王 朋，楊明會(huì)，李紹旦，霍 旺，劉 毅，張俊修

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100700;2.解放軍總醫(yī)院中醫(yī)研究所，北京 100853)

冠心病心絞痛是臨床常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重威脅人群健康。據(jù)臨床流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，寒凝血瘀證是本病的常見多發(fā)證型，給患者帶來極大的痛苦[1]，因此開展冠心病心絞痛寒凝血瘀證的基礎(chǔ)研究，具有臨床現(xiàn)實(shí)意義。本研究擬采用垂體后葉素單一因素大劑量靜脈注射的方法，建立冠心病心絞痛寒凝血瘀證病證結(jié)合模型，并對該模型從宏觀體征、心電圖、心肌微循環(huán)等方面進(jìn)行觀測，以綜合評價(jià)該模型的證候?qū)傩浴?/p>

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

垂體后葉素注射液pit(6 U/ml，南京新百藥業(yè)有限公司，批號111204)，烏拉坦(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號T20111110)，TXB2放射免疫試劑盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司，批號20121025)，6-Keto-PGF1α放射免疫試劑盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司，批號20121025)。

MP-100多導(dǎo)生理記錄儀(美國BIOPAC公司)，MC-142L歐姆龍電子體溫計(jì)(歐姆龍大連有限公司)，ALC-V8動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)，BX51WI正立微循環(huán)顯微鏡(Olympus公司)，SN-697B自動(dòng)γ放射免疫計(jì)數(shù)器(上海原子核研究所日環(huán)儀器廠)，1-15k離心機(jī)(德國Sigma公司)。

1.2 動(dòng)物與分組

健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量220±20 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號SCXK-(軍)2007-004)。將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，即正常組和模型組，每組20只。

1.3 造模方法

大鼠用20%烏拉坦5 ml/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉，仰臥位固定于鼠臺(tái)上，連接生理記錄儀，記錄大鼠標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。大鼠經(jīng)口氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)。解剖并分離出股靜脈進(jìn)行靜脈置管。準(zhǔn)備完畢后，模型組注入垂體后葉素 6 U/kg[2](濃度為2 U/ml)，5 s恒速注射完畢，正常組注射等量生理鹽水，在造模后30 min按照下述方法觀測各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 體溫 將電子體溫計(jì)插入大鼠肛門約2 cm處，直到電子體溫計(jì)數(shù)值穩(wěn)定，讀取屏幕數(shù)據(jù)。

1.4.2 心電圖指標(biāo) 記錄造模后30 min內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，以QRS波群的終點(diǎn)與ST段交接處的J點(diǎn)位移判斷心肌缺血發(fā)生與否，并以PR段為基線記錄J點(diǎn)位移，以J點(diǎn)上升或下降≥0.1 mV視為發(fā)生心肌缺血心絞痛[3]，同時(shí)記錄大鼠心率變化。

1.4.3 微靜脈管徑及紅細(xì)胞流速 大鼠取平臥位開胸暴露心臟，置于正立顯微鏡載物臺(tái)上，在外落射光源照明下，觀察心肌微循環(huán)變化。打開連接在顯微鏡上的高速攝像機(jī)以500 F/s的速度記錄心肌表面的微循環(huán)動(dòng)態(tài)圖像，再以25F/s的速度重放高速記錄的圖像。將視頻資料轉(zhuǎn)化為圖像文件，采用Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件測定微靜脈管徑和紅細(xì)胞流速，以造模前的數(shù)值作為基準(zhǔn)值，結(jié)果用各時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值與基準(zhǔn)值比值來表示[4]。

1.4.4 血漿 TXB2、6-Keto-PGF1α腹主動(dòng)脈采血3ml注入EP管，預(yù)先加入消炎痛-EDTA.Na2液0.2 ml，顛倒混勻，4℃3500 rpm離心15 min，分離血漿，放射免疫法測定TXA2、PGI2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物TXB2、6-Keto-PGF1α，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)分析，定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體征

正常組大鼠唇周、爪子、耳殼、尾巴顏色淡紅，溫度正常，大便成形;模型組大鼠唇周、爪子顏色紫暗，爪溫下降，耳殼、尾巴變白發(fā)涼，大便濕爛，其中有2只大鼠造模后有大量粉紅色泡沫樣液體從鼻腔內(nèi)流出，繼而死亡。

2.2 體溫

表1顯示，與正常組比較，模型組大鼠體溫在造模前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，造模后體溫降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 心電圖

表2顯示，與正常組比較，模型組大鼠J點(diǎn)在造模前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，在造模后J點(diǎn)位移顯著增加(P＜0.05)。模型組大鼠造模后心率減慢，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 大鼠造模前后體溫測定比較(s)

