卜攀攀，陳堅(jiān)，堵國(guó)成

江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

氨基甲酸乙酯 (Ethyl carbamate, EC) 早在1943年就被發(fā)現(xiàn)是一種致癌物質(zhì)[1-2]。自從1971年Lofroth等[3]在發(fā)酵食品中發(fā)現(xiàn)了氨基甲酸乙酯的存在以后，許多學(xué)者又先后在醬油、面包、蒸餾酒、白蘭地和威士忌等發(fā)酵食品與飲料中檢測(cè)到了氨基甲酸乙酯[4-8]。目前食品中氨基甲酸乙酯的危害已被認(rèn)為是繼黃曲霉毒素之后的又一重要食品安全問(wèn)題[8]。

氨基甲酸乙酯在食品發(fā)酵和長(zhǎng)期的貯藏過(guò)程中均可產(chǎn)生[9-10]。目前，人們主要是通過(guò)選育優(yōu)良菌株、控制發(fā)酵條件和向完成的發(fā)酵食品中添加脲酶[11-13]來(lái)控制氨基甲酸乙酯的形成。但是，由于氨基甲酸乙酯的化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，一旦形成就很難被降解，以致于氨基甲酸乙酯會(huì)在發(fā)酵食品中不斷地增加和積累。20世紀(jì)八九十年代，國(guó)外報(bào)道了一些關(guān)于氨基甲酸乙酯水解酶的研究[14-17]，氨基甲酸乙酯水解酶能將一分子的氨基甲酸乙酯水解為一分子的氨、二氧化碳和乙醇。但是，不同氨基甲酸乙酯水解酶的適宜工作環(huán)境不同，而且發(fā)酵食品的成分復(fù)雜，以致合適的氨基甲酸乙酯水解酶還未得到開(kāi)發(fā)。于是，研究氨基甲酸乙酯水解酶的性質(zhì)對(duì)其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用有著十分重要的參考意義。

我們已從小鼠的胃部分離獲得了一株產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶的肺炎克雷伯氏菌。超聲破碎后的粗酶液有良好的NaCl耐受特性，對(duì)于高鹽的醬油類(lèi)發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的消除有很高的參考價(jià)值。本研究利用硫酸銨沉淀、HiTrap Q FF和 Mono Q離子交換層析及Superdex 200 prep grade凝膠過(guò)濾層析實(shí)現(xiàn)了肺炎克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯水解酶的分離純化，并研究了該酶的理化性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶的肺炎克雷伯氏菌由本實(shí)驗(yàn)室從小鼠的胃部分離篩選得到。HiTrap Q FF柱、Mono Q柱和Superdex 200 prep grade柱為GE公司產(chǎn)品。氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、氨基甲酸丁酯、乙酰胺、谷氨酰胺、苯甲酰胺購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

終止劑：10 g三氯乙酸，超純水定容至100 mL。

顯色劑Ⅰ：15 g苯酚，0.625 g亞硝基鐵氰化鈉，超純水定容至250 mL。

顯色劑Ⅱ：13.125 g 氫氧化鈉，7.5 mL 次氯酸鈉，超純水定容至250 mL。

1.2 方法

1.2.1 肺炎克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯水解酶的分離純化

1) 粗酶液制備：接種適量的肺炎克雷伯氏菌于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。 發(fā)酵培養(yǎng)物 4 ℃、 8 000 r/min 離心 20 min，收集菌體。在 20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0) 中重懸，置于冰水浴中超聲1 s，間歇1 s，25 W破碎20 min，4 ℃、10 000 r/min離心30 min，收集上清。

2) 硫酸銨沉淀：將粗酶液在冰浴中邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨粉末至一定飽和度，4 ℃靜止4 h，10 000 r/min離心20 min收集30%?60%飽和度的沉淀，重新溶于20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液 (pH 7.0) 中，并用相同的緩沖溶液徹底透析脫鹽。

