畢潔，方芳，仇鈺瑩，楊慶利，陳堅,2

1 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122 2 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122 3 山東省花生研究所，山東 青島 266100

血清中高膽固醇含量是誘發(fā)高血壓、冠心病等心血管疾病的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，服用益生菌及相關(guān)制品具有減少人體血清膽固醇含量，降低心血管疾病發(fā)病率的功效，這與益生菌所產(chǎn)生的膽鹽水解酶 (Bile salt hydrolase，BSH，EC 3·5·1·24) 密切相關(guān)[1-2]。膽鹽水解酶是由bsh基因編碼的一種胞內(nèi)酶，是腸道微生物為了抵抗膽鹽得以生存而產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物，它屬于氨基末端親核水解酶類 (N-terminal nucleophile，Ntn) 中的甘氨膽酰水解酶家族[3]。該酶能夠水解腸道內(nèi)的結(jié)合膽鹽形成氨基酸和游離膽汁酸，經(jīng)BSH酶作用后產(chǎn)生的去結(jié)合型膽鹽比結(jié)合型膽鹽重吸收效率低，導(dǎo)致大量的去結(jié)合型膽鹽從糞便中排出，而膽固醇的主要去路是轉(zhuǎn)變成膽酸，因此通過膽鹽水解酶的水解作用可以使膽固醇不斷向合成結(jié)合膽鹽的方向進行以保證腸道內(nèi)結(jié)合膽鹽與脂質(zhì)物質(zhì)的平衡，從而消耗體內(nèi)更多的膽固醇，達到降低血清膽固醇的目的[4-5]。

健康人體的膽汁中，膽汁酸按結(jié)構(gòu) (圖1)[6]可分為兩大類[7-8]：一類為游離型膽汁酸 (Free bile acid)，包括膽酸 (Cholic acid, CA)、脫氧膽酸 (Deoxycholic acid, DCA)、鵝脫氧膽酸(Chenodeoxycholic acid, CDCA) 和少量的石膽酸 (Lithocholicacid, LCA)；另一類為結(jié)合型膽汁酸 (Conjugated bile acid)，主要包括甘氨膽酸(Glycocholic acid, GCA)、甘氨脫氧膽酸(Glycodeoxycholic acid, GDCA)、甘氨鵝脫氧膽酸 (Glycochenodeoxycholic acid, GCDCA)、?；悄懰?(Taurocholic acid, TCA)、牛磺脫氧膽酸(Taurodeoxycholic acid, TDCA) 及?；蛆Z脫氧膽酸 (Taurochenodeoxycholic acid, TCDCA)等。研究表明，人體內(nèi)6種主要的結(jié)合膽鹽和3種膽酸分別參與了不同的代謝活動，通過激活不同的信號傳導(dǎo)途徑，可以分別起到調(diào)節(jié)體內(nèi)能量代謝平衡、控制肥胖的作用以及抑制腸道細菌過度增殖等作用。其中，GCA能夠顯著抑制IgM和IgG 的含量，并增加IL-2及TNF-A的含量，提高CD4+/CD8+的比值，提高非特異體性免疫功能[9]。Boever 等猜測 GDCA 與TDCA的對膽酸的高效率解離可能是使膽汁酸的毒性降低的重要原因[10]。GCDCA可誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的大鼠肝細胞凋亡，這為臨床治療膽汁淤積性肝病提供了新的思路和理論基礎(chǔ)[11-12]。TCDCA可通過減少NO和LTB4的產(chǎn)生，直接發(fā)揮抗炎作用[13]。此外Wenger等發(fā)現(xiàn)TCDCA能夠促進乳糖苷神經(jīng)酰胺 β-半乳糖苷酶的活性，這對研究克拉貝氏病具有指向性意義[14-15]。因此，通過膽鹽水解酶的水解作用，影響膽汁酸的組成和流量對于治療高膽固醇相關(guān)的糖尿病、肥胖癥及與此相關(guān)的代謝類疾病，維護人類健康有重要的意義。

