魏 紅，齊淑靜，劉文利，徐 亮，李麗東，李 華，董稚明，張向陽

(1河北工程大學附屬醫(yī)院，河北邯鄲056000;2邯鄲市第四醫(yī)院;3河北醫(yī)科大學腫瘤研究所病理研究室)

賁門腺癌(GCA)被認為是胃癌的特殊類型，國際上對GCA的定義尚無統(tǒng)一標準，目前均以癌中心的解剖學位置作為分類標準。GCA主要的治療方法是手術(shù)治療，但患者較多因腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移發(fā)生死亡，預(yù)后差。因此，進一步了解GCA癌變的分子學機制，探索早期、高度敏感性和特異性的生物學診斷指標，尋求有效的防治手段，為臨床防治研究及預(yù)后評價提供理論依據(jù)，具有重大的理論意義和應(yīng)用價值［1，2］。Raf激酶抑制蛋白(RKIP)是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族中的一員，其在大腸桿菌、植物酵母、線蟲、果蠅、開花植物和哺乳動物的不同組織中均有表達［3～5］。研究［6］顯示，RKIP 具有抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的作用，這已在各種腫瘤中得到證實，它可能位于腫瘤抑癌基因和原癌基因上游而發(fā)揮重要作用。核因子-κB(NF-κB)是來源于Re1家族的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于哺乳動物處于靜止期的細胞中，以非活化形式存在于細胞質(zhì)中，它具有調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡、調(diào)節(jié)免疫和炎性反應(yīng)的作用。2008年1月～2013年10月，我們觀察了GCA組織中RKIP、NF-κBp65的表達變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008年1月～2013年10月河北工程大學附屬醫(yī)院收治的GCA患者160例，男118例，女42例;年齡37～83(61.8±8.7)歲，其中＜60歲者58例，≥60歲者102例;所有患者均經(jīng)病理證實，且術(shù)前均未行放化療。按2002年修改的國際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國腫瘤聯(lián)合會(AJCC)制定的TNM分期第6版標準進行分期，Ⅰ﹢Ⅱ期70例，Ⅲ+Ⅳ期90例;腫瘤分化程度高分化41例，中分化54例，低分化65例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移92例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移68例?；颊呓邮苄g(shù)后時留取癌組織160例份(腺癌組)，同時留取距癌組織5cm處的非癌組織160例份(癌旁組)。

1.2 RKIP、NF-κBp65的檢測方法 標本獲取后立即放于液氮保存并固定于10%中性甲醛之中，以便制作蠟塊用作免疫組織化學蛋白表達的測定。采用HE染色確定腫瘤標本主要是由腫瘤組織構(gòu)成，并確定癌旁組織沒有腫瘤細胞浸潤。采用免疫組化SP法試劑盒(北京中杉金橋公司產(chǎn)品)檢測RKIP蛋白在GCA和癌旁正常賁門組織中的表達，以PBS代替RKIP多克隆抗體作為空白對照，已知陽性片做陽性對照。應(yīng)用鼠抗人NF-κB單克隆即用型抗體及PV-6000免疫組化試劑(北京中杉生物技術(shù)有限公司)檢測NF-κBp65蛋白在GCA和正常賁門組織中的表達，按照PV-6000二步法免疫組織化學染色試劑盒說明操作，DAB顯色，以PBS代替一抗作為陽性對照，用已知陽性切片作陽性對照。結(jié)果判斷標準:RKIP陽性染色定位于細胞質(zhì)，部分可出現(xiàn)細胞膜著色;NF-κBp65免疫組化陽性著色主要位于胞核或胞質(zhì)。RKIP和NF-κBp65蛋白表達采用雙評分半定量法進行評分，RKIP在細胞質(zhì)及 NF-κBp65在細胞核和(或)細胞質(zhì)有淺黃色、棕色、棕褐色顆粒沉著為陽性細胞，高倍鏡下根據(jù)染色強度和陽性細胞所占比例進行結(jié)果判定。染色強度評分標準:不著色，0分;黃色，1分;棕黃色，2分;棕褐色，3分。陽性細胞所占比例的評定標準:陽性細胞率≤25%為0分，26% ～50%為1分，51% ～75%為2分，＞75%為3分。兩項評分相加，0～1分為陽性(－)，2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，5～6分為強陽性(+++)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS11.5 及 PPMS1.5［7］統(tǒng)計軟件。采用Wilcoxon方法分析兩組RKIP和NF-κBp65的表達差異，RKIP、NF-κBp65在GCA中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗，GCA組織中RKIP與NF-κBp65蛋白表達的相關(guān)性用Spearman等級相關(guān)分析。以P≤0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 兩組RKIP、NF-κBp65表達比較 腺癌組及癌旁組RKIP陽性表達率分別為38.75%、75.00%，兩組比較，P ＜0.01;NF-κBp65陽性表達率分別為75.625%、20.000%，兩組比較，P ＜0.01。

