鄭世剛，李臻，趙善倉，王慶國，劉煒

1 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266000 2 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心和山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點實驗室，山東 濟南 250100 3 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，山東 濟南 250100

白藜蘆醇 (Resveratrol, Res) 作為植物中一種重要的植保素及抗毒素，其參與真菌等生物脅迫，以及紫外 (Ultraviolet, UV) 輻射、機械損傷和激素等非生物脅迫并引起抗性反應(yīng)的研究已被廣泛報道[1]。研究還表明，Res在抑制動物細胞癌變、治療心血管疾病、抗氧化和延長壽命等方面也具有一定的作用[2]。已知Res主要存在于葡萄、花生、虎杖和高粱等少數(shù)物種中，許多物種雖然含有Res合成所需的底物，但自身缺乏Res合成途徑的關(guān)鍵酶，如白藜蘆醇合成酶(Resveratrol synthase, RS) 等，因而不能合成Res[3]。RS屬于芪合酶 (Stilbene synthase, STS)或稱二苯乙烯合酶家族，在同一植物中存在多種同源異構(gòu)體，以4-香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A為底物合成Res[3]。因此利用基因工程手段將RS基因整合入不含有Res或Res含量低的細胞或物種基因組中進行表達，可以研究RS基因及其代謝產(chǎn)物Res的生物學(xué)功能與調(diào)控機制，進而為改良物種品質(zhì)及抗性，獲得Res及其相關(guān)代謝物提供一種有效的途徑。

1 RS基因在植物中的轉(zhuǎn)化及相關(guān)代謝產(chǎn)物

1.1 RS基因的克隆及轉(zhuǎn)化

以往研究中，研究者通過對Res的生物合成及相關(guān)代謝途徑的分析，從而揭示了RS基因和RS的生物學(xué)特性及功能，相關(guān)RS基因的分離、克隆和異源表達也受到研究者的廣泛關(guān)注。1988年，Schr?der等從懸浮培養(yǎng)的花生Arachis hypogaea細胞中分離得到兩個約1.6 kb的RS基因cDNA克隆，這兩個基因序列高度重復(fù)，都含有一個單一內(nèi)含子，其序列編碼區(qū)與查爾酮合酶 (Chalcone synthase, CHS) 基因序列同源性較高，達到70%–74%，且內(nèi)含子所在位置一致，僅在CHS的保守區(qū)存在一定差異[4]。之后，Melchior等從葡萄Vitis viniferaL.中獲得RS基因PSV25的約1.5 kb的全長cDNA序列，經(jīng)在大腸桿菌中表達獲得43 kDa的蛋白產(chǎn)物，以香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A為底物對蛋白表達產(chǎn)物進行酶活性檢測，結(jié)果顯示蛋白產(chǎn)物主要是Res，而沒有查爾酮或柚皮素，進一步證明PSV25編碼具有催化活性的RS[5]。目前，有關(guān)花生和葡萄中RS基因的異源轉(zhuǎn)化研究報道相對較多，除上述PSV25外，葡萄中的RS基因還包括Vst1[6]和StSy[7]等；花生中的RS基因主要有AhRS[8]、AhRS3[9]等。本實驗室的前期研究中，通過同源克隆法，從花生“魯花14”中分離到全長1 537 bp的RS基因，命名為PNRS1，序列比對顯示，其與花生數(shù)據(jù)庫中其他RS基因的相似性在90%以上，與葡萄和虎杖中RS基因的同源性也較高[10]。此外，研究者在川鄂爬山虎Parthenocissus henryana、虎杖Polygonum cuspidatum及單子葉植物高粱Sorghum bicolor中，也發(fā)現(xiàn)并分離到PhSTS[11]、PcRS[12]和SbSTS1[13]等RS類基因。

