孫亞軍，張春德

(天津醫(yī)科大學總醫(yī)院，天津300052)

白血病是我國發(fā)病率較高的癌癥之一，盡管其診斷和治療取得了較大進展，但其總體預后依然較差。哈爾明堿是一種具有抗腫瘤活性的生物堿類化合物，被認為能夠調控細胞生長、生存、分化、增殖、遷移等細胞進程，同時還參與了多種信號傳導途徑［1］。本研究觀察了哈爾明堿對白血病HL-60細胞增殖和周期的影響，為其進一步臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人白血病HL-60細胞購自美國ATCC細胞庫;哈爾明堿(＞98%)購自Sigma公司;細胞周期檢查試劑盒購自BD Biosciences公司;實時熒光定量PCR試劑盒購于TaKaRa公司;STGC3、CDK1、p27、p53和p-AKT抗體購于Santa Cruz公司;抗βactin一抗購自 Sigma公司;MTS試劑、NF-κB和AP-1熒光表達質粒購于美國Promega公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及藥物處理 人白血病HL-60細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)箱于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。哈爾明堿粉末以DMSO溶解制備成儲存液，使用前以無血清培養(yǎng)基稀釋至實驗濃度，過濾后使用。

1.3 哈爾明堿對HL-60細胞增殖影響的觀察 采用MTS法。將腫瘤細胞調整為5×105/mL，每孔加入100 μL細胞懸液于 96孔板中，置于37℃、5%CO2孵箱中孵育24 h，實驗組分別加入 1、2、10、20、100 μg/mL 哈爾明堿作用 24 h，更換新鮮培養(yǎng)基，加入20 μL MTS，孵育 2 h，酶標儀測定 490 nm的吸光值(OD值)。以0 μg/mL組作為對照組，細胞抑制率(%)=［1－(OD值實驗組/OD值對照組)］×100%。為避免哈爾明堿的腫瘤抑制作用對結果的干擾，選擇對HL-60細胞抑制率＜10%的哈爾明堿濃度進行下述實驗。

1.4 哈爾明堿對HL-60細胞周期影響的觀察 采用流式細胞儀檢測。將3×105細胞培養(yǎng)在6孔板中孵育24 h，實驗組加入1、2 μg/mL哈爾明堿作用24 h(分別為實驗1組、實驗2組，下1.5～1.8分組同)，消化后離心，PBS洗滌2次，加入1 mL預冷的70%乙醇4℃固定過夜，離心去乙醇，PBS洗滌1次，加入400 μL含有RnaseA的PI染液，室溫孵育15 min，PBS洗滌后，流式細胞儀檢測。對照組細胞中未加入哈爾明堿進行培養(yǎng)，操作同上。

1.5 HL-60細胞中與細胞周期、增殖相關的基因蛋白檢測 采用Western blotting法。3×105細胞培養(yǎng)在6孔板中孵育24 h后，實驗組加入1、2 μg/mL哈爾明堿作用24 h，將細胞用RIPA裂解法提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。100 μg蛋白樣品經10%SDS-PAGE電泳后轉移至硝酸纖維素膜(150 mA，1 h)，5%脫脂牛奶封閉1 h后，再加入一抗(STGC3，1∶400;CDK1，1∶400;p53，1∶400;p27，1∶400;p-AKT，1∶200;β-actin，1∶4 000)4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次后，加入二抗室溫孵育1 h，ECL熒光顯影，以β-actin為內參計算各蛋白含量。對照組細胞中未加入哈爾明堿進行培養(yǎng)，操作同上。