目前已有多種微生物的BSH同工酶得到了純化、鑒定、克隆以及異源表達[16-24]。雖然不同的微生物產(chǎn)生的膽鹽水解酶都能夠水解結(jié)合膽鹽，但由于氨基酸序列的差異導(dǎo)致此類同工酶底物特異性及酶活性的差異。本研究的前期工作發(fā)現(xiàn)位于唾液乳酸桿菌Lactobacillus salivariusLMG14476的巨大質(zhì)粒的膽鹽水解酶BSH1具有廣泛的底物特異性，但對不同底物的活性卻有所差異[25]。因此，本文以大腸桿菌的表達系統(tǒng)為分子改造平臺，通過理性設(shè)計及分子改造技術(shù)鑒定出與酶特性相關(guān)的關(guān)鍵殘基和結(jié)構(gòu)元件，為提高該酶的底物特異性，闡明其催化機制和作用機理，開發(fā)應(yīng)用其潛在的生理功能，使其更好地在醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮作用奠定理論基礎(chǔ)。

圖1 人體中幾種主要的膽汁酸結(jié)構(gòu)[6]Fig. 1 Structures of several major bile acids in the human body[6].

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coliJM109用于構(gòu)建和增殖重組質(zhì)粒，本研究室保存。

Escherichia coliBL21(DE3)為表達宿主，本研究室保存。

重組質(zhì)粒pET201，特點Ampr，bsh1，pelB信號肽，pET-20b(+)的衍生質(zhì)粒，C末端融合組氨酸標簽，T7啟動子，本研究室構(gòu)建。

1.2 酶及主要試劑

甘氨酸結(jié)合膽鹽 (GCA)、甘氨脫氧結(jié)合膽鹽 (GDCA)、甘氨鵝脫氧結(jié)合膽鹽 (GCDCA)、牛磺結(jié)合膽鹽 (TCA)、?；敲撗踅Y(jié)合膽鹽(TDCA)、?；蛆Z脫氧結(jié)合膽鹽 (TCDCA) 均購自Sigma公司。DNA片段回收試劑盒、膠回收試劑盒、連接酶 (SolutionⅠ)、定點突變試劑盒(TaKaRa MutanBEST Kit)、感受態(tài)制備試劑盒、DNA marker均購自TaKaRa公司。2×TaqPCR MasterMix購自天根生化科技(北京)有限公司。質(zhì)粒小量提取試劑盒、氨芐青霉素 (Amp)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG) 購自上海生物工程有限公司。標準分子量蛋白及SDS-PAGE試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，pH 7.0；121 ℃濕熱滅菌15 min；配制固體培養(yǎng)基則加入2%瓊脂。

1.4 引物設(shè)計及目的片段的擴增

以重組質(zhì)粒pET201為模板，利用 Primer 5軟件設(shè)計互補引物，參照定點突變試劑盒的操作手冊通過 PCR擴增 BSH1突變體的基因序列。定點突變的引物設(shè)計如表 1所示，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物。反應(yīng)體系如下：5 μL 10×PyrobestBufferⅡ，8 μL dNTPs(各 2.5 mmol/L)，0.2 μL 模板 DNA，1 μL 正向引物，1 μL 反向引物，0.25 μLPyrobestDNA Polymerase (5 U/μL)，補加雙蒸水至 50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，按各引物對的Tm退火30 s，72 ℃延伸5 min，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.5 表達載體的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，經(jīng)末端平滑化及5′末端磷酸化后，于16 ℃連接1 h，連接液轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞E.coliTop10，篩選陽性重組子，小量提取質(zhì)粒，進行PCR鑒定。反應(yīng)體系：12.5 μL 2×MasterMix，0.1 μL 模板 DNA，1 μL 正向引物B1u，1 μL 反向引物B1d，補加雙蒸水至 25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min 20 s，共25個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。陽性質(zhì)粒送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

Supported by：National Natural Science Foundation of China (No. 31100064), the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

Corresponding author：Jian Chen. Tel： +86-510-85918312; Fax： +86-510-85918309; E-mail： jchen@jiangnan.edu.cn

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1.6 目的基因的誘導(dǎo)表達

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21(DE3)，挑取單個菌落，接種于氨芐青霉素終濃度為100 μg/mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng) 12 h。將種子液以 2%的接種量轉(zhuǎn)接于25 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至菌體濃度OD600值為 0.5?0.6時，加入終濃度為0.1 mmol/L的 IPTG進行誘導(dǎo)，于 20 ℃、200 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。取一定量的菌液 (OD600=1)，經(jīng)8 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清，菌體沉淀用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液 (20 mmol/L，pH 7.0) 洗滌兩次后，菌體細胞用于12% SDS-PAGE電泳分析。剩余菌液重復(fù)上述操作后，菌體細胞用1/10體積預(yù)冷的結(jié)合緩沖液(3.8 mmol/L Na2HPO4，16.2 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH 7.4)重懸，于冰浴中用超聲波破碎儀破壁 (工作時間：間歇時間=1：2) 30 min，15 000 r/min、4 ℃離心20 min后取上清，得到無細胞提取物用于12% SDS-PAGE分析。

