盧科蓮，喻小蘭，夏紀(jì)毅，毛熙光

(1瀘州市婦幼保健院，四川瀘州646000;2瀘州市龍馬潭區(qū)婦幼保健院;3瀘州醫(yī)學(xué)院;4瀘州醫(yī)學(xué)院藥物與功能性食品研究中心;5瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

宮頸癌是全球女性發(fā)病率僅次于乳腺癌的惡性腫瘤，嚴(yán)重影響婦女的健康［1］。宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移的過(guò)程非常復(fù)雜，其中又涉及多種基因的調(diào)控。黃芩素是中藥黃芩的主要成分之一，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)以及抑制腫瘤等作用［2］。Wang 等［3］發(fā)現(xiàn)，黃芩素可以有效抑制MDA-MB-231細(xì)胞的黏附、轉(zhuǎn)移及侵襲。黃芩水提物可以明顯抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的體外生長(zhǎng)，與藥物的作用時(shí)間和濃度呈正相關(guān)［4］。2013年6～11月，我們觀察了黃芩素對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的抑制作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌Hela細(xì)胞株(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng))，DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)，黃芩素(Chengdu Must Bio-Techology公司)，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(南京凱基公司)，明膠(Sigma公司)，其余SDS-PAGE膠成分(北京索萊寶公司)，5×上樣緩沖液、4×上樣緩沖液、考馬斯藍(lán)、脫色液、裂解液RIPA(強(qiáng))及小鼠抗人β-actin抗體(碧云天公司)，蛋白酶抑制劑及磷酸化蛋白酶抑制劑(Roche公司)，兔抗人MMP-2抗體、兔抗人MMP-9抗體、兔抗人Ras抗體、兔抗人CyclinD1抗體及兔抗人Integrinβ1抗體(CST公司)，RT-PCR 試劑盒(天根公司)。MMP-2、MMP-9、Ras、細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)及整合素β1(Integrinβ1)引物由上海生工公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含有100 mL/L滅活胎牛血清及100 mol/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)Hela細(xì)胞。置于37℃、50 mL/L CO2細(xì)胞孵箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組及干預(yù) ①取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用2.5 g/L胰酶消化后接種到直徑為10cm的一次性培養(yǎng)皿中(接種數(shù)量1.5×106個(gè)/皿)，等待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后，換無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)同步化處理24 h，用含有不同濃度(0、100、200、300 μmol/L)黃芩素的無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)12、24、48 h。②相差顯微鏡下觀察，與C組相比較，干預(yù)12 h時(shí)，各干預(yù)組的細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)變化不大;干預(yù)24 h時(shí)，300 μmol/L組細(xì)胞大量死亡，病死率約90%;48 h時(shí)，各干預(yù)組細(xì)胞大量死亡，病死率80% ～90%，無(wú)實(shí)驗(yàn)意義，最終選擇以下3組，A組加入100 μmol/L黃芩素，B組加入200 μmol/L黃芩素，C組加入不含黃芩素的無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.4 細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化觀察 相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量的變化。同1.2及1.3培養(yǎng)細(xì)胞后，含不同終濃度(0、100、200 μmol/L)的黃芩素?zé)o血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。通過(guò)顯微鏡觀察其形態(tài)及數(shù)量的變化。為了防止其他因素的影響，實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)3次，觀察3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否一致。

1.5 細(xì)胞周期檢測(cè) 采用流式細(xì)胞技術(shù)。采用南京凱基細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，與細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)消化細(xì)胞一致，消化細(xì)胞后，用1 mL無(wú)菌PBS重新懸浮細(xì)胞，2 000 r/min，5 min離心，小心移去上清液;加入 0.5 mL Solution Buffer輕輕懸浮細(xì)胞，2 000 r/min，5 min離心，小心移去上清液;再加入0.5 mL Solution Buffer輕輕懸浮細(xì)胞，2 000 r/min，5 min離心，小心移去上清液;加入250 μL Solution A，輕輕懸浮細(xì)胞，25℃孵育10 min;在此溶液中加入200 μL的Solution B，輕輕懸浮細(xì)胞，25℃孵育10 min;最后加入 200 μL Solution C，輕輕懸浮細(xì)胞，4℃避光10 min;上機(jī)檢測(cè)(儀器為BD Verse)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處紅色熒光。使用儀器自帶專(zhuān)用軟件成圖及數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)基中MMP-2、MMP-9活性檢測(cè) 采用明膠酶譜法。黃芩素干預(yù)24 h后，統(tǒng)一收集各組細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基，100 μL/管進(jìn)行分裝，置于－80℃保存、備用。每組取12 μL上清與4 μL的4×上樣緩沖液均勻混合，靜置于室溫10 min后，電泳。電泳結(jié)束后把膠放入含10%TRITON X-100的復(fù)性液中恢復(fù)活性2次，20 min/次;超純水漂洗膠2次，20 min/次;加入孵育液，置于37℃水浴鍋中，恒溫、過(guò)夜?？捡R斯藍(lán)染色1 h后，脫色2 h。膠放入Bio-Rad成像儀中成像后，Quantity One軟件分析其灰度值，以條帶平均光密度值(MOD)表示。

