療組的MDR-1基因mRNA表達(dá)水平明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);化療組的MDR-1基因mRNA表達(dá)水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。七葉靈顆粒+化療組的MRP基因mRNA表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);化療組的MRP基因mRNA表達(dá)高于生理鹽水，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，七葉靈顆粒組的MRP基因mRNA表達(dá)水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。七葉靈顆粒+化療組的LRP基因mRNA表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);七葉靈顆粒組和化療組的 LRP基因mRNA表達(dá)水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，各組蛋白表達(dá)水平的變化與mRNA表達(dá)水平變化相一致。

B組(28 d后):七葉靈顆粒組和七葉靈顆粒+化療組的MDR-1基因mRNA表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01和P＜0.001);化療組的MDR-1基因mRNA表達(dá)水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);七葉靈顆粒組和七葉靈顆粒+化療組的MRP基因mRNA表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05和P＜0.001);化療組的MRP基因mRNA表達(dá)水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);七葉靈顆粒+化療組的LRP基因mRNA表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);七葉靈顆粒組和化療組的LRP基因mRNA表達(dá)水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，各組蛋白表達(dá)水平的變化與mRNA表達(dá)水平變化相一致(圖3、圖4)。

3 討論

腫瘤的多藥耐藥(MDR)已成為影響腫瘤化療成功與否的關(guān)鍵因素[10]。MDR的形成機制非常復(fù)雜。目前研究報道顯示，MDR可能與P糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)的表達(dá)及活性改變有關(guān)[11～14]。同一腫瘤細(xì)胞 MDR可能由其中幾種機制共同介導(dǎo)，而化學(xué)逆轉(zhuǎn)劑往往只能針對其中一種機制進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，因而逆轉(zhuǎn)效率不高[15];而中藥復(fù)方制劑作為耐藥性腫瘤逆轉(zhuǎn)劑，具備成本低、毒性小、安全范圍大、廣譜性強、作用靶點多等諸多優(yōu)勢，還可減輕放化療的不良反應(yīng)[16]，耐藥性腫瘤逆轉(zhuǎn)劑的研究正越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

圖3 不同干預(yù)對3LL-MDR-1模型MDR-1、MRP、LRP基因mRNA表達(dá)的影響

圖4 不同干預(yù)對3LL-MDR-1模型MDR-1、MRP、LRP基因蛋白表達(dá)的影響

中藥七葉靈顆粒是在中醫(yī)辨證論治基礎(chǔ)上研制的抗腫瘤藥物，其組方不僅有抑瘤作用，同時還能減輕化療副作用，增加腫瘤細(xì)胞凋亡，升高白細(xì)胞[2]。七葉靈顆粒由生黃芪、黃精、天花粉、女貞子、靈芝、石見穿、七葉一枝花、山慈菇、骨碎補、陳皮組成。方中黃芪性味甘溫，善補腎氣?！包S芪……補諸虛不足……益元氣(為腎所藏)”;黃精性味平和，擅長填精，補諸虛……填精髓，“兩者共為君藥;女貞子滋陰養(yǎng)血，天花粉養(yǎng)陰生津，骨碎補強髓堅骨，三藥并用增強生黃芪、黃精之力，同為臣藥;石見穿、七葉一枝花、山慈菇清熱消腫、軟堅散結(jié)、驅(qū)邪扶正為佐藥;陳皮理氣、健脾、燥濕化痰、調(diào)和諸藥為使藥。諸藥共奏補腎填精生髓之功。該藥已在臨床使用10余年，療效可靠，已開展和完成了多項研究，臨床研究顯示其具有良好的抗腫瘤效果，可提高晚期肺癌的生存率、中位生存期、近期療效及生活質(zhì)量[3，4]。

前期體外研究發(fā)現(xiàn)，中藥七葉靈顆粒對Lewis肺癌耐藥細(xì)胞株 3LL-MDR-1 具有逆轉(zhuǎn)作用[6～9]。本研究利用3LL和3LL-MDR-1細(xì)胞株制備裸小鼠皮下移植瘤模型，通過體內(nèi)實驗，進(jìn)一步研究中藥七葉靈顆粒逆轉(zhuǎn)3LL-MDR-1細(xì)胞的多藥耐藥機制。