1990年，Hain等首次將花生RS基因AhRS轉(zhuǎn)入煙草Nicotiana tabacumL.，并以大豆疫霉Phytophthora megasperma和紫外輻射作為誘導(dǎo)因素分析其表達響應(yīng)情況，結(jié)果顯示，AhRS的mRNA水平與Res含量的積累呈協(xié)同變化，花生中反式Res在受UV處理后含量升高，在處理8 h后達到最大值，為600 ng/g鮮重，而轉(zhuǎn)基因煙草中Res含量在受UV處理24 h后達到最大值，為50 ng/g鮮重[8]，結(jié)果顯示不管在同源或異源表達情況下，RS基因均可對生物脅迫和非生物脅迫產(chǎn)生響應(yīng)，且其代謝產(chǎn)物Res的積累與基因表達量呈正相關(guān)。之后，研究者在擬南芥Arabidopsis thalianaL.[12]、水稻Oryza sativaL.[14]、小麥Triticum aestivumL.[15]、苜蓿Medicago sativa[16]、獼猴桃Actinidia deliciosa[17]、蘋果Malus domesticaBorkh.[18]、番木瓜Carica papayaL.[19]、白楊樹Populus albaL.[20]、番茄Lycopersicon esculentumMill.[7]、油菜Brassica napusL.[21]、地黃Rehmannia glutinosaL.[9]、萵苣Lactuca sativaL.[22]、豌豆Pisum sativumL.[23]、啤酒花Humulus lupulusL.[24]、草莓Fragaria ×ananassa[25]、紫薯Ipomoea batatas[26]、小白菜Brassica campestris[27]和胡蘿卜Daucus carota[28]等不含Res或自身Res含量較低的植物中，均進行了RS基因的異源轉(zhuǎn)化及表達研究，部分成果見表1。本實驗室前期工作中也已將克隆到的花生RS基因PNRS1轉(zhuǎn)入煙草和水稻中進行表達[29-30]，研究結(jié)果表明，異源轉(zhuǎn)化的PNRS1的表達仍可受UV-C的誘導(dǎo)，經(jīng)紫外脅迫后，轉(zhuǎn)基因煙草葉片提取液中Res的含量較野生型煙草葉片提取液中升高了約4 μg/mL，而轉(zhuǎn)基因煙草葉片中Res的含量較野生型煙草葉片提高了約117 μg/g鮮重[29]。

1.2 轉(zhuǎn)RS基因植物中的相關(guān)代謝產(chǎn)物

受RS基因來源、基因特異性啟動子和受體材料等因素的影響，轉(zhuǎn)基因植物中新合成代謝產(chǎn)物的種類和積累量均有所差異。預(yù)期轉(zhuǎn)入RS基因后可新合成反式Res，但一些研究結(jié)果顯示，新產(chǎn)物多為反式白藜蘆醇糖苷 (Piceid;trans-resveratrol-3-O-b-D-glucopyranoside)，也有順式Res和順式白藜蘆醇糖苷的報道，究其原因可能是植物內(nèi)源糖基化酶及異構(gòu)酶修飾造成的。Nicoletti等應(yīng)用反相高效液相色譜(RP-HPLC) 與光電二極管陣列 (PDA) 并結(jié)合質(zhì)譜 (MS)，對轉(zhuǎn)RS基因番茄果實中4種芪類化合物 (反式和順式白藜蘆醇糖苷與反式和順式Res) 的積累水平進行了測定，結(jié)果顯示，不管是成熟還是未成熟的果實，Res的糖基化形式均優(yōu)先積累于果皮中，而在紅熟期番茄果皮中檢測到較高含量的反式白藜蘆醇糖苷和反式Res[7]。而Lo等通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS/MS)，對轉(zhuǎn)高粱RS基因擬南芥粗提物中三種Res相關(guān)代謝物，即Res二葡萄糖苷、反式乙酰己糖苷和順式乙酰己糖苷的含量測定結(jié)果顯示，Res二葡萄糖苷和順式乙酰己糖苷的積累量較大，而反式乙酰己糖苷幾乎檢測不到[33]。

由于不同植物代謝過程的差異和內(nèi)源修飾酶的影響等，使得受體材料在轉(zhuǎn)入RS基因后，是否能合成新的代謝產(chǎn)物及代謝物的種類有時難以確定，如Hanhineva等將CaMV 35S啟動子和花絲特異性啟動子fil1控制的葡萄RS基因NS-Vitis3異源轉(zhuǎn)入草莓，但未在轉(zhuǎn)基因草莓中檢測到預(yù)期的Res或其衍生物[25]。Hammerbacher等將挪威云杉Picea abies中的RS基因PaSTS再同源轉(zhuǎn)化入挪威云杉進行過表達時，僅在代謝產(chǎn)物中檢測到四羥基芪糖苷均二苯乙烯和異土大黃苷兩種物質(zhì)的含量有明顯升高，而未檢測到Res含量的明顯變化，推測挪威云杉中RS基因參與合成的Res可能進一步通過羥基化、O-甲基化和O-糖基化等多種過程而被加工、修飾[34]。雖然產(chǎn)物在植物體內(nèi)的后期加工和修飾可能會影響到Res的產(chǎn)生及產(chǎn)量，但該過程同時也會產(chǎn)生一些有利的物質(zhì)。據(jù)報道，Res衍生物紫檀芪 (Pterostilbene)在體外具有比Res更強的抗菌等生物活性，因此有關(guān)植物中Res的后期加工及修飾也受到研究者的關(guān)注。2011年，Xu等將葡萄中Res甲基轉(zhuǎn)移酶(Resveratrol O-methyltransferase, ROMT) 基因ROMT和RS基因VST1共轉(zhuǎn)化入煙草后，轉(zhuǎn)基因煙草中可檢測到紫檀芪的積累[35]。之后，Rimando等也報道了共轉(zhuǎn)化ROMT基因和RS基因，可在擬南芥代謝產(chǎn)物中檢測到紫檀芪的積累[36]。