表1 定點突變引物序列Table 1 Primer used for construction of site-directed mutations

1.7 膽鹽水解酶及突變體的純化

將無細胞提取物經(jīng) 0.22 μm 膜過濾后注入經(jīng)結(jié)合緩沖液平衡的親合層析柱，并用結(jié)合緩沖液洗去未結(jié)合蛋白；隨后以0?500 mmol/L洗脫緩沖溶液(3.8 mmol/L Na2HPO4，16.2 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 7.4)進行梯度洗脫，流速為1 mL/min，收集含有BSH1蛋白的部分。

1.8 BSH1及其突變體的活性分析

1.8.1 酶活定性檢測

將含有轉(zhuǎn)化子的菌液取5 μL轉(zhuǎn)接到分別含有 1% (W/V) 豬膽鹽 (Porcine bile) 的LB固體平板 (含 100 μg/mL 氨芐青霉素和 24 μg/mL IPTG) 上，通過是否產(chǎn)生白色或透明沉淀圈驗證 BSH1及其突變體的活性，如果產(chǎn)生了沉淀圈，即說明具有膽鹽水解酶的活性。

1.8.2 底物特異性分析

取適量酶液與磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 6.0)混合，使酶在反應(yīng)體系中的終濃度為10 μg/mL，分別以6種結(jié)合膽鹽TCA、TDCA、TCDCA、GCA、GDCA和GCDCA作為反應(yīng)底物，反應(yīng)體系中底物的終濃度為30 mmol/L，在37 ℃溫育30 min，加入等體積的三氯乙酸(15%，W/V)終止反應(yīng)，12 000 r/min離心 5 min，取10 μL上清液加入190 μL茚三酮反應(yīng)試劑，100 ℃煮15 min后，迅速冷卻至室溫，于紫外可見分光光度計中測定570 nm的光吸收，通過甘氨酸標準曲線換算得到氨基酸的含量。1個單位的酶活力定義為：37 ℃下每分鐘催化底物生成1 μmol氨基酸的酶量(U/mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 同源建模

在目的蛋白缺少晶體結(jié)構(gòu)的前提下，根據(jù)已知晶體結(jié)構(gòu)的同源蛋白，模擬目的蛋白的結(jié)構(gòu)是一種有效的策略。本文利用在線軟件SWISS-MODEL，以已報道的產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridiumperfringens來源的CBAH mutant晶體結(jié)構(gòu)(PDB No. 2rf8B)為模板[26](兩者氨基酸序列同源性為35.168%)，模擬得到L.salivariusBSH1 (LsBSH1)的晶體結(jié)構(gòu)(圖2)。膽鹽水解酶BSH1的晶體結(jié)構(gòu)顯示，N-末端親核水解酶家族所共有高保守性氨基酸位點 Cys2位于 N-末端酰胺鍵親核攻擊的位置上，被認為是在脫蛋氨酸以后的蛋白自動水解過程中的接觸反應(yīng)中心[27-29]。前人對雙歧桿菌膽鹽水解酶Cys2的研究表明，該位點的突變將顯著影響 BSH對GDCA的水解活性，但并未考察其突變體對其他底物的水解能力。因此，為了考察處于疏水腔中心的高保守性氨基酸位點Cys2對BSH1底物特異性的影響，我們對其進行點突變。此外，在高保守性活性位點Cys2的周圍有5個loop，分別是 loop 21–26、loop 79–84、loop 133–138、loop 256–264 和 loop 267–270。這些 loop 位于疏水腔入口處，將 Cys2埋在疏水腔中。根據(jù)L.salivariusBSH1的 5個 loop中的氨基酸與C.perfringensCBAH突變體的保守性以及氨基酸殘基的極性，預(yù)測可能影響底物特異性的結(jié)合位點分別為 loop 21–26上的 Asp21、loop 79–84上的 Asn79和 Phe80、loop 126–138上的Ala137、loop 256–264上的 Thr264以及 loop 267–270 上的 Glu269。

