李杰，王春梅

北京中醫(yī)藥大學(xué)生物制藥系，北京 100102

紫杉醇 (Paclitaxel，商標(biāo)名為 Taxol) 是 20世紀(jì)70年代由Wani等從Taxus brevifoliaNutt樹皮中提取出來的具有獨(dú)特抗癌作用的天然產(chǎn)物。從1992年獲得美國FDA認(rèn)證以來，紫杉醇以其對乳腺癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌等多種癌癥的療效，成為化療的首選藥物。直接從紅豆杉樹皮中提取紫杉醇產(chǎn)量極低，每3 kg樹皮只能提取約300 mg的紫杉醇[1]，因此，通過直接提取獲得數(shù)量可觀的紫杉醇將對紅豆杉造成毀滅性的影響。目前紫杉醇的藥源主要來自化學(xué)半合成，但化學(xué)半合成法產(chǎn)率和選擇性不高，代價昂貴，而且原料依然來自植物組織，對提高紫杉醇產(chǎn)量造成一定限制[2]。獲得紫杉醇的途徑還有化學(xué)全合成、植物細(xì)胞培養(yǎng)或內(nèi)生真菌的培養(yǎng)。植物細(xì)胞培養(yǎng)的方法穩(wěn)定性低、放大培養(yǎng)困難且目的產(chǎn)物含量低，目前還沒有工業(yè)化的報道[3-5]?；瘜W(xué)全合成的方法產(chǎn)率低，很難應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)[2,6-19]。內(nèi)生真菌生產(chǎn)雖具有生產(chǎn)周期短、操作簡單的優(yōu)勢，但產(chǎn)量低、不穩(wěn)定的問題亟待解決[20]。自從青蒿素的組合生物合成取得巨大進(jìn)展[21]，紫杉醇的生物合成途徑逐漸闡明，人們對利用組合生物合成的方法獲得紫杉醇也寄予厚望。研究人員已經(jīng)在大腸桿菌、酵母、小立碗蘚、擬南芥、番茄和人參等體系對紫杉醇的組合生物合成進(jìn)行了探索，對各個體系的研究均取得了一定的成果。本文以不同體系為線索綜述了紫杉醇組合生物合成的研究進(jìn)展，并探討了未來可能的研究方向和方法，希望最終實現(xiàn)紫杉醇組合生物合成的產(chǎn)業(yè)化。

紫杉醇的生物合成過程已基本清楚[22]，如圖1所示，以異戊烯焦磷酸 (Isopentenyl pyrophosphate，IPP) 和二甲基丙烯基焦磷酸(Dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP) 為分界線，紫杉醇的生物合成過程可以人為地分為兩個部分：上游途徑和下游途徑。

紫杉醇生物合成機(jī)制的逐步明確，為紫杉醇在異源體系中的組合表達(dá)奠定了充分的基礎(chǔ)。目前，紫杉醇的組合生物合成在不同體系的研究進(jìn)展如下。

1 大腸桿菌

大腸桿菌遺傳背景清楚，可用的商業(yè)載體豐富，因此大腸桿菌是目前合成生物學(xué)研究最多的底盤細(xì)胞。在大腸桿菌中建立紫杉醇生物合成的路徑并最終用于生產(chǎn)是科學(xué)家們努力的方向。由于大腸桿菌中存在MEP途徑，自身可以合成IPP和DMAPP，能夠為下游途徑提供原料，所以研究者對大腸桿菌的改造主要在于將 DXPS(1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶)、DXR (1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶)、IDI (Isopentenyl diphosphate isomerase，異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶)以及下游途徑中 GGDPS (Geranylgeranyl diphosphate synthase，香葉基香葉基焦磷酸合酶)、TS (Taxadiene synthase，紫杉烯合酶) 和T5αH (Taxadiene-5-alpha-hydroxylase，紫杉烯-5α-羥基化酶) 基因整合到大腸桿菌中并過表達(dá)。研究者使用的策略如下：

1.1 上游途徑中關(guān)鍵酶的過表達(dá)

圖1 紫杉醇生物合成過程概覽[22]Fig. 1 Overview of the Taxol biosynthetic pathway. The biogenesis of Taxol can be artificially divided into two processes： the upstream isoprenoid pathway (MVA pathway or MEP pathway) and a heterologous downstream terpenoid pathway. The dotted line separates the two parts. The underlined enzymes indicate the enzyme has been modified. For more details refer to the relevant review [22].