1.7 細(xì)胞 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。所有操作根據(jù)試劑盒操作步驟進(jìn)行。Quantity One軟件分析其灰度值，以條帶平均光密度值表示，以β-actin平均光密度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正。

1.8 細(xì)胞 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。宮頸癌Hela細(xì)胞用預(yù)冷、無(wú)菌PBS液沖洗3次后，加入裂解液提取總蛋白，沸水變性5 min，－20℃保存?zhèn)溆谩?0%SDS-PAGE膠電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，時(shí)間約60 min。封閉1 h，用1×TBST輕柔漂洗5 min，一抗4℃孵育過(guò)夜(一抗 MMP-2、MMP-9稀釋比例為1∶500，Ras稀釋比例為1∶600，CyclinD1 稀釋比例為 1∶800，Integrinβ1 稀釋比例為 1∶1 000，βactin稀釋比例為1∶2 000)，取出PVDF膜充分漂洗2次，20 min/次。放入二抗中(分為 HRP羊抗兔IgG(H+L)及HRP羊抗小鼠IgG(H+L)，二抗稀釋比例均為1∶2 000)，室溫孵育1 h。漂洗 4次，5 min/次。放入 Bio-Rad成像儀進(jìn)行成像并使用Quantity One軟件分析。其灰度值以條帶平均光密度值表示，以β-actin平均光密度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)變化比較 與C組相比較，A、B組細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，從不規(guī)則類(lèi)圓形轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟撬笮巍?/p>

2.2 細(xì)胞周期變化比較 A、B、C組S期細(xì)胞百分比分別為 24.58%、19.41%、34.05%，G1期百分比分別為 72.67%、79.17%、64.88%，A、B 組與 C 組比較，P 均 ＜0.05。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)基中MMP-2、MMP-9活性比較 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞培養(yǎng)基中MMP-2、MMP-9活性比較(±s)

表1 各組細(xì)胞培養(yǎng)基中MMP-2、MMP-9活性比較(±s)

注:與 C 組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 MMP-2活性 MMP-9活性A 組 32.651±0.571 33.217±0.660*B 組 28.987±1.033* 29.277±0.868△C組36.127±1.184 39.613±0.318

2.4 細(xì)胞 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1 mRNA表達(dá)比較 結(jié)果見(jiàn)表2。

表 2 各組細(xì)胞 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1 mRNA 表達(dá)比較(±s)

表 2 各組細(xì)胞 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1 mRNA 表達(dá)比較(±s)

注:與C 組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 MMP-2 mRNA MMP-9 mRNA Ras mRNA CyclinD1 mRNA Integrinβ1 mRNA A 組 1.012±0.045* 1.009±0.030*0.988±0.036*1.013±0.034* 0.983±0.036*B 組 0.849±0.026* 0.914±0.027*0.626±0.029△ 0.806±0.037△ 0.799±0.037△C 組 1.199±0.029 1.087±0.024 1.413±0.026 1.203±0.029 1.224±0.025

2.5 細(xì)胞 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1 蛋白表達(dá)比較 結(jié)果見(jiàn)表3。

表 3 各組細(xì)胞 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1 蛋白表達(dá)比較(±s)

表 3 各組細(xì)胞 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1 蛋白表達(dá)比較(±s)

注:與C 組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 MMP-2蛋白 MMP-9蛋白 Ras蛋白 CyclinD1蛋白 Integrinβ1蛋白A 組 0.693±0.025* 0.886±0.032*1.127±0.028*1.061±0.028* 1.159±0.031*B 組 0.326±0.022△ 0.754±0.024*0.782±0.183*0.321±0.027△ 0.481±0.028△C 組 1.914±0.031 1.487±0.016 1.323±0.303 1.816±0.025 1.467±0.036