2.2 RKIP、NF-κBp65 表達與 GCA 臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果見表1。由表1可知，RKIP陽性表達與GCA淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05);NF-κBp65陽性表達與GCA臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P 均 ＜0.05)。

表1 RKIP、NF-κBp65表達與GCA臨床病理特征的關(guān)系

2.3 GCA組織中RKIP與NF-κBp65陽性表達的關(guān)系 GCA組織中RKIP與NF-κBp65表達呈負相關(guān)(r= －0.431，P ＜0.01)。

3 討論

GCA是我國北方特別是河北省的磁縣、涉縣及河南省的林縣等地常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病特點是具有明顯的地域性和家族聚集性。現(xiàn)學者普遍認為，GCA指發(fā)生于賁門黏膜上皮及賁門腺體的癌，主要指原發(fā)于或中心位于食管胃黏膜交界線向下2cm范圍內(nèi)的癌［8］。因此，現(xiàn)在GCA已作為一種獨立的疾病來研究［1］。在過去的30年間，GCA發(fā)病率每年以每年20%的增長率逐漸升高［9］，增加了近6倍［10］，增長速度是所有惡性腫瘤中最快的一種［11，12］。而且，GCA 早期不易發(fā)現(xiàn)，臨床就診病例多為中晚期，治療效果較差，缺乏應(yīng)用于早期診斷的敏感性、特異性指標和手段以及高效特異的防治措施和方法，是造成GCA病死率較高的重要因素，所以對GCA的發(fā)病機制、早期診斷、早期預(yù)防的研究日益受到重視［13］。

已有研究［14～16］顯示，RKIP 參與細胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)節(jié)，具有抑制 Raf-1-MAPK、NF-κB信號通路和激活G蛋白信號轉(zhuǎn)導通路活性的作用，而這些信號轉(zhuǎn)導通路的異?；罨c腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，提示RKIP表達異常參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。Keller等［17］發(fā)現(xiàn)，RKIP是前列腺癌的轉(zhuǎn)移抑制基因，在轉(zhuǎn)移的前列腺癌細胞中，RKIP mRNA和蛋白表達水平均低于非轉(zhuǎn)移的前列腺癌細胞，特別是在良性組織中RKIP表達水平最高，而在轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中表達減少甚至檢測不到。上述報道表明，RKIP功能的喪失與前列腺癌轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。FU等［6］報道，上調(diào)前列腺癌細胞中的RKIP表達能使癌細胞的體外侵襲能力降低、降低前列腺癌裸鼠移植瘤的轉(zhuǎn)移能力。因此，RKIP現(xiàn)已被用作前列腺癌的一個新的診斷標志物［18］。Schuierer等［19］認為，轉(zhuǎn)移的黑色素瘤中RKIP表達水平顯著下降，超表達RKIP可以抑制高轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力。而在乳癌中也有相似報道［20］。上述報道提示，RKIP參與了腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控，RKIP功能的喪失能增強轉(zhuǎn)化細胞的侵潤能力，從而促進轉(zhuǎn)移的發(fā)生。本研究顯示，腺癌組RKIP陽性率低于癌旁組，RKIP陽性表達與GCA淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明RKIP表達的減少或缺失與有無淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)，RKIP可能參與了GCA的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。