在上游MEP途徑中，DXPS、IDI是關(guān)鍵酶，對途徑末端IPP和DMAPP的產(chǎn)量有決定性的影響。有實驗室將大腸桿菌內(nèi)源性的DXPS基因和IDI基因、來自辣椒Capsicum annuum的GGDPS基因以及中國紅豆杉的TS基因在大腸桿菌中共表達(dá)[23]，GC-MS分析得到了代謝產(chǎn)物taxa-4(5),11(12)-diene。但是，研究者發(fā)現(xiàn)，4個基因共表達(dá)時彼此相互影響，推測其原因可能是DXPS和 GGDPS的表達(dá)對宿主菌有一定的毒性，或者是這4個基因同時在同一個工程菌中誘導(dǎo)表達(dá)時可能導(dǎo)致能量代謝障礙。另有研究組[24]在大腸桿菌中共表達(dá)大腸桿菌內(nèi)源性的 DXPS和IDI、來自草生歐文菌的GGDPS和來自太平洋紅豆杉的 TS，結(jié)果表明，4種酶同時過表達(dá)可以得到1.3 mg/L的taxa-4(5),11(12)-diene，是只過表達(dá) IDI、GGDPS和 TS的紫杉烯產(chǎn)量的2.6倍。

同一載體中外源基因的排列順序會影響這些基因功能的發(fā)揮。Lü等[25]構(gòu)建了含有銀白楊異戊二烯合酶的載體 pET-32a，同時又將 MEP途徑中的3個關(guān)鍵酶——DXS、DXR和IDI的基因按照不同的順序 (3種基因共有6種排列順序)插入到pET-30a載體上，將前者和含有不同順序的后者同時導(dǎo)入到大腸桿菌中，經(jīng)過誘導(dǎo)后分析萜類物質(zhì)的產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)：導(dǎo)入兩種載體的大腸桿菌與只導(dǎo)入含有異戊二烯合酶基因載體的大腸桿菌相比，萜類物質(zhì)的產(chǎn)量的確有不同程度的提高。而且有趣的是，含有按照 T7 Pro—dxs—dxr—idi順序構(gòu)建載體的菌株中，萜類物質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到最大，能夠達(dá)到2.721 mg/(g·h)，而更改這3個基因的順序之后，萜類物質(zhì)的產(chǎn)量均有所下降。

1.2 游離酶蛋白溶解性的提高

在紅豆杉細(xì)胞中，成熟的TS含有信號肽，在幫助其到達(dá)液泡后被切掉，但是這一段信號肽的存在影響了TS的溶解性，繼而影響到了酶活性的發(fā)揮。為了提高TS的溶解性，Huang等[24]在非細(xì)胞體系中使用去除了前 78個氨基酸的“假熟體”TS (即不含信號肽)，使之成為幾乎完全可溶的蛋白，在正常表達(dá)量的IDI和GGDPS存在的情況下，幾乎使100%的IPP轉(zhuǎn)變?yōu)镚GDP，而只有 70%的 GGDP轉(zhuǎn)變?yōu)?taxa-4(5),11(12)-diene。后者效率降低的原因可能為GGDP上磷酸的水解或者是產(chǎn)物的抑制作用。Huang等[24]除了獲得可溶性TS之外，還獲得了兩種活性同時存在的 IDI和 GGDPS的融合蛋白，這樣做同樣增加了這兩種蛋白的溶解性。在 1 L細(xì)胞培養(yǎng)液中得到 0.5 mg的 taxa-4(5),11(12)-diene。

1.3 “多元模塊通路工程”的建立

前期試驗是建立在從 IPP或 DMAPP到GGDP再到taxa-4(5),11(12)-diene是線性行為這一假設(shè)上的，于是在大腸桿菌內(nèi)依次過表達(dá)這一線性過程上的基因就可以提高這一條線上的代謝流，從而提高taxa-4(5),11(12)-diene的產(chǎn)量[23]。然而，這種提高是有限的，原因是它忽視了一些其他因素，比如中間代謝產(chǎn)物對細(xì)胞是否有毒、用于表達(dá)的載體對細(xì)胞是否有不利影響，以及是否在對細(xì)胞改造之后出現(xiàn)隱藏代謝通路從而彌補(bǔ)主要代謝通路或者抑制目的分子的產(chǎn)量。于是，有人[2]提出了“多元模塊通路工程”，即將上下游途徑作為兩個相對獨(dú)立的模塊，利用代謝工程的方法來平衡上下游模塊中碳元素的代謝平衡，使紫杉烯的產(chǎn)量達(dá)到最大優(yōu)化。同時，這種方法還需考慮啟動子的強(qiáng)度 (T7、T5和trc)、不同基因 (分別位于染色體或質(zhì)體) 的拷貝數(shù)以及溫度對宿主的影響，綜合各個方面的最優(yōu)條件之后，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)利用T7啟動子啟動的低拷貝的質(zhì)粒最有利于紫杉烯的生產(chǎn)，其產(chǎn)量與對照相比可以提高15 000倍，達(dá)到1.02 g/L左右。更為可觀的是，這個結(jié)果是在較大規(guī)模的分批式發(fā)酵罐中得到的，這對于將研究成果推向工業(yè)化無疑是一個重大突破。