3) 離子交換層析：將上述經(jīng)透析脫鹽后的粗酶液，高速離心收集上清液。加到已用20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液 (pH 7.0) 平衡的HiTrap Q FF陰離子交換柱上，0?1 mol/L的NaCl階段洗脫，收集有酶活性的部分。然后將收集的粗酶液透析脫鹽后加入到預(yù)先用20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液 (pH 7.0) 平衡的Mono Q陰離子交換柱上，用0?1 mol/L的NaCl線性梯度洗脫，收集有酶活性的部分。

4) 凝膠過(guò)濾層析：Superdex 200 prep grade凝膠柱預(yù)先用 20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0) 平衡。將上述收集的粗酶液上柱，并用相同的緩沖溶液洗脫，收集有酶活性的部分。

1.2.2 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

以牛蛋白血清為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用 Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[18]。

1.2.3 氨基甲酸乙酯水解酶酶力的測(cè)定

采用靛酚藍(lán)反應(yīng)法[19]。在 0.2 mL 含 3%(W/V) 氨基甲酸乙酯的20 mmol/L 磷酸緩沖液(pH 7.0) 中加入0.2 mL 經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的酶液，于55 ℃溫育15 min，加入0.2 mL終止劑終止反應(yīng)，8 000 r/min 離心1 min后取上清，然后依次加入0.2 mL顯色劑Ⅰ、0.2 mL顯色劑Ⅱ，搖勻，37 ℃水浴保持1 h。在波長(zhǎng)625 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算酶活。實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘分解底物產(chǎn)生 1 mmol/L NH4+所需要的酶量為一個(gè)活力單位 (U)。

1.2.4 SDS-PAGE分析

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳用于分析蛋白質(zhì)的分子量，分離膠濃度為 12%，染色使用考馬斯亮藍(lán)R-250[20]。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)

1) 酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性：在20 mmol/L (pH 7.0) 磷酸緩沖液中，酶分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃和 70 ℃不同溫度下測(cè)定酶活，考察酶的最適反應(yīng)溫度。將酶在37 ℃、45 ℃和55 ℃下保溫0 min、30 min、60 min、90 min和120 min后檢測(cè)殘余酶活力，考察酶的溫度穩(wěn)定性。

2) 酶的最適反應(yīng)pH：分別在檸檬酸鹽緩沖液 (pH 4.0–6.0)、磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0)、硼酸鹽緩沖液 (pH 8.0)和硼酸鹽-氫氧化鈉緩沖液(pH 9.0–10.0)中測(cè)定酶對(duì)氨基甲酸乙酯的水解活力[15]，研究酶促反應(yīng)的最適pH。

3) 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)：將酶液與不同濃度(50?90 mmol/L) 的氨基甲酸乙酯底物作用，測(cè)定酶反應(yīng)的初速度，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求出酶對(duì)氨基甲酸乙酯的Km值和Vmax值。

4) 酶的底物特異性：將酶液與3% (W/V) 的不同底物 (氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、氨基甲酸丁酯、乙酰胺、谷氨酰胺、苯甲酰胺) 作用，測(cè)定酶活力。

5) 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響：將酶加入 1 mmol/L的不同金屬離子 (Cu2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+) 和試劑 (EDTA、DTT、SDS) 中，37 ℃保溫5 min后測(cè)定殘余酶活，觀察金屬離子和試劑對(duì)酶活力的影響。

6) 酶的乙醇耐受性：將酶液加入含 1.5%(W/V) 氨基甲酸乙酯和不同濃度 (0?30%) 乙醇的磷酸緩沖液 (pH 7.0) 中，于55 ℃溫度下反應(yīng)15 min后加入終止劑測(cè)定酶的活力，觀察酶對(duì)乙醇的耐受性。

7) 酶的NaCl耐受性：將酶液加入含1.5%(W/V) 氨基甲酸乙酯和不同濃度 (0?18%) NaCl的磷酸緩沖液 (pH 7.0) 中，于55 ℃溫度下反應(yīng)15 min后加入終止劑測(cè)定酶的活力，觀察酶對(duì)NaCl的耐受性。