1.6 HL-60細胞中與細胞周期、增殖相關的基因mRNA檢測 采用RT-PCR法。3×105細胞培養(yǎng)在6孔板中孵育24 h后，實驗組加入1、2 μg/mL哈爾明堿作用24 h，將細胞用按照TRIzol方法提取總RNA，逆轉錄合成第一鏈cDNA，所有樣品的目的基因和內參基因GAPDH進行熒光定量PCR反應，分別取得相對表達差異。PCR反應進行40個循環(huán)，94℃、90 s，56℃、30 s，72℃、60 s。各基因及其引物序列如下:基因STGC3的上游引物序列為5'-CGGGATCCATGGTTCT-TGTTTCTTAT-3'，下游引物序列為 5'-GCCCCAAGCTT-TAGAGTAATAAAAGATTC-3';基因CDK1的上游引物序列為5'-AGACCTGGGCAGATTCCAAAC-3'，下游引物序列為5'-CATGTACTGACCAGGAGGGATAG-3';基因p53的上游引物序列為5'-CGGTTTCCGTCTGGGCTTCTT-3'，下游引物序列為5'-CCACACGCAAATTTCCTTCCACTC-3';其中基因 p27的上游引物序列為5'-CCGACGATTCTTCTACTC-3'，下游引物序列為5'-CTGATAAACAAGGAAACATA-3';基因GAPDH的上游引物序列為5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物序列為5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。對照組細胞中未加入哈爾明堿進行培養(yǎng)，操作同上。

1.7 細胞轉錄因子 NF-κB和 AP-1活性檢測 采用報告基因技術檢測。3×105細胞培養(yǎng)在6孔板中孵育24 h后，轉入NF-κB和AP-1熒光報告質粒孵育4 h，實驗組加入1、2 μg/mL哈爾明堿作用24 h，更換新鮮無血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h，收集細胞，采用報告基因技術檢測各處理組中轉錄因子NF-κB和AP-1活性。對照組細胞中未加入哈爾明堿進行培養(yǎng)，操作同上。

1.8 細胞因子TGF-β、IL-1β、IL-6和IL-8檢測 采用ELISA技術檢測。3×105細胞培養(yǎng)在6孔板中孵育24 h，后實驗組加入1、2 μg/mL哈爾明堿作用24 h，更換新鮮無血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h，收集上清，采用ELISA技術檢測各處理組中細胞因子TGF-β、IL-1β、IL-6和IL-8。對照組細胞中未加入哈爾明堿進行培養(yǎng)，操作同上。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組HL-60細胞增殖、周期分布比較 1、2、10、20、100 μg/mL 哈爾明堿對 HL-60 細胞的生長抑制率分別為 4.2%、9.6%、21.5%、55.3%、98.4%，隨著哈爾明堿濃度逐漸增加，HL-60細胞的生長抑制率上升(P均＜0.05)。哈爾明堿對HL-60細胞周期的影響見表1。

表1 兩組HL-60細胞周期分布比較(%，±s)

表1 兩組HL-60細胞周期分布比較(%，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別 G0/G1期 S期 G2/M期實驗組實驗1 組 60.12±3.23* 20.66±1.37* 19.22±1.33*實驗2 組 70.16±3.78* 19.13±1.25* 10.70±0.77*對照組46.40±2.41 25.65±1.54 27.95±1.65

2.2 兩組HL-60細胞增殖相關基因蛋白、mRNA表達比較 結果見表2、3。

2.3 兩組 HL-60細胞轉錄因子NF-κB和 AP-1活性比較 結果見表4。

2.4 兩組HL-60細胞細胞因子表達比較 結果見表5。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程是一個多步驟、多階段、多因素的復雜過程。研究藥物抑制腫瘤細胞生長增殖的機制對于腫瘤的治療，改善預后具有重要的意義。以往的研究［2，3］表明，哈爾明堿可抑制多種人類腫瘤，對于腫瘤治療具有重要的意義。本研究通過觀察哈爾明堿對人白血病HL-60細胞的作用，發(fā)現哈爾明堿可顯著抑制腫瘤細胞的增殖，同時可以阻滯細胞周期進程，使細胞周期停滯于G0/G1期。

表2 兩組HL-60細胞增殖相關基因蛋白表達比較(%，±s)

表2 兩組HL-60細胞增殖相關基因蛋白表達比較(%，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別 STGC3蛋白 CDK1蛋白 p53蛋白 p27蛋白 p-AKT蛋白實驗組實驗1 組 147.2±11.7* 73.5±6.5* 137.6±14.7* 188.3±10.3* 53.7±4.1*實驗2 組 228.3±21.6* 18.7±2.2* 197.5±24.6* 248.2±23.3* 22.6±1.2*對照組 100.0± 8.2 100.0±9.3 100.0± 7.7 100.0± 6.8 100.0±7.4