1.4 細(xì)胞色素氧化酶和還原酶的成對引入

Ajikumar等[2]首次利用代謝工程的方法在大腸桿菌中使紫杉烯的表達(dá)量達(dá)到最優(yōu)化，使人們看到了代謝工程的巨大潛力。但是，將同樣的方法運(yùn)用到后面的步驟中還有一些困難：首先，細(xì)胞色素P450酶系在植物細(xì)胞中是錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的，而大腸桿菌沒有細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)，這就使得在大腸桿菌中成功表達(dá)這種酶的難度增加了很多。其次，每個P450氧化酶都需要一個特定的與之配對的P450還原酶來傳遞電子，從而完成氧化還原反應(yīng)，而大腸桿菌中同樣沒有P450還原酶系。為了解決這兩個問題，Ajikumar在T5αH的基因中截去表達(dá)跨膜區(qū)域蛋白的密碼子，同時對與之配對的P450還原酶也進(jìn)行改造，將其 N端的跨膜區(qū)域也截去，并將兩種酶通過連接肽連在一起組成融合蛋白。以大腸桿菌中兩種酶的融合蛋白代替紅豆杉中原本定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的這兩種酶的功能，巧妙地將對紫杉烯的氧化反應(yīng)引入到了大腸桿菌中，使得taxadiene-5α-ol的產(chǎn)量達(dá)到 58 mg/L，達(dá)到了酵母中產(chǎn)量的2 400倍。

1.5 提高紫杉醇前體物質(zhì)的產(chǎn)量需要注意的其他條件

1.5.1 適合生產(chǎn)紫杉烯菌株的選擇

Ajikumar的研究中選用的菌株是大腸桿菌MG1655的衍生株系。然而在這個株系的紫杉烯合成通路中還存在著一個十分復(fù)雜的、非線性的調(diào)控機(jī)制，涉及到更多細(xì)胞的代謝產(chǎn)物。同樣作為大腸桿菌，不同株系的細(xì)胞里代謝通路有或多或少的差異，Boghigian等[26]發(fā)現(xiàn)，在B株系和K株系的大腸桿菌中分別構(gòu)建從IPP或DAMPP到taxa-4(5),11(12)-diene的代謝通路。在B株系中，丙酮酸激酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的表達(dá)都上調(diào)了，使得 B株系中丙酮酸量減少，使得下游的紫杉烯產(chǎn)量相應(yīng)地減少；同時，K株系中，磷酸果糖激酶I的基因表達(dá)顯著上調(diào)，使得更多的代謝流流向 3-磷酸-甘油醛這一萜類代謝通路的又一個直接前體，增加了紫杉烯的產(chǎn)量。因此，K株系的菌株比 B株系本身更適合作為合成紫杉醇的對象。

1.5.2 適合紫杉烯積累最適溫度的選擇

溫度可以顯著影響大腸桿菌內(nèi)聚酮化合物的產(chǎn)量[27]，在紫杉烯的生產(chǎn)中也不例外。比較K株系和 B株系生產(chǎn)紫杉烯的實驗中，在培養(yǎng)溫度22 ℃這一最佳溫度下，紫杉烯的產(chǎn)量達(dá)到了最大值。

2 酵母

大腸桿菌是應(yīng)用最為廣泛的原核表達(dá)載體，但由于大腸桿菌在組合表達(dá)較多基因時存在能量代謝障礙、篩選標(biāo)記少、質(zhì)粒缺乏足夠的兼容性、沒有完整的細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)等問題，使其應(yīng)用受到局限。而酵母作為宿主具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：1)酵母中有類異戊二烯途徑——MVA途徑(Mevalonate，甲羥戊酸)，可提供GGDP用于合成紫杉醇中間體；2) 能提供充足的NADPH，參與代謝反應(yīng)；3) 在發(fā)酵條件下容易生長，適應(yīng)力強(qiáng)；4) 沒有致病性；5) 可以產(chǎn)生有功能的Ⅱ型 P450單加氧酶[28-29]。6) 具有完整的細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)，能確保與紫杉醇生物合成相關(guān)的羥基化酶基因的共表達(dá)；7) 有多個營養(yǎng)缺陷型供選擇，并有多個選擇標(biāo)記可供使用。酵母被用作組合生物合成的宿主具有較強(qiáng)的應(yīng)用前景。

利用酵母進(jìn)行紫杉醇組合生物合成的研究主要集中在上游途經(jīng)的關(guān)鍵酶 HMGR(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，3-羥甲基戊二酰輔酶A還原酶) 和下游途徑中的GGDPS、TS、T5αH、TAT (Taxadien-5α-ol-O-acetyltransferase，紫杉烯 5α-氧-乙酰基轉(zhuǎn)移酶) 及 T10βH(Taxadien-10β-hydroxylase，紫杉烯 10β-羥基化酶)的改造。研究者使用了以下策略：