2 結(jié)果與分析

2.1 肺炎克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯水解酶的分離和純化

肺炎克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液經(jīng)過(guò)上述一系列純化操作，分離純化結(jié)果見(jiàn)表1，肺炎克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯水解酶從粗酶液到最后的純化產(chǎn)物回收率為 19%，純化后的酶活力為 351.222 U/mg。SDS-PAGE凝膠電泳 (圖1) 顯示純化后的肺炎克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯水解酶為單一條帶，分子量大小約為55 kDa。

表1 肺炎克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯水解酶的純化Table 1 Purification of urethanase from Klebsiella pneumoniae

圖 1 肺炎克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯水解酶純酶的SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE analysis of purified urethanase from Klebsiella pneumoniae. M： protein marker; 1：purified urethanase.

2.2 酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性

酶在不同溫度下反應(yīng)的酶活見(jiàn)圖2，該酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃左右，溫度超過(guò)60 ℃后酶活急劇下降。將酶置于37 ℃、45 ℃和55 ℃放置并取樣測(cè)量酶的剩余活力，結(jié)果見(jiàn)圖3。酶在37 ℃保溫120 min后酶活保持70%，45 ℃下保溫120 min后酶活下降至45%，而當(dāng)溫度升至55 ℃時(shí)保溫120 min后酶活力降至7%，幾乎完全失活，表明該酶對(duì)熱較敏感。

圖 2 溫度對(duì)肺炎克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯水解酶活力的影響Fig. 2 Effects of temperature on the activity of urethanase from Klebsiella pneumoniae.

圖 3 肺炎克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯水解酶的熱穩(wěn)定性Fig. 3 Thermostability of urethanase from Klebsiella pneumoniae.

2.3 酶的最適反應(yīng)pH

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 (圖4)，肺炎克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯水解酶催化水解反應(yīng)的最適pH為7.0，當(dāng)反應(yīng)pH 從6.0升到7.0，酶活上升比較快，而當(dāng)pH 超過(guò)8.0后，酶活迅速下降，表明該酶

圖4 pH對(duì)肺炎克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯水解酶的影響Fig. 4 Effects of pH on the activity of urethanase from Klebsiella pneumoniae.

對(duì)酸堿環(huán)境較敏感。

2.4 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)

分別以濃度50 mmol/L、60 mmol/L、70 mmol/L、80 mmol/L和90 mmol/L的氨基甲酸乙酯為底物，測(cè)定底物反應(yīng)速率，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，求得Km值為 74 mmol/L，Vmax為0.307 mmol/(min·mg protein) (圖 5)。

圖 5 肺炎克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯水解酶水解氨基甲酸乙酯的Lineweaver-Burk圖Fig. 5 Lineweaver-Burk plot of purified urethanase from Klebsiella pneumoniae.

2.5 酶的底物特異性

分別以1.5% (W/V) 的氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、氨基甲酸丁酯、乙酰胺、谷氨酰胺、苯甲酰胺、尿素為底物，測(cè)定NH4+的生成速度，結(jié)果如表 2所示。該酶能水解氨基甲酸酯類(lèi)化合物和乙酰胺，而其中對(duì)氨基甲酸乙酯的作用是其他物質(zhì)的數(shù)十倍。表明該酶對(duì)氨基甲酸乙酯作用特異性較強(qiáng)。

2.6 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響

從表 3結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)中所選用金屬離子對(duì)酶催化活力均有不同程度的影響，其中Cu2+、Zn2+對(duì)酶活有較強(qiáng)的抑制作用，Mg2+有微弱的抑制作用，而Mn2+、Ca2+、Fe2+有微弱的激活作用；EDTA和DTT對(duì)酶活力有很強(qiáng)的激活作用，SDS也有微弱的激活作用。