表1 大鼠造模前后體溫測定比較(s)

注:與正常組比較:*P ＜0.05

組 別 例數(shù) 造模前(℃)造模后(℃)10 36.78±0.53 36.72±0.81模型組 10 36.89±0.66 35.88±0.74正常組*

表2 大鼠造模前后心電圖變化比較(s)

表2 大鼠造模前后心電圖變化比較(s)

注:與正常組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組心率(次/分)別 例數(shù) J點(diǎn)位移(mv)造模前 造模后 造模前 造模后正常組10 0.033±0.013 0.031±0.015 438±52 440±56模型組 10 0.036±0.017 0.178±0.029*441±55 352±40＊＊

2.4 大鼠造模前后微靜脈管徑和紅細(xì)胞流速變化比較

表3顯示，與正常組比較，模型組大鼠心肌微靜脈收縮，管徑明顯減小，紅細(xì)胞流速減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 大鼠造模前后微靜脈管徑和紅細(xì)胞流速變化比較(s)

表3 大鼠造模前后微靜脈管徑和紅細(xì)胞流速變化比較(s)

注:與正常組比較:*P ＜0.05

組例數(shù) 管徑 流速正常組別10 1.00 1.00模型組 10 0.90±0.07* 0.89±0.05*

2.5 大鼠造模后血漿TXB2、6-Keto-PGF1α變化比較

表4顯示，與正常組比較模型組血漿TXB2水平顯著升高，6-Keto-PGF1α水平降低，TXB2/6-Keto-PGF1α值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P ＜0.01)。

表4 大鼠造模后血漿TXB2、6-Keto-PGF1α變化比較(s)

表4 大鼠造模后血漿TXB2、6-Keto-PGF1α變化比較(s)

注:與正常組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別例數(shù)TXB2(pmol/L)6-Keto-PGF1α(pmol/L)TXB2/6-Keto-PGF1α 10 117.9±24.14 414.80±61.00 0.29±0.06模型組 8 236.9±41.32＊＊ 312.54±55.37* 0.75±0.13正常組＊＊

3 討論

證候的研究是中醫(yī)理論和臨床研究的核心與關(guān)鍵問題。由于證候多依附于某種疾病，二者緊密聯(lián)系，因此在辨證論治的同時(shí)也需要進(jìn)行辨病，即辨病辨證相結(jié)合。證候動(dòng)物模型是研究中醫(yī)證候本質(zhì)與規(guī)律的重要工具，其中的病證結(jié)合模型便是辨病與辨證相結(jié)合方法在證候動(dòng)物模型上的具體體現(xiàn)。由于其同時(shí)具有西醫(yī)疾病的特點(diǎn)和中醫(yī)證候的特征，符合臨床實(shí)際，因此在中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究中得到廣泛的認(rèn)可和推廣[5]。

目前病證結(jié)合模型多是根據(jù)西醫(yī)理論塑造疾病模型，根據(jù)中醫(yī)理論施加人為干預(yù)因素塑造證候模型，再把二者結(jié)合起來，利用這種疊加方法建立的模型病與證干預(yù)因素相互影響，其模型的穩(wěn)定性和可靠性無法保證[6]。因此，有學(xué)者[7]提出了新的研究思路，即在西醫(yī)疾病模型的基礎(chǔ)上，不施加人為干預(yù)因素，觀察并檢測模型動(dòng)物的宏觀表征和微觀指標(biāo)，綜合上述結(jié)果進(jìn)行證候?qū)傩耘卸?。這種按照臨床診療思路構(gòu)建的模型客觀性強(qiáng)、可信度高，更貼近于臨床實(shí)際。本研究正是基于這種思路，采用單一藥物因素作為病證結(jié)合模型疾病與證候共同的造模因素，探索建立冠心病心絞痛寒凝血瘀證病證結(jié)合動(dòng)物模型，并對其進(jìn)行證候評價(jià)。

3.1 冠心病心絞痛動(dòng)物模型建立

垂體后葉素(pituitrin，pit)是從動(dòng)物腦垂體中提取的物質(zhì)。研究證實(shí)，過量的pit靜脈注射可引起冠狀動(dòng)脈較長時(shí)間強(qiáng)烈痙攣，同時(shí)使全身小血管收縮，外周負(fù)荷加重，心肌耗氧量增加，從而引起急性心肌缺血，導(dǎo)致急性心絞痛的發(fā)作[8]。本研究采用垂體后葉素6U/kg大劑量股靜脈注射的方法建立動(dòng)物模型，通過觀察其心電圖變化發(fā)現(xiàn)，在造模后30 min ST段顯著抬高且大于0.1mV，符合急性心肌缺血心電圖的典型變化，說明冠脈痙攣性心絞痛動(dòng)物模型建立成功[9]。