2.1 啟動子的優(yōu)化

釀酒酵母內(nèi)源性的GGDP水平較低，其合成途徑中的 HMGR將 HMG催化還原成 MVA是釀酒酵母內(nèi)源性的類異戊二烯/固醇途徑中的重要限速反應(yīng)。王偉等[30]利用組成型表達(dá)的乙醇脫氫酶基因啟動子來啟動HMGR基因的表達(dá)，從而消除了這一限速反應(yīng)，增加了MVA途徑的代謝流，使得GGDP的產(chǎn)量提高。從而為紫杉烯合酶提供更多的催化底物，并使其與中國紅豆杉紫杉烯合酶基因共同表達(dá)，在酵母細(xì)胞中成功建立了一個合成紫杉烯的代謝途徑。DeJong等[31]將紫杉醇生物合成中的 5種酶GGDPS、TS、T5αH、T10βH 和 TAT 共同轉(zhuǎn)到酵母細(xì)胞中成功進(jìn)行了功能性表達(dá)，試圖建立紫杉醇生物合成途徑中從 IPP到 taxdiene-5αacetate-10β-ol的組合生物合成途徑。最終得到紫杉烯 1.0 mg/L，而 T5αH 催化作用的產(chǎn)物taxadien-5a-ol的產(chǎn)量只有微量的25 μg/L，沒有檢測到TAT和T10βH作用的產(chǎn)物。作者將T5αH基因的組成型啟動子GPD換成可誘導(dǎo)的GAL1啟動子，得到的 T5αH約是之前的 5倍。研究者預(yù)測如果將 T5αH基因置于 GAL1調(diào)控下，同時與紅豆杉還原酶共表達(dá)將至少使 5α-羥基化步驟的代謝流增加10倍。

2.2 流向甾醇代謝流的控制

Engels等[32]在研究中使用兩種方法減少代謝流向甾醇，一是引入 HMGR的一個同工酶upc2.1等位基因，它表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子 UPC2.1，可以使酵母在有氧條件下也從環(huán)境中吸收類固醇，從而抑制了類固醇的合成，使代謝流向紫杉醇途徑；二是以嗜酸熱硫化葉菌的GGDPS代替中國紅豆杉的GGDPS，前者以IPP和DMAPP為底物，后者以FPP (Farnesyl pyrophosphate，法尼基焦磷酸) 為底物，而角鯊烯也以FPP為底物，通過連續(xù)添加DMAPP合成GGDP，避免了與類固醇途徑競爭FPP，結(jié)果香葉基香葉醇增加較多。

2.3 密碼子的優(yōu)化

提高表達(dá)常用的一個策略就是改變目的基因的稀有密碼子，使之更接近于宿主細(xì)胞的密碼子使用方式，而不改變所編碼蛋白的氨基酸序列。研究發(fā)現(xiàn)對 TS密碼子進(jìn)行優(yōu)化，taxa-4(5),11(12)-diene在酵母中的產(chǎn)量增加了約40倍，達(dá)到 (8.7±0.85) mg/L，而香葉基香葉醇的表達(dá)量達(dá)到 (33.1±5.6) mg/L，表明紫杉烯的表達(dá)量可以達(dá)到更高，這是迄今為止在酵母中紫杉烯表達(dá)量最大的報道[32]。

2.4 生物合成基因簇的構(gòu)建

考慮到釀酒酵母等外源表達(dá)體系有限的選擇標(biāo)記以及染色體的插入會阻礙重建途徑的后續(xù)修飾，Dahm等[33]應(yīng)用SOE-PCR和體外同源重組的方法在酵母中建立了一個生物合成基因簇，實現(xiàn)了來自嗜酸熱硫化葉菌的 GGDPS、酵母的HMGR以及優(yōu)化了密碼子的TS的3個蛋白的協(xié)同表達(dá)。

2.5 與T10βH同源的細(xì)胞色素還原酶的同時表達(dá)

細(xì)胞色素P450氧化酶催化的反應(yīng)是通過電子傳遞系統(tǒng)，將電子從NAD(P)H轉(zhuǎn)移到微粒體系統(tǒng)中的NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶，或鐵氧蛋白還原酶，然后到細(xì)胞色素P450氧化酶；這樣使得分子氧還原活化，隨后將一個氧原子插入底物。其中細(xì)胞色素P450還原酶 (Cytochrome P450 reductase，CPR) 是細(xì)胞色素P450酶系中重要的功能單位。在生物體內(nèi)，細(xì)胞色素 P450還原酶是細(xì)胞色素 P450氧化酶主要的電子供體，它與細(xì)胞色素P450氧化酶電子傳遞反應(yīng)是細(xì)胞色素 P450氧化酶氧化還原反應(yīng)的限速步驟。CPR將電子供體NAD(P)H的電子經(jīng)過FAD和FMN兩個輔基傳遞給細(xì)胞色素P450氧化酶，然后細(xì)胞色素P450氧化酶才能與底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)。有兩個因素可能降低細(xì)胞色素 P450氧化酶的催化效率，一是酵母CPR量的不足，另一個是酵母CPR和植物P450的電子傳遞效率不匹配，可能無法支持P450的最大催化活性。這種情況下，需要加入內(nèi)源 CPR來提高細(xì)胞色素P450氧化酶活性。將T10βH基因與紅豆杉還原酶基因在酵母中共表達(dá)時，與只有內(nèi)源性的酵母還原酶存在的情況相比，T10βH的催化活性增加了6倍，說明將紅豆杉還原酶與同源的細(xì)胞色素P450紫杉烯羥基化酶共表達(dá)在微生物中重建紫杉醇合成途徑是很重要的一步[34]。