表 2 肺炎克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯水解酶的底物特異性Table 2 Substrate specificity of urethanase from Klebsiella pneumoniae

表 3 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)肺炎克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯水解酶的影響Table 3 Effects of metal ions and chemicals on the activity of urethanase from Klebsiella pneumoniae

2.7 酶的乙醇耐受性

分別測(cè)定酶在 0?30% (V/V) 的乙醇環(huán)境中的活力，結(jié)果見(jiàn)圖6。10%的乙醇環(huán)境下酶活保持在20%，20%的乙醇環(huán)境下酶活已不足10%，而當(dāng)環(huán)境的乙醇含量升至 30%后該酶活力幾乎完全喪失，與已報(bào)道過(guò)的氨基甲酸乙酯水解酶[15,17,21]相比，該酶只能耐受低濃度的乙醇。

2.8 酶的NaCl耐受性

酶在0?18% (W/V) 的NaCl環(huán)境中的活力見(jiàn)圖7。酶在0?3%的NaCl低鹽溶液中酶活有所上升；NaCl濃度高于3%后，隨著NaCl濃度的增加，酶活逐漸下降。當(dāng)NaCl濃度高達(dá)18%時(shí)，仍能保留 40%的酶活。該酶對(duì) NaCl耐受性較強(qiáng)。

圖 6 乙醇濃度對(duì)肺炎克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯的影響Fig. 6 Effects of ethanol concentration on the activity of urethanase from Klebsiella pneumoniae.

圖7 NaCl濃度對(duì)肺炎克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯水解酶的影響Fig. 7 Effects of NaCl concentration on the activity of urethanase from Klebsiella pneumoniae.

3 討論

氨基甲酸乙酯水解酶已在多種微生物中發(fā)現(xiàn)并研究，本文首次從肺炎克雷伯氏菌中分離獲得一種氨基甲酸乙酯水解酶并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)：這種酶在55 ℃下短時(shí)間作用的活力較高，但穩(wěn)定性不佳；在一定的低鹽環(huán)境中酶的活力會(huì)有一定的上升趨勢(shì)，超出一定范圍后酶活力逐漸下降；另外，低濃度的表面活性劑SDS的添加會(huì)讓酶的活力有略微的提高。這些現(xiàn)象都可以說(shuō)明：酶的部分結(jié)構(gòu)的變化對(duì)酶活性提高有促進(jìn)作用。目前尚未報(bào)道過(guò)氨基甲酸乙酯水解酶的結(jié)構(gòu)，對(duì)于這種現(xiàn)象還有賴(lài)于酶的具體結(jié)構(gòu)解析的證實(shí)。

與之前發(fā)現(xiàn)的氨基甲酸乙酯水解酶[15,17,21]相比，這種氨基甲酸乙酯水解酶對(duì)氨基甲酸酯類(lèi)化合物的水解有特異性，對(duì)氨基甲酸乙酯有較高的底物專(zhuān)一性和作用活力。

另外，之前的文獻(xiàn)報(bào)道均是致力于氨基甲酸乙酯水解酶的乙醇耐受性[15,17,21]的考察，而對(duì)其N(xiāo)aCl耐受性尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究除對(duì)此氨基甲酸乙酯水解酶的乙醇耐受性作了研究，還首次考察了氨基甲酸乙酯水解酶的NaCl耐受性。研究發(fā)現(xiàn)該酶能耐受低濃度的乙醇和高濃度的NaCl。由于該酶來(lái)源于非食品安全級(jí)微生物，所以此酶不適宜在酒精飲料和醬油中直接添加應(yīng)用。醬油中的食鹽濃度一般在 18%左右，而在 18%的高鹽溶液中酶能保持 40%的活力，具有良好的耐鹽特性。因此，經(jīng)過(guò)對(duì)其蛋白序列解析后能為今后氨基甲酸乙酯水解酶的耐鹽特性改造和醬油中氨基甲酸乙酯的消除提供十分重要的參考。

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