3 討論

宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)緩慢的漸進(jìn)過(guò)程，也是一個(gè)由多因素相互作用的連續(xù)而復(fù)雜的過(guò)程。涉及細(xì)胞無(wú)序生長(zhǎng)、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)被降解、原發(fā)瘤細(xì)胞突破基底膜侵入間質(zhì)、瘤細(xì)胞在間質(zhì)中移行并接觸脈管、瘤細(xì)胞突破血管內(nèi)皮及其下基底膜進(jìn)入血流，并在血中存活、瘤細(xì)胞穿出血管后在組織中存活增殖，形成轉(zhuǎn)移灶。所以，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是宮頸癌療效差、預(yù)后不良的重要因素。其侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中必需穿透一系列天然組織屏障:如基底膜和ECM，合成及分泌大量基質(zhì)降解酶，降解ECM是腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的重要步驟［5］。只有完成了對(duì)ECM的降解才使腫瘤細(xì)胞突破ECM構(gòu)成的結(jié)構(gòu)屏障，向周?chē)M織侵襲或進(jìn)入血循環(huán)或淋巴系統(tǒng)［6］。

MMPs是迄今為止發(fā)現(xiàn)與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系最密切的一類(lèi)蛋白水解酶，能降解ECM的絕大多數(shù)成分。大量研究表明，在食管癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌等腫瘤中MMPs的表達(dá)明顯高于正常組織，而MMPs家族中以明膠酶類(lèi)的MMP-2、MMP-9尤為重要，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［7，8］。李現(xiàn)東［9］認(rèn)為，黃芩素可以抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖遷移并誘導(dǎo)其凋亡。王洪飛等［10］發(fā)現(xiàn)，黃芩素不但對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的增殖活性具有抑制作用并促進(jìn)其凋亡，它的這種作用還呈時(shí)間—?jiǎng)┝恳蕾?lài)性。

CyclinD1是細(xì)胞周期的正調(diào)節(jié)因子，跟細(xì)胞周期G1期緊密相關(guān)，其表達(dá)的增加與細(xì)胞增殖失控有關(guān)。它與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶結(jié)合后，促使細(xì)胞從G1期順利進(jìn)入S期，使細(xì)胞發(fā)生分裂與增殖，因此CyclinD1蛋白的過(guò)度表達(dá)會(huì)使增殖周期不斷進(jìn)行，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［11］。研究［11～13］發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌中 CyclinD1表達(dá)高于正常組織，在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用，其表達(dá)水平與臨床分期、病理分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。另有研究［14，15］認(rèn)為，CyclinD1基因的擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)與肝癌的侵襲性和較高的腫瘤分期有關(guān)。同時(shí)研究［16～18］顯示，Ras癌基因可以通過(guò)上調(diào)CyclinD1的表達(dá)加速細(xì)胞周期的進(jìn)程，同時(shí)激活的Ras信號(hào)通路使CyclinD1積聚，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入靜息狀態(tài)，提示Ras誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的作用機(jī)制之一可能是通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期素的調(diào)控改變細(xì)胞周期的進(jìn)程實(shí)現(xiàn)的。是否Ras及CyclinD1參與了黃芩素干預(yù)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖抑制的過(guò)程?Ras和CyclinD1之間是否仍存在相互作用關(guān)系?我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芩素干預(yù)宮頸癌Hela細(xì)胞后，將細(xì)胞阻滯于G1期，下調(diào)Ras和CyclinD1 mRNA、蛋白表達(dá)水平，與喻小蘭等［19］實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

Integrin β1在多種腫瘤細(xì)胞和實(shí)體瘤中高表達(dá)，并且與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，整合素的細(xì)胞內(nèi)片段通過(guò)紐蛋白、輔肌蛋白、踝蛋白及整合素連接激酶與細(xì)胞骨架鏈接，參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)?？笽ntegrinβ1抗體明顯抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)膠原蛋白Ⅳ的黏附，而膠原蛋白Ⅰ、Ⅳ是ECM的重要組成部分，這提示Integrinβ1在腫瘤細(xì)胞與ECM的黏附過(guò)程中必不可少。所以研究黃芩素對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的浸潤(rùn)、侵襲的影響，就需要研究與ECM聯(lián)系緊密的Integrinβ1。