3 小立碗蘚

與微生物表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比，作為苔蘚植物的小立碗蘚由于其在進(jìn)化地位上的優(yōu)勢使得它兼具了二者的優(yōu)勢，不但具有前者的基因操作的簡便性和高產(chǎn)性，而且同樣具有哺乳細(xì)胞的對產(chǎn)物的更復(fù)雜的折疊和翻譯后修飾。小立碗蘚還能夠彌補(bǔ)二者的不足，本身含有的合成次生代謝產(chǎn)物的酶系更加發(fā)達(dá)，擁有比酵母中還要完善的萜類物質(zhì)代謝通路，如類胡蘿卜素、赤霉素、質(zhì)體醌和多種維生素這些以 GGDP為代謝起點(diǎn)的物質(zhì)，為生產(chǎn)更加豐富的代謝產(chǎn)物提供了較為完善的代謝通路。同時，植物表達(dá)體系還消除了潛在的來自哺乳細(xì)胞的毒性[35-36]。

以苔蘚植物作為表達(dá)體系的研究已經(jīng)有人嘗試。Anterola等[35]將TS基因?qū)胄×⑼胩\中，應(yīng)用泛素啟動子作為啟動子，產(chǎn)生了taxa-4(5),11(12)-diene，并且證明，在穩(wěn)定的小立碗蘚轉(zhuǎn)化子中，taxa-4(5),11(12)-diene的含量可以達(dá)到組織濕重的0.05%。

與擬南芥、番茄和煙草等高等植物表達(dá)系統(tǒng)相比，盡管在番茄中紫杉烯的產(chǎn)量已經(jīng)與從紅豆杉針葉中提取的產(chǎn)量相當(dāng)，但是轉(zhuǎn)基因的擬南芥和番茄生長明顯慢于野生型，使得生產(chǎn)周期明顯延長。而且，在轉(zhuǎn)基因煙草中共表達(dá)TS和T5αH的同時，沒有得到預(yù)期產(chǎn)物 taxadien-5α-ol，卻得到副產(chǎn)物5(12)-oxa-3(11)-cyclotaxane。這兩個難題的存在阻礙了高等植物體系中紫杉醇生物合成的研究[35]。小立碗蘚具有非常高的同源重組率，達(dá)到了 10–3–l0–4，為紫杉醇生物合成基因的整合提供保證。除此之外，小立碗蘚具有相對簡單的發(fā)育模式和較短的生長周期，有利于規(guī)?；囵B(yǎng)和突變體的篩選，其生活史世代以單倍體的配子體形態(tài)為主，這利于突變的產(chǎn)生和遺傳性狀的直接分析[37]。

鑒于小立碗蘚系統(tǒng)用于紫杉醇組合生物合成具有如此明顯的優(yōu)勢，本實驗室擬在小立碗蘚中建立紫杉醇的生物合成路徑。外源基因可以被整合在小立碗蘚的基因組中或者葉綠體的基因組中，因為葉綠體系統(tǒng)相比于核轉(zhuǎn)化系統(tǒng)有性狀穩(wěn)定、不易交叉感染，外源基因拷貝數(shù)多，沒有位置效應(yīng)，沒有基因沉默和可以同時表達(dá)多個基因等特點(diǎn)[38]。因此，本實驗室選擇小立碗蘚的葉綠體系統(tǒng)作為紫杉醇生物合成酶的表達(dá)系統(tǒng)。本實驗室已將紫杉醇生物合成的關(guān)鍵酶 10-去乙酰巴卡亭 III-10-氧-乙酰轉(zhuǎn)移酶 (10-DeacetylbaccatinIII-10-O-acetyl transferase，DBAT) 基因轉(zhuǎn)入小立碗蘚葉綠體中表達(dá)，項目正在進(jìn)行中，希望通過將紫杉醇生物合成酶逐個轉(zhuǎn)化小立碗蘚，最終實現(xiàn)紫杉醇在小立碗蘚中的生產(chǎn)。