隨著實驗的進(jìn)展我們觀察到，裸鼠皮下出現(xiàn)結(jié)節(jié)，逐漸增大，甚者出現(xiàn)壞死，并可觀察到裸鼠出現(xiàn)進(jìn)食減少、消瘦、行動遲緩、喜扎堆、活動減少等，符合惡性腫瘤晚期的臨床表現(xiàn)，尤以模型組更甚。本研究結(jié)果顯示，在3LL模型中，藥物干預(yù)各組皮下移植瘤的質(zhì)量、大小明顯小于模型組，抑瘤率尤以七葉靈顆粒+化療組最大，并隨著時間的增加，抑瘤率隨之增加。在3LL-MDR-1模型中，藥物干預(yù)各組的皮下移植瘤質(zhì)量、大小明顯小于模型組，抑瘤率尤以七葉靈顆粒+化療組最大。由此說明，七葉靈顆?？梢杂行У匾种颇[瘤生長，并可有效地配合化療藥物，對抑制腫瘤生長有協(xié)同作用;在腫瘤耐藥的情況下，同樣能夠協(xié)同化療藥物起到抑制腫瘤生長的作用。

腫瘤的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是指腫瘤細(xì)胞對分子結(jié)構(gòu)不同、作用機制各異的抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥，是目前所知腫瘤化療失敗的最重要原因[17]。目前研究證實，多數(shù)腫瘤多藥耐藥的發(fā)生是通過多藥耐藥基因(multidrug resistance 1，MDR1)和多藥耐藥相關(guān)蛋白基因(multidrug resistance-associated protein，MRP)以及肺耐藥蛋白基因(lung resistance protein，LRP)編碼的相應(yīng)蛋白，利用藥泵作用將藥物排出腫瘤細(xì)胞外或者改變藥物在細(xì)胞內(nèi)分布而導(dǎo)致耐藥[18]。這3個耐藥基因的過度表達(dá)是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的主要原因，而MDR1的過度表達(dá)則被認(rèn)為是腫瘤多藥耐藥的最重要機制[19，20]。MDR1是具有能量依賴性藥泵功能的跨膜糖蛋白，可主動將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的抗癌藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度并產(chǎn)生耐藥[21]。MRP基因編碼表達(dá)ATP能量依賴性跨膜糖蛋白泵分子Pgp-190，該蛋白能將疏水性化療藥物逆濃度差泵出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積，導(dǎo)致耐藥發(fā)生。LRP為人的彎隆體主蛋白(MVP)，通過調(diào)節(jié)囊泡和核質(zhì)的藥物轉(zhuǎn)運，將化療藥物儲存于囊泡并減少其在核與胞質(zhì)間的比例而致耐藥。

在本實驗研究的3LL模型中，藥物干預(yù)各組的MDR-1、MRP、LRP呈明顯下調(diào)，并與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。且隨著藥物干預(yù)時間的增加，七葉靈顆粒組和七葉靈顆粒 +化療組的 MDR-1、MRP、LRP基因表達(dá)水平表現(xiàn)出降低趨勢，說明七葉靈顆粒組和七葉靈顆粒+化療組能有效降低多藥耐藥相關(guān)基因的表達(dá)，防止腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的產(chǎn)生。而化療組的MDR-1、MRP、LRP基因表達(dá)水平呈逐漸升高趨勢，說明隨著時間的增長，腫瘤細(xì)胞逐漸對化療產(chǎn)生耐藥性，這也是3LL-MDR-1細(xì)胞株產(chǎn)生的基本原理[8，10]。

在3LL-MDR-1模型中，化療組 MDR-1、MRP、LRP基因mRNA及蛋白呈高表達(dá)狀態(tài)，并隨著治療時間的增加呈逐漸升高趨勢，說明3LL-MDR-1耐藥細(xì)胞株存在明顯的耐藥性，并隨著化療時間的增加耐藥性更加明顯，這也與臨床上化療時間越長，腫瘤細(xì)胞越易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象相符。治療28 d后，七葉靈顆粒組和七葉靈顆粒+化療組中MDR-1基因和MRP基因的表達(dá)明顯較模型組下降，且相較于14 d出現(xiàn)明顯下調(diào)，尤以七葉靈顆粒+化療組最為明顯。LRP基因較模型組也出現(xiàn)下調(diào)，但未見其隨著時間出現(xiàn)明顯的變化，說明七葉靈顆粒能下調(diào)耐藥相關(guān)基因表達(dá)，并隨著用藥時間的增長，其作用愈加明顯。配合化療藥使用后，其抑制腫瘤及下調(diào)耐藥相關(guān)基因表達(dá)的作用更加明顯，進(jìn)一步說明七葉靈顆粒具有逆轉(zhuǎn)化療耐藥、對化療藥物有增敏協(xié)同的作用。

本研究結(jié)果表明，中藥七葉靈顆?？赡孓D(zhuǎn)3LLMDR-1細(xì)胞的多藥耐藥，其作用機制可能與下調(diào)多藥耐藥相關(guān)基因MDR-1、MRP和LRP的表達(dá)有關(guān)。臨床上應(yīng)用中藥七葉靈顆粒結(jié)合化療治療可能抑制化療藥物的多藥耐藥，從而提高化療療效。

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