表3 兩組HL-60細胞增殖相關基因mRNA表達比較(%，±s)

表3 兩組HL-60細胞增殖相關基因mRNA表達比較(%，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別STGC3 mRNA CDK1 mRNA p53 mRNA p27 mRNA實驗組實驗1 組 166.3± 8.2* 62.5±3.5* 159.2±4.4*167.3±5.7*實驗2 組 256.5±11.4* 28.9±1.7* 226.5±5.8*203.6±9.3*對照組100.0± 5.2 100.0±4.7 100.0±3.6 100.0±4.8

表4 兩組HL-60細胞轉錄因子活性比較(%，±s)

表4 兩組HL-60細胞轉錄因子活性比較(%，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別 NF-κB AP-1實驗組實驗1 組 52.7±2.2* 71.8±3.3*實驗2 組 40.3±1.7* 53.4±2.6*對照組100.0±3.8 100.0±3.7

表5 兩組HL-60細胞細胞因子表達比較(pg/mL，±s)

表5 兩組HL-60細胞細胞因子表達比較(pg/mL，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別 TGF-β IL-1βIL-6 IL-8實驗組實驗1 組 277.9±32.7*269.2±24.6*548.3±47.3*239.1±18.5*實驗2 組 194.8±18.5*205.7±11.7*345.7±29.6* 84.6± 8.7*對照組 413.5±57.3 371.3±31.5 877.3±82.6 457.2±51.3

本研究顯示，哈爾明堿能明顯促進STGC3、p53和p27的表達，下調CDK1的表達，說明哈爾明堿對腫瘤增殖的抑制作用和細胞周期的阻滯作用，可能與其可調節(jié)細胞周期相關基因有關。AKT是ILK基因重要的下游基因之一，在PI3K下游信號通路中起關鍵作用，調節(jié)細胞存活、分化、增殖及代謝等基本進程，能調控STGC3、p53和p27的表達，進而影響細胞周期蛋白 CDK1的表達和降解［4］。Malla等［5］發(fā)現，ILK siRNA能抑制神經膠質瘤細胞中p-AKT的表達，進而改變細胞周期進程，有效抑制細胞生長。應用ILK抑制劑(QLT-0254)能明顯抑制腫瘤的生長［6］。還有研究［7］表明，通過 siRNA 條件性的敲除ILK表達，導致AKT激酶的活性幾乎完全被抑制，CDK1表達受抑制，p53和p27的表達升高。

我們的實驗還發(fā)現，哈爾明堿能抑制人白血病HL-60 細胞 TGF-β、IL-1β、IL-6、IL-8 等炎癥細胞因子的分泌以及NF-κB和AP-1的轉錄活性。炎性細胞在腫瘤轉移中發(fā)揮著重要作用，IL-6、IL-1β、IL-8等炎癥細胞因子可促進腫瘤細胞增殖［8］。TGF-β可以誘導多種轉錄因子的表達，同時也使腫瘤細胞相關基因表達量增加，從而促進腫瘤的發(fā)生［9］。IL-6是聯(lián)系炎癥與癌癥的重要炎性細胞因子。IL-6通過NF-κB-IL-6-STAT3級聯(lián)反應在乳腺癌細胞中發(fā)揮促腫瘤的作用［10］。IL-1β則通過活化Zeb1調控腫瘤的發(fā)生［11］。在聯(lián)系炎癥與腫瘤的大量分子信號通路中，NF-κB和AP-1逐漸成為參與炎癥誘導轉移的核心分子。有證據顯示，NF-κB的活化與參與腫瘤發(fā)生的許多轉錄因子(如 Slug、Snail、Twist以及ZEB1/ZEB2)的誘導有關［12］。

綜上可見，哈爾明堿可抑制HL-60細胞的增殖能力，其機制可能與下調CDK1并上調STGC3、p27、p53 的表達，抑制細胞 TGF-β、IL-1β、IL-6、IL-8 等炎癥細胞因子的分泌以及NF-κB和AP-1的轉錄活性有關。這為白血病的治療提供了新的思路。

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