3.2 寒凝血瘀證動(dòng)物模型的評價(jià)

中醫(yī)“證”的動(dòng)物模型，應(yīng)符合中醫(yī)病因?qū)W說和辨證診斷規(guī)律。研究表明[10，11]，垂體后葉素大劑量造模具有明顯的寒邪致病特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用垂體后葉素靜脈注射造模，不僅在病因上符合中醫(yī)理論，而且符合臨床急性心絞痛寒邪直入心脈的發(fā)病特點(diǎn)。

癥狀和體征是辨識證候的主要依據(jù)。臨床上冠心病心絞痛寒凝血瘀證發(fā)病時(shí)常表現(xiàn)為手足不溫、厥冷，胸痛如絞，口唇、爪甲青紫，舌紫暗。本研究首先通過觀察比較大鼠造模前后一般狀況的變化，來獲取大鼠的宏觀體征和診斷信息，再運(yùn)用中醫(yī)理論進(jìn)行綜合辨證分析，確定模型的證候?qū)傩?。?shí)驗(yàn)中我們觀察到，模型組大鼠唇周、爪子顏色紫暗，爪溫下降，耳殼、尾巴變白發(fā)涼，大便濕爛，心率減慢，這些均符合中醫(yī)寒凝血瘀證候表現(xiàn)。

微觀理化指標(biāo)是辨識證候的輔助和有效補(bǔ)充。本研究借助現(xiàn)代技術(shù)檢測手段，從器官、細(xì)胞、分子水平獲取信息，在較深層次上對模型進(jìn)行微觀辨證。心電圖變化是反映心肌缺血與否的直觀指標(biāo)，微靜脈管徑和紅細(xì)胞流速是反映心肌微循環(huán)情況的有效指標(biāo)。TXB2、6-keto-PGF1α是 TXA2與 PGI2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物。TXA2與PGI2是一組由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并釋放的血管活性物質(zhì)，TXA2能促進(jìn)血管收縮和血小板聚集，PGI2能舒張血管，抑制血小板聚集，二者相互拮抗，在生理狀態(tài)下血漿中二者的濃度比值相對平衡，從而維持適當(dāng)?shù)墓诿}張力和血小板內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[12]。

本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠體溫下降，心率減慢，心電圖表現(xiàn)為心肌缺血;心肌微靜脈收縮，紅細(xì)胞流速明顯減慢，TXB2/6-Keto-PGF1α值顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)。綜合分析微觀理化指標(biāo)后我們認(rèn)為，這些變化符合寒凝血瘀證的微觀表現(xiàn)。寒為陰邪，直入心脈，損傷心陽，心陽無力鼓動(dòng)血液運(yùn)行，故見體溫下降、心率減慢、心肌缺血等“寒邪傷陽”表現(xiàn);“寒性收引、凝滯”，寒邪內(nèi)侵，引起心脈絀急、氣血凝滯，故在微觀視野中相應(yīng)地表現(xiàn)為心肌微血管收縮、紅細(xì)胞流速減慢等微循環(huán)障礙等血瘀表現(xiàn);TXA2/PGI2的失衡被認(rèn)為是血瘀證的特征之一[13]，寒邪入脈，血管收縮，損傷血管內(nèi)皮，致使PGI2等抗凝抗栓物質(zhì)的生成釋放減少，而TXB2等促凝促栓物質(zhì)生成釋放增加，二者失衡可導(dǎo)致血管痙攣加重、血小板聚集、血栓形成等病理改變，使得血行障礙而為寒凝血瘀證。

綜上所述，通過對模型宏觀表征和微觀指標(biāo)的辨證分析，我們認(rèn)為大鼠冠心病心絞痛寒凝血瘀證模型成功建立。該模型既符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)疾病病理變化特點(diǎn)，也符合中醫(yī)證候特征，可靠性及穩(wěn)定性較好。本實(shí)驗(yàn)借助現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的先進(jìn)技術(shù)，對寒凝血瘀證模型進(jìn)行深層次微觀辨證的同時(shí)，在一定程度上也是對證候的物質(zhì)基礎(chǔ)和變化實(shí)質(zhì)的深入闡釋。該模型的成功建立對于中藥藥效的評價(jià)和中藥作用機(jī)理的研究頗有意義，能更好地為臨床診療服務(wù)。

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