4 擬南芥

擬南芥是研究最多的模式植物之一。Besumbes等[39]在擬南芥中首先表達(dá)了歐洲紅豆杉中缺少質(zhì)體定位信號肽、同時又在 C端融合了His標(biāo)簽的TS，這種方法檢測到了taxa-4(5),11(12)-diene的積累，盡管量很少，但同時導(dǎo)致了轉(zhuǎn)化植株中那些以 GGDP為底物合成的異戊二烯化合物如光合色素的下降。這樣的結(jié)果不排除紫杉烯本身對植株的毒性，更為可信的說法是因為TS的組成型表達(dá)會影響內(nèi)源GGDP代謝的平衡，與那些以GGDP為底物的代謝途徑競爭而使植株本身正常生長受到影響。組成型表達(dá)產(chǎn)生的相對較少的taxa-4(5),11(12)-diene積累表明TS的過表達(dá)沒有有效地使產(chǎn)生的GGDP向萜類合成的途徑中流動。于是作者又使用了糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型的表達(dá)系統(tǒng)，即用地塞米松誘導(dǎo) TS在擬南芥成熟葉片中表達(dá)。實驗結(jié)果很令人振奮，在誘導(dǎo)后的植株中檢測到了 taxa-4(5),11(12)-diene的表達(dá)，產(chǎn)量達(dá)到600 ng/g干重。

5 番茄

番茄果實中含有豐富的類胡蘿卜素，其中使番茄呈現(xiàn)紅色的類胡蘿卜素就是番茄紅素。在番茄果實中，番茄紅素的合成起始于兩個分子GGDP的連接形成phytoene，八氫番茄紅素。而紫杉烯生物合成的直接底物同樣也是GGDP，兩種物質(zhì)的代謝途徑擁有共同的底物。因此，如果在紅色果實中構(gòu)建紫杉烯的代謝途徑必然會與番茄紅色競爭底物使得紫杉烯的產(chǎn)量減少。Kovacs等[40]在黃色果實的番茄株中，成功構(gòu)建了含有TS基因的表達(dá)載體，利用土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄植株，在每1 kg凍干的果實中可以得到160 mg的taxa-4(5),11(12)-diene。與紅色果實的番茄植株相比，黃色果實的番茄植株有兩個天然的優(yōu)勢：第一，由于黃色果實中沒有番茄紅素合酶，這樣就可以使更多的 GGDP進(jìn)入合成紫杉烯的代謝通路中，為紫杉烯的合成提供更多的原料；第二，用于提取紫杉烯的溶劑在紅色果實的番茄植株中同樣可以提取到類胡蘿卜素，使兩種物質(zhì)無法分開，而在黃色果實中的類胡蘿卜素很少，而含量較多的黃酮類物質(zhì)又恰好不溶于己烷(紫杉烯溶于己烷)。這樣，就為紫杉烯的提取和下游操作提供了方便。

6 人參

由于在人參中本身就存在萜類的代謝途徑，而且人參根培養(yǎng)的方法也較為成熟，使得對人參向著合成紫杉烯的方向進(jìn)行改造相對比較方便，而且能夠進(jìn)一步提高紫杉烯的產(chǎn)量。目前，已將TS基因整合到人參根細(xì)胞基因組中并進(jìn)行了表達(dá)，taxa-4(5),11(12)-diene的產(chǎn)量[41]達(dá)到了9.1 μg/g干重。在對轉(zhuǎn)化植株經(jīng)過茉莉酸甲酯的處理后，taxa-4(5),11(12)-diene的產(chǎn)量可以提高到15.9 μg/g干重。在獲得比苔蘚和番茄還要高產(chǎn)的紫杉烯的同時，植株本身的表型與野生型相比沒有明顯的差異。這一點(diǎn)使得人參成為了很有潛力的表達(dá)系統(tǒng)。

7 討論與展望

從以上的研究進(jìn)展可以看出，在大腸桿菌和酵母中，組合生物合成紫杉醇已經(jīng)可以從萜類共同前體IPP開始進(jìn)行到taxadien-5α-ol；而在小立碗蘚、擬南芥、番茄和人參中卻只得到了taxa-4(5),11(12)-diene。在大腸桿菌和酵母中對途經(jīng)的優(yōu)化研究主要集中在通過改造上游途經(jīng)的關(guān)鍵酶來增加IPP的產(chǎn)量和對下游途徑中TS的改造，而對此后的研究比較少；在植物表達(dá)系統(tǒng)的研究缺乏對上游途徑的優(yōu)化。因此在不同體系中合成紫杉醇還有很多工作有待深入，進(jìn)一步的工作可以考慮以下幾個方面。