NF-κB是來源于Re1家族的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于哺乳動物處于靜止期的細胞中，以非活化形式存在于細胞質(zhì)中，它具有調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡、調(diào)節(jié)免疫和炎性反應(yīng)的作用。以往研究［16］表明，RKIP參與了NF-κB信號通路的調(diào)控，抑制RKIP能增強NF-κB的轉(zhuǎn)錄，而過表達RKIP能減少NF-κBp65基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄。這種作用不依賴絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK)通路，而是RKIP能與NF-κB激活途徑的4種激酶NIK、TAK1、IKKα和IKKβ相互作用。RKIP還可以抑制腫瘤壞死因子α誘導的NF-κB抑制物激酶活性，從而抑制NF-κB激活。有研究者運用免疫組化法檢測了 NF-κB 在結(jié)腸癌［21］、乳腺癌［22，23］及舌鱗狀細胞癌［24］組織中的表達，其在癌組織中的表達明顯高于正常組織，并與其組織學分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，且有增高趨勢。同樣，在對肝癌的研究中、NF-κBp65表達陽性患者1、3年生存率明顯低于陰性患者，提示NF-κBp65與腫瘤發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)［25］。本研究顯示，腺癌組NF-κB陽性表達率高于癌旁組，NF-κB陽性表達與GCA臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，GCA組織中RKIP與NF-κBp65表達呈負相關(guān)，本文結(jié)果與既往的研究結(jié)果一致。我們認為，GCA組織中RKIP表達下降時NF-κBp65表達增高可能是由于IκB激酶即 IKK，被激活后可鱗酸化 IκB，進而IκB降解釋放出NF-κB轉(zhuǎn)移入核啟動靶基因(如CyclinD1、c-myc和抗凋亡基因等)轉(zhuǎn)錄表達。當NF-κB被過度激活，定位于細胞核而不能返回細胞質(zhì)時，與細胞核內(nèi)特定基因啟動子區(qū)域位點結(jié)合，啟動靶基因轉(zhuǎn)錄而致表達增強。

總之，RKIP表達下調(diào)或缺失與GCA的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，RKIP表達減少或缺失可能通過上調(diào)NF-κBp65的表達促進GCA的侵襲和轉(zhuǎn)移，但其具體的作用機制還有待進一步研究。

［1］周琦，王立東.賁門癌的生物學特征［J］.華人消化雜志，1998，6(7):636-637.

［2］Robinson LA，Preksto D.Pleural tenting during upper lobectomy decreases chest tube time and total hospitalization days［J］.J Thorac Cardivasc Surg，1998，15(2):319-326.

［3］Trakul N，Rosner MR.Modulation of the MAP kinase signaling cascade by Raf kinase inhibitory protei［J］.Cell Res，2005，15(1):19-23.

［4］Gems D，F(xiàn)erguson CJ，Robertson BD，et al.An abundant transspliced mRNA from toxocara canis infecti ve larvae encodes a 26-kDa protein with homology to phosphatidylethanolamine-binding proteins［J］.J Biol Chem，1995，270(31):18517-18522.

［5］Pikielny CW，Hasan G，Rouyer F，et al.Members of a family of drosophila putative odorant-binding proteins are expressed in different subsetsofolfactoryhairs［J］.Neuron，1994，12(1):35-49.

［6］Fu Z，Smith PC，Zhang L，et al.Effects of raf kinase inhibitor protein expression on suppression of prostate cancer metastasis［J］.Natl Cancer Inst，2003，95(12):878-889.