2.2 LsBSH1突變體的構(gòu)建

為了研究預(yù)測位點與底物結(jié)合作用的相關(guān)性，通過定點突變分別對預(yù)測氨基酸位點Asp21進行丙氨酸替換突變，即將Asp21經(jīng)Ala替換為 D21A。對預(yù)測氨基酸位點Ala137進行絲氨酸替換突變，即將Ala137經(jīng)Ser替換為A137S。通過Ala或Ser替換去除氨基酸側(cè)鏈對底物的結(jié)合作用，進而研究各位點對 BSH1底物特異性的作用。

以含有bsh1的重組質(zhì)粒pET201為模板，PCR擴增出含有編碼 BSH1的 7種突變體BSH1C2S、BSH1D21A、BSH1N79A、BSH1F80A、BSH1A137S、BSH1T264A和BSH1E269A的表達質(zhì)?；蛐蛄?(圖3)。

圖2 同源建模L. salivarius BSH1的晶體結(jié)構(gòu)Fig. 2 Homology modeling of the crystal structure of L. salivarius BSH1.

Received：October 10, 2013; Accepted： December 30, 2013

Supported by：National Natural Science Foundation of China (No. 31100064), the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

Corresponding author：Jian Chen. Tel： +86-510-85918312; Fax： +86-510-85918309; E-mail： jchen@jiangnan.edu.cn

國家自然科學(xué)基金 (No. 31100064)，江蘇省優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目資助。

圖3 LsBSH1突變體PCR擴增產(chǎn)物核酸電泳圖Fig. 3 Amplification of pET201 derivatives for construction of LsBSH1 mutants. M1： DL5000 DNA marker; M2：Trans5K DNA marker; 1–7： BSH1D21A, BSH1N79A, BSH1F80A, BSH1A137S, BSH1T264A, BSH1E269A and BSH1C2S.

將7種突變體的PCR產(chǎn)物分別經(jīng)過末端平滑化及磷酸化處理后，連接轉(zhuǎn)化至E.coliJM109，挑選克隆子進行菌落PCR驗證，如圖4所示，根據(jù)目的產(chǎn)物條帶與預(yù)測大小 1 200 bp相符，篩選得到陽性克隆，并進行測序，獲得最終測序正確的轉(zhuǎn)化子。

2.3 LsBSH1及7種突變體的表達與純化

圖4 菌落PCR驗證陽性克隆Fig. 4 Verification of positive clones via colony PCR.M： DL2000 DNA marker; -： negative control; +： positive control; 1–7： PCR products of E. coli JM109 strains harboring positive clones of BSH1D21A, BSH1N79A,BSH1F80A, BSH1A137S, BSH1T264A, BSH1E269A and BSH1C2S.

對得到的轉(zhuǎn)化子進行發(fā)酵，收集的菌體細胞經(jīng)超聲破壁后，對細胞內(nèi)上清液進行SDS-PAGE蛋白電泳 (圖5A)。圖5B為純化后的蛋白電泳圖。結(jié)果顯示 BSH1及突變體經(jīng)表達及純化后得到分子量均為37 kDa的目的條帶，經(jīng)Ni2+親和柱層析后可以得到純度較高的 BSH1及其突變體酶蛋白。并且根據(jù)所有重組菌在含有豬膽鹽的LB平板上所出現(xiàn)的沉淀圈可知，BSH1的突變體均具有BSH活性，因此，我們繼續(xù)考察了 BSH1及其突變體分別對 6種結(jié)合膽鹽的水解活性。

2.4 LsBSH1及其突變體的底物特異性分析

圖5 LsBSH1及其突變體的表達與純化Fig. 5 Expression and purification of LsBSH1 and its mutants in E. coli. (A) Expression of LsBSH1 and its mutants in E. coli. (B) Purification of LsBSH1 and its mutants. M： protein marker; 1–8： BSH1D21A,BSH1N79A, BSH1F80A, BSH1A137S, BSH1T264A,BSH1E269A, BSH1C2S and BSH1.

圖6 LsBSH1及其突變體的底物特異性Fig. 6 Substrate specificities of LsBSH1 and its mutants.