本研究顯示，A、B組細(xì)胞數(shù)量較C組減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，從不規(guī)則類(lèi)圓形轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟撬笮?，提示黃芩素可致細(xì)胞增生受到抑制，受抑制程度與黃芩素干預(yù)濃度呈正相關(guān)。A、B組S期細(xì)胞百分比較C組少，G1期百分比較C組多，提示細(xì)胞周期G1期受到阻滯，阻滯程度與黃芩素干預(yù)濃度相關(guān)。A組MMP-9活性及B組MMP-2、MMP-9活性低于C組，提示MMP-2和MMP-9活性明顯受到抑制。A、B組 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1 mRNA 水平低于 C 組，提示MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1 及 Integrinβ1 mRNA 表達(dá)隨黃芩素濃度的增加而降低，降低程度與黃芩素濃度相關(guān)。A、B 組 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1蛋白水平低于 C 組，提示 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1及Integrinβ1蛋白水平的表達(dá)明顯受到抑制，受抑制程度與黃芩素濃度相關(guān)。

［1］王淑珍，羅好曾.武威市宮頸癌發(fā)病率分析［J］.中國(guó)腫瘤，2008，17(2):96-97.

［2］許杜鵑，陳敏珠.黃芪總提物抗腫瘤作用及機(jī)制的研究［J］.中華中醫(yī)雜志，2006，21(12):771-772.

［3］Wang L，Ling Y，Chen Y，et al.Flavonoid baicalein suppresses adhesion，migration and invasion of MDA-MB-231 human breast cancer cells［J］.Cancer Letters，2010，297(1):42-48.

［4］張曉金，歸綏琪.宮頸癌發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)婦幼健康研究，2008，19(1):56-59.

［5］馮樹(shù)，宋今丹.參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的細(xì)胞外基質(zhì)降解酶［J］.腫瘤防治研究，1999，26(1):72-76.

［6］薛洋，周清華，張尚福，等.MMP-2/MMP-9在肺癌中的表達(dá)及其與肺癌轉(zhuǎn)移后預(yù)后關(guān)系的研究［J］.華西醫(yī)學(xué)，2008，23(2):225-228.

［7］Zhang M，Zhu GY，Gao HY，et al.Expression of tissue level of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in gastric adenocarcinoma［J］.J Surg Oncol，2011，103(3):243-247.

［8］Wang L，Ling Y，Chen Y，et al.Flavonoid baicalein suppresses adhesion，migration and invasion of MDA-MB-231 human breast cancer cells［J］.Cancer Letts，2010，297(1):42-48.

［9］李現(xiàn)東.漢黃芩素對(duì)肺癌細(xì)胞株A549的體外作用研究［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，36(7):790-792.

［10］王洪飛，肖秀麗.黃芩素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7體外增殖和凋亡的影響［J］.瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，4(1):43-46.

［11］郭艷萍，楊廣英，王建君，等.PTEN、STAT3和CyclinD1蛋白在宮頸癌中的表達(dá)及意義［J］.中國(guó)婦幼保健，2012，27(15):2344-2346.

［12］劉文鳳，王言奎，呂艷，等.宮頸癌組織CyclinD1和P27表達(dá)及意義［J］.齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2011，26(5):405-408，411.

［13］王一娜，童亞非.CyclinD1與P27在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性［J］.泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，34(11):816-819.

［14］Azechi H，Nishida N，F(xiàn)ukuda Y，et al.Disruption of the p16/cyclin D1/retinoblastoma protein pathway in the majority of humanhepatocellular carcinomas［J］.Oncology，2001，60(4):346-354.

［15］Choi YL，Park SH，Jang JJ，et al.Expression of the G1-S modulators in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma and dysplasticnodule:association of cyclin D1 and p53 proteins with the progression of hepatocellular carcinoma［J］.J Korean Med Sci，2001，16(4):424-432.

［16］Akuwa N，Takuwa Y.Regulation of cell cycle molecules by the Ras effector system［J］.Mol Cell Endocrinol，2001，177(1):25-33.

［17］Ktas H，Cai H，Cooper GM.Ras links growth factor signaling to the cell cycle machinery via regulation of cyclin D1 and the Cdk inhibitor p27KIP1［J］.Mol Cell Biol，1997，17(7):3850-3857.

［18］Coleman ML，Marshall CJ，Olson MF，et al.Ras promotes p21(Waf1/Cip)1protein stability via a cyclin D1-imposed block in proteasome-mediated degradation［J］.Emboj，2003，22(9):2036-2046.

［19］喻小蘭，盧科蓮，夏紀(jì)毅，等.Ras、CyclinD1在宮頸癌腫的表達(dá)及黃芩素對(duì)其表達(dá)的影響［J］.繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2014，28(2):19-22.