［7］周曉彬，紀新強，徐莉.PPMS1.5統(tǒng)計軟件的功能及其應(yīng)用［J］.青島大學醫(yī)學院學報，2009，45(1):91-93.

［8］楊乃昔，高宗，衛(wèi)功銓，等.食管癌和賁門癌切除術(shù)后切緣有癌殘留的94 份分析［J］.中國腫瘤臨床，1986，13(1):8-9.

［9］PowellJ，McConky CC.Increasing incidence of adenocarcinoma of the gastric cardia and adjacent sites［J］.Br J Cancer，1990，62(3):440-443.

［10］Blot WJ，Devesa SS，Kneller RW，et al.Rising incidence of adenocarcinoma of the esophagus and gastric cardia［J］.JAMA，1991，265(10):1287-1289.

［11］Blot WJ，Devesa SS，F(xiàn)raumeni JF Jr.Continuing climb in rates of esophageal adenocarcinoma:an update［J］.JAMA，1993，270:1320-1323.

［12］Pera M，Cameron AJ，Trastek VF，et al.Increasing incidence of adenocarcinoma of the esophagus and esophagastric junction［J］.Gastroenterology，1993，104(2):510-513.

［13］Morales TG，Sampliner RE，Bhattacharya A.Intestinal metaplasia of the gastric cardia［J］.Am J Gastroenterol，1997，92(11):14-18.

［14］Yeung K，Seitz T，Li S，et al.Suppression of Raf-1 ki-nase activity and MAP kinase signalling by RKIP［J］.Nature，1999，401(6749):173-177.

［15］Lorenz K，Lohse MJ，Quitterer U.Protein kinase C switches the Raf kinase inhibitor from Raf-1to GRK-2［J］.Narure，2003，426(6966):574-579.

［16］Yeung KC，Rose DW，Dhillon AS，et al.Raf kinase inhibitor protein interacts with NF-κB-inducingkinaseand-TAK1 and inhibits NF-κB a:tivation［J］.Mol Cell Biol，2001，21(21):7207-7217.

［17］Keller ET，F(xiàn)u Z，Brennan M.The biology of a pros-tate cancer metastasis suppressor protein:rafkinase inhibitor portein［J］.Cell Bichem，2005，94(2):273-278.

［18］Fu Z，Kitagawa Y，Shen R，et al.Metastasis suppressor gene Raf kinase inhibitor protein(RKIP)is a novel prognostic marker in prostate cancer［J］.Prostate，2006，66(3):248-256.

［19］Schuierer MM，Bataille F，Hagan S，et al.Re-duction in Raf kinase inhibitor protein expressionis associated with increased Ras-extracellular signal-regulated kinase signa-ling in melanoma cell lines［J］.Cancer Res，2004，64(15):5186-5192.

［20］Hagan S，AL-Mulla F，Mallon E，et al.Reduction of Raf-1 kinase inhibitor protein expression correlates with breast cancer metastasis［J］.Clin Cancer Res，2005，11(20):7392-7397.

［21］何曉彬，賴敏.NF-κB、Notch-1和Ki-67在結(jié)腸癌中的表達及其意義［J］.重慶醫(yī)學，2012，41(3):230-232.

［22］劉永源，張英，趙同作，等.乳腺癌組織中核轉(zhuǎn)錄因子-κB的表達及臨床意義［J］.實用醫(yī)學雜志，2009，25(16):2692-2693.

［23］姚志強，周鴻飛，崔明.RKIP、NF-κBp65蛋白在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義［J］.江西醫(yī)藥，2010，45(12):1185-1188.

［24］路學文，李新明，蔡留意，等.核因子-κB/p65 siRNA介導的舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞凋亡及相關(guān)分子機制［J］.口腔醫(yī)學研究，2011，27(9):744-748.

［25］杜寶玲，張征宇，馬寧芳.Bcl-2和核因子-κB在肝癌與癌旁組織的表達及其臨床預(yù)后的相關(guān)性［J］.新醫(yī)學，2009，40(11):737.