表1 轉(zhuǎn)RS基因植物中Res及白藜蘆醇糖苷的積累Table 1 Accumulation of Res and piceid in RS transgenic plants

表1列出了轉(zhuǎn)RS基因植物中Res或其衍生物的積累量，一般在0.2–616 μg/g鮮重之間，如在轉(zhuǎn)基因蘋果和豌豆中Res或其衍生物的含量較低，約0.5–7 μg/g鮮重[18,23]，而在轉(zhuǎn)基因油菜和啤酒花中，相應(yīng)物質(zhì)的含量較高，約為560–616 μg/g鮮重[21,24]。本實驗室對轉(zhuǎn)基因煙草和水稻中Res的含量也進行了測定，前期研究通過紫外分光光度法測得轉(zhuǎn)基因煙草葉片中Res含量較野生型提高了34 μg/g鮮重[29]，之后進一步通過HPLC的方法，對轉(zhuǎn)基因水稻幼苗和種子中的Res含量進行了測定，結(jié)果顯示水稻幼苗和種子中相應(yīng)物質(zhì)的含量較野生型對照材料中也有所提高(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。這種產(chǎn)物量上的差異，除了受基因在受體植物中轉(zhuǎn)錄及表達差異的影響外，或許與受體植物中內(nèi)源香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A含量以及代謝相關(guān)酶如CHS等的活性的差異有關(guān)。同時，對RS基因異源轉(zhuǎn)化入受體植物后，植物體內(nèi)代謝產(chǎn)物及含量變化的分析發(fā)現(xiàn)，黃酮醇等類黃酮物質(zhì)的含量有輕微下降，而ɑ-酸、β-酸、柚皮素和異戊烯基黃酮等黃酮類代謝物，以及黃烷醇、根皮素衍生物和羥基肉桂酸等酚類化合物的含量則沒有明顯改變[18,24]。Hüsken等在轉(zhuǎn)Vst1基因的油菜中，通過干擾UDP葡萄糖芥子酸糖基轉(zhuǎn)移酶表達而抑制芥子酸酯的合成，從而減少對前體物質(zhì)4-香豆酸的利用從而達到增加Res合成的效果，而油、蛋白質(zhì)、脂肪酸和硫代葡萄糖甙等物質(zhì)的含量則未檢測到明顯變化[21]。而番茄中轉(zhuǎn)入RS基因后導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因番茄中蕓香苷、柚皮素和綠原酸等物質(zhì)的含量的變化，則被認為可能與遺傳轉(zhuǎn)化等過程相關(guān)，而非外源基因轉(zhuǎn)入引起的[7]。

2 轉(zhuǎn)RS基因植物的表型和功能

2.1 抗病原菌活性

葡萄受到灰霉菌Botrytis cinerea侵染時體內(nèi)會積累RS基因的mRNA和Res，且已有報道顯示，Res在體外對病原菌具有一定的抑制作用[2]，表明RS基因可參與植物抗病過程，從而使RS基因?qū)χ参锊牧系霓D(zhuǎn)化與受體植物對病原菌的防御等相關(guān)研究受到研究者的廣泛關(guān)注。Hain等發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)花生RS基因的煙草受大豆疫霉侵染后，植物體內(nèi)可誘導(dǎo)RS基因的mRNA積累，顯示轉(zhuǎn)基因植物中RS基因的轉(zhuǎn)錄與病原菌侵染存在一定相關(guān)性[8]。之后，Hain等又報道了葡萄RS基因Vst1異源轉(zhuǎn)化入煙草后，轉(zhuǎn)基因煙草對灰霉菌的抗性較野生型煙草有所提高，這是RS基因轉(zhuǎn)化可提高受體植物對病原菌抗性的首次報道[6]。2005年，Serazetdinova等研究顯示，將葡萄的RS基因Vst1和Vst2異源轉(zhuǎn)化入小麥后，轉(zhuǎn)基因小麥抵抗小麥葉銹菌Puccinia reconditaf. sp.tritici和小麥穎枯病菌Septoria nodorumBerk.的侵染能力提高，發(fā)病癥狀較野生型材料明顯減輕[15]。Zhu等的研究也顯示，轉(zhuǎn)入葡萄Vst1的番木瓜中，RS基因的mRNA和白藜蘆醇糖苷的積累受棕櫚疫霉Phytophthora palmivora感染的誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因植株與對照相比表現(xiàn)出更強的抗真菌活性[19]。對轉(zhuǎn)Vst1基因的水稻的研究顯示，轉(zhuǎn)基因植株中Vst1基因的mRNA的積累與植物受稻瘟病Pyricularia oryzae侵染的程度呈正相關(guān)，植株受真菌侵染后其體內(nèi)Vst1的mRNA可在短時間內(nèi)積累，從而使轉(zhuǎn)基因水稻對稻瘟病的抗性增強[37]。研究結(jié)果還顯示，轉(zhuǎn)Vst1基因還可同時提高水稻對白葉枯病Xanthomonas oryzae等病害的抗性[14]。本實驗室在獲得花生RS基因異源轉(zhuǎn)化的水稻材料的基礎(chǔ)上，將轉(zhuǎn)基因水稻進行了溫室及大田種植，初步觀察顯示，轉(zhuǎn)基因水稻對稻瘟病等病害侵染的抵抗能力較野生型有所提高，轉(zhuǎn)基因水稻葉片提取液在體外對稻瘟病菌的生長具有一定的抑制作用，同時轉(zhuǎn)基因植株在室內(nèi)接種稻瘟病菌的條件下，表現(xiàn)出良好的抗病性[38]。