分別以6種結(jié)合膽鹽TCA、GCA、TDCA、GDCA、TCDCA和GCDCA為底物，測定純化后的BSH1及其突變體BSH1C2S、BSH1D21A、BSH1N79A、BSH1F80A、BSH1A137S、BSH1T264A和BSH1E269A對6種結(jié)合膽鹽的水解能力。結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，對BSH1的 Cys2和 Thr264的位點突變分別導(dǎo)致 BSH1對TCA和GCA失去水解活性，并且與原始的重組BSH1相比，對BSH1的Cys2的位點突變導(dǎo)致BSH1對GCA和GDCA的水解活性提高，而對TDCA、TCDCA和GCDCA的水解活性變化不明顯；對BSH1的Asp21的位點突變會引起B(yǎng)SH1水解TCA的活性降低，水解GDCA和TCDCA的活性增加，對TDCA、GCA和GCDCA的水解活性變化不顯著；Asn79的位點突變對BSH1水解TDCA和GCDCA的能力改變不明顯，但對其水解TCA、GCA、GDCA和TCDCA的活性影響較為顯著；除了對TDCA的水解能力變化不明顯外，Phe80的位點突變均會引起B(yǎng)SH1對其余 5種結(jié)合膽鹽水解能力的改變；Ala137的位點突變僅引起 BSH1對 TCA和GDCA水解活性的提高；Thr264的位點突變導(dǎo)致 BSH1對 6種結(jié)合膽鹽的水解活性都發(fā)生不同程度的改變，其中對固醇核基團是 DCA和CDCA的結(jié)合膽鹽的水解活性提高，對固醇核基團是 CA的結(jié)合膽鹽水解活性降低；Glu269的位點突變引起 BSH1對 6種結(jié)合膽鹽的水解活性不同程度增加。

通過以上對突變體的活性分析，我們可知Cys2和Thr264分別是催化TCA和GCA的關(guān)鍵殘基，對催化活性的保持具有關(guān)鍵作用，并且由此可以判斷高保守性的氨基酸位點Cys2不是BSH1唯一的活性位點，針對不同的結(jié)合膽鹽，BSH1的活性位點可能不同，這些活性位點共同構(gòu)成了BSH1的催化中心。同時，7個氨基酸位點均會不同程度地影響 BSH1對不同結(jié)合膽鹽的水解活性，其作用可能是它們作為的結(jié)合位點參與了底物的結(jié)合，也可能是其影響了底物進入活性中心的通道或底物結(jié)合口袋的體積與形狀，進而影響了 BSH1對不同結(jié)合膽鹽的水解活性。

3 討論

以產(chǎn)氣莢膜梭菌ClostridiumperfringensCBAH突變體 (PDB No. 2rf8B) 的晶體結(jié)構(gòu)作為模板，對L.salivariusBSH1的晶體結(jié)構(gòu)進行同源建模，通過理性設(shè)計對L.salivariusBSH1參與底物結(jié)合的重要氨基酸位點進行預(yù)測。采用定點突變策略成功構(gòu)建了BSH1的7種突變體。根據(jù)突變體的表達宿主的表現(xiàn)型分析可知，在含有混合結(jié)合膽鹽的 LB平板上均呈現(xiàn)不同程度的沉淀圈，說明 7種突變體對結(jié)合膽鹽均有活性，但是在不同程度上影響了BSH1的活性。BSH1及其突變體的底物特異性分析說明，Cys2和Thr264分別是催化TCA和GCA的關(guān)鍵殘基，對催化活性的保持具有關(guān)鍵作用，且高保守性的氨基酸位點Cys2可能不是BSH1唯一的活性位點，而 7種突變體對不同的結(jié)合膽鹽呈現(xiàn)不同的水解活性，原因是預(yù)測的氨基酸位點可能作為 BSH1的結(jié)合位點參與了底物的結(jié)合，也可能是其影響了底物進入 BSH1活性中心的通道或底物結(jié)合口袋的體積與形狀，進而影響了BSH1對不同結(jié)合膽鹽的水解活性。

上述研究表明，基于分子模擬及結(jié)合位點的預(yù)測對 BSH1酶分子功能進行改造的方法具有可行性。在后續(xù)研究中可通過了解酶與底物的相互作用以及酶蛋白本身氨基酸間的相互作用，利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息將氨基酸研究位點縮小到有效的范圍內(nèi)，從而提高酶功能改造的成功率，提高BSH的底物特異性選擇，闡明其催化機理、作用機制，拓展其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

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