對于大腸桿菌和酵母體系來說，它們中存在典型的MVA或MEP代謝途徑，研究者已經(jīng)通過對上游途經(jīng)中關(guān)鍵酶如DXS、DXR、HMGS、HMGR的改造，獲得了高產(chǎn)的IPP和DMAPP，為下游途徑提供了足夠的原料。因此，接下來的研究可把重點(diǎn)放在對下游途徑的改造中，尤其是需要引入在taxadiene-5α-ol之后的一系列羥化和?；磻?yīng)的酶，從而推進(jìn)紫杉醇的組合生物合成。在大腸桿菌中，Ajikumar等已經(jīng)將T5aH和與其對應(yīng)的細(xì)胞色素還原酶成功引入到大腸桿菌中，使得taxadiene-5α-ol的產(chǎn)量比在酵母中的產(chǎn)量更高，達(dá)到58 mg/L[2,32]。但是在大腸桿菌中還沒有將TAT或T10βH與上游的酶一同轉(zhuǎn)入的嘗試，使得紫杉醇在該體系中的生物合成只停留在 taxadiene-5α-ol這一步。而在酵母中，DeJong等[31]雖然已經(jīng)將TAT和T10βH引入體系中，但由于紫杉醇生物合成的代謝流容易在T5αH受到阻礙，使得taxadien-5a-ol的產(chǎn)量很少，更無法檢測到下游產(chǎn)物。Ajikumar和DeJong的研究組分別將T5αH、T10βH引入到大腸桿菌和酵母中，并且發(fā)現(xiàn)在引入這兩種羥基化酶的同時，引入與之同源的還原酶可以得到更多的產(chǎn)物。由于在紫杉醇生物合成的過程中，大多數(shù)的反應(yīng)都是由細(xì)胞色素氧化酶參與的羥化反應(yīng)，因此，每一個細(xì)胞色素氧化酶必然伴隨著與它同源的還原酶同時引入到體系中。所以，在這兩種體系中，研究者下一步需要努力的就是將參與反應(yīng)的細(xì)胞色素酶成對引入到體系中去。

研究專門適用于合成生物學(xué)的新型菌株：大腸桿菌和酵母都是開發(fā)研究較早的工業(yè)微生物，并且應(yīng)用于多種代謝工程，但是將它們用于合成生物學(xué)的潛力還未充分發(fā)揮出來。Siddiqui等[42]綜述了將酵母生物學(xué)與合成生物學(xué)相結(jié)合使釀酒酵母成為構(gòu)建次生代謝物途徑的微生物宿主的發(fā)展。認(rèn)為將來需要更多地借助于合成生物學(xué)的方法和工具，將一些新的特征整合入異源的代謝途徑，構(gòu)建產(chǎn)天然產(chǎn)物的酵母菌株。同時認(rèn)為可以構(gòu)建產(chǎn)大量前體物質(zhì)的酵母菌株，這些菌株的細(xì)胞或細(xì)胞器的運(yùn)輸能力可能改變，但將更有利于底物的吸收、中間體的貯存以及產(chǎn)物的輸出。從近年的研究可以看到有些用于生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物的新型酵母也已經(jīng)構(gòu)建出來，或者正處于研究階段。例如Ignea等[43]應(yīng)用可循環(huán)的集成盒的方法，產(chǎn)生了具有更強(qiáng)的生產(chǎn)植物萜類的新型酵母菌株。

解除或減少副產(chǎn)物對主要產(chǎn)物的抑制作用：在大腸桿菌中構(gòu)建合成紫杉烯代謝通路的實驗中，副產(chǎn)物吲哚一直是一個十分難解決的問題，越是紫杉烯高產(chǎn)的菌株，受到吲哚的影響就越大[26]。盡管紫杉烯和吲哚相互影響的機(jī)制還不清楚，但是從減少副產(chǎn)物吲哚這個角度入手，無疑可以對紫杉烯產(chǎn)量的提高起到促進(jìn)作用。

解決多個基因共表達(dá)時互相影響和中間產(chǎn)物積累的問題[23]：在大腸桿菌中紫杉烯合成途徑中4個基因共表達(dá)時互相影響，導(dǎo)致終產(chǎn)物的減少，推測其原因可能是DXPS和GGDPS的表達(dá)對宿主菌有一定的毒性，或者是這4個基因同時在同一個工程菌中誘導(dǎo)表達(dá)時導(dǎo)致能量代謝障礙。另外，在檢測到主產(chǎn)物 taxa-4(5),11(12)-diene產(chǎn)生的同時，還檢測到其前體verticillene的積累，而且所占的比例較高。但中間體積累的原因還不清楚。

添加代謝途徑前體物質(zhì)增加產(chǎn)物產(chǎn)量：在培養(yǎng)基中添加代謝途徑的前體物質(zhì)是彌補(bǔ)代謝底物不足的有效方法。3-磷酸甘油醛和丙酮酸是MEP途徑的直接前體，通過中間體的添加，可以降低代謝途徑中中間體合成的能量消耗，從而促進(jìn)代謝流向目的產(chǎn)物。Ajikumar等[2]通過搖瓶發(fā)酵水平所獲得的代謝工程菌菌株26能夠利用葡萄糖或甘油合成異戊二烯，當(dāng)在連續(xù)補(bǔ)加總量為3 g/L甘油的合成培養(yǎng)基上利用補(bǔ)料批次發(fā)酵獲得紫杉烯的最大產(chǎn)量高達(dá)1 g/L。

借鑒其他萜類組合生物合成的研究成果和經(jīng)驗：萜類生物合成有共同的前體物質(zhì)和相似的途徑。目前對萜類物質(zhì)組合生物合成研究最深入的是青蒿素，從中我們可以借鑒一些經(jīng)驗用于紫杉醇的組合生物合成。以酵母中合成青蒿素為例，紫穗槐二烯是合成青蒿素的重要前體，而合成紫穗槐二烯底物即為 FPP。為了提高 FPP的量，通過對 FPP合成途徑依次進(jìn)行 5次基因改造：過表達(dá) HMGR，解除反饋抑制；利用一個methioninerepressible啟動子(PMET3)，對編碼鯊稀合酶 (固醇生物合成途徑中 FPP合成后第一步) 的ERG9基因進(jìn)行負(fù)調(diào)控，減少合成固醇類物質(zhì)的代謝流；過表達(dá) upc2-1 (一個可以加強(qiáng)UPC2 (啤酒酵母中調(diào)節(jié)固醇合成的一個的通用轉(zhuǎn)錄因子) 活性的半顯性突變體等位基因)；在酵母染色體更遠(yuǎn)處再轉(zhuǎn)進(jìn)一個HMGR拷貝；在細(xì)胞密度降低的情況下過表達(dá)編碼 FPP合酶的基因 (ERG20)，綜合應(yīng)用上述所有的策略，最終將紫穗槐二烯的合成量增加到了 153 mg/L，幾乎是之前報道的紫穗槐二烯合成量的500倍。萜類前體物質(zhì)在酵母中有共同的合成途徑，可以借助倍半萜類物質(zhì)青蒿素的組合生物合成中構(gòu)建的FPP合成途徑，通過提高底物FPP的產(chǎn)量增加taxa-4(5),11(12)-diene或紫杉醇的產(chǎn)量。將Ro等[44]構(gòu)建的該途徑與紫杉醇組合生物合成研究中的優(yōu)化策略相比，發(fā)現(xiàn)還可以通過下調(diào)編碼鯊烯合酶的ERG9、上調(diào)編碼FPP合酶的ERG20基因，或者改變細(xì)胞密度，提高 FFP的供應(yīng)，最終達(dá)到提高紫杉醇中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。

在植物表達(dá)體系中，除了加強(qiáng)對上游途經(jīng)改造來增加IPP和DMAPP的產(chǎn)量外，還有以下的策略可以運(yùn)用：

用誘導(dǎo)型的系統(tǒng)代替組成型的系統(tǒng)：在擬南芥中，利用誘導(dǎo)型的表達(dá)系統(tǒng)比組成型的系統(tǒng)取得了更好的效果[39]。組成型的系統(tǒng)由于組合在基因組中，從宿主細(xì)胞產(chǎn)生時就開始表達(dá)，勢必會與宿主初級代謝產(chǎn)物爭奪基礎(chǔ)物質(zhì)和能量，不僅使目的產(chǎn)物的產(chǎn)量減少，而且影響宿主細(xì)胞的生長。誘導(dǎo)型的系統(tǒng)可以充分考慮到時間和空間的選擇，使目的產(chǎn)物在合適的時期、合適的地點(diǎn)(比如不同細(xì)胞器) 進(jìn)行表達(dá)，不僅沒有影響宿主細(xì)胞的生長代謝，而且能使目的基因的產(chǎn)量提高，達(dá)到合理分配資源的效果。

多策略、新方法的綜合應(yīng)用：觀察紫杉醇在不同體系中的組合生物合成發(fā)現(xiàn)，這些研究綜合應(yīng)用了蛋白質(zhì)工程、代謝工程、合成生物學(xué)等策略設(shè)計微生物，來產(chǎn)生有價值的產(chǎn)物[45]。隨著諸如基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)等現(xiàn)代“組學(xué)”技術(shù)的建立，許多新的方法尤其是一些代謝工程的方法，例如通過克服限速步驟、減少流向競爭途徑的代謝流、降低分解代謝以及過量表達(dá)調(diào)節(jié)基因等都可以用來增加次級代謝物產(chǎn)量[46]。除此之外，利用計算模型預(yù)測影響代謝通路的基因，然后進(jìn)行這些基因缺失或高表達(dá)，進(jìn)行靶基因?qū)K產(chǎn)物合成的相關(guān)性分析。如Boghigian等[47]利用計算模型成功地鑒定了3個中心途徑靶基因，這3個基因的高水平表達(dá)能提高紫杉烯的產(chǎn)量。因此，綜合運(yùn)用多種方法，成為解決這類問題的必需手段。

隨著紫杉醇生物合成過程的逐步明確，其代謝調(diào)控機(jī)制的闡明，合成生物學(xué)方法的發(fā)展，相信在不遠(yuǎn)的將來，利用組合生物合成的方法生產(chǎn)紫杉醇將會成為現(xiàn)實。

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