鑒于啟動子對于基因的表達及受體植物所表現(xiàn)的生理生化特性具有重要的調(diào)控作用，故增強型和誘導(dǎo)型啟動子在RS基因與植物抗病性研究方面也有較多應(yīng)用。如前文所述，RS基因主要通過自身啟動子的調(diào)控進行異源表達，而Hipskind等的研究結(jié)果顯示，以增強型CaMV 35S為啟動子時，經(jīng)花生RS基因異源轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因苜蓿，其葉片經(jīng)莖點霉Phoma medicaginis處理后，與對照葉片相比，轉(zhuǎn)基因葉片在壞死斑大小、密度和真菌繁殖方面的癥狀明顯下降，而這種病原菌孢子形成的減少可大幅度降低莖點霉的傳播和危害，表明轉(zhuǎn)基因苜?？共⌒杂兴岣遊16]。同樣以CaMV 35S為啟動子，2005年，Lim等的研究結(jié)果也顯示，異源轉(zhuǎn)化入花生RS基因AhRS3的地黃可較好地抵抗尖鐮孢菌Fusarium oxysporum的侵染[9]；2011年，Liu等也報道，轉(zhuǎn)虎杖RS基因PcRS的擬南芥，可通過抑制病菌孢子的繁殖，對菜心炭疽病Colletotrichum higginsianum具有一定抗性[12]。同時，Thévenot等還報道了將RS基因和誘導(dǎo)型啟動子相結(jié)合，應(yīng)用于葡萄成熟過程中抗病性的研究。他們將獼猴桃病原菌誘導(dǎo)型啟動子PR10和基因Vst1構(gòu)建成嵌合基因?qū)肫咸阎羞M行表達，獲得的大部分轉(zhuǎn)基因株系中Res產(chǎn)量都有所提高，產(chǎn)量為非轉(zhuǎn)基因株系的5–100倍，且這些Res含量升高株系的離體葉片在受到灰霉菌感染時，感病癥狀均大幅減輕，表明病原菌誘導(dǎo)型啟動子和抗性基因的組合在增加葡萄對真菌的抗性及耐受性方面具有一定作用，但具體作用機制及應(yīng)用前景還有待進一步驗證[39]。

然而，RS基因轉(zhuǎn)化所引起的受體材料抗性的改變并非完全是正向的，也存在部分受體材料對病原菌抗性未提高以及致敏的報道。2000年，Kobayashi等的研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)CaMV 35S啟動子調(diào)控的葡萄RS基因PSV25的獼猴桃葉片中有白藜蘆醇糖苷的產(chǎn)生，但這些轉(zhuǎn)基因植株并沒有對灰霉菌的侵染表現(xiàn)出抗性[17]。2004年，Giorcelli等也報道，轉(zhuǎn)CaMV 35S啟動子調(diào)控的葡萄RS基因StSy的白楊樹中檢測到順式和反式兩種白藜蘆醇糖苷的產(chǎn)生，但該轉(zhuǎn)基因植株對楊樹葉銹病Melampsora pulcherrima未表現(xiàn)抗性。研究者對相關(guān)結(jié)果的分析指出，植物的抗病性與植物體內(nèi)游離的Res和其二聚體e-葡萄素水平直接相關(guān)，而芪類的抗真菌活性與其疏水性有關(guān)，因此雖然轉(zhuǎn)基因材料中合成了Res的相關(guān)代謝產(chǎn)物白藜蘆醇糖苷，但其作為Res的可溶形式，在抗病原菌方面的生物活性可能較低，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因材料抗病能力并沒有明顯變化[20]。2009年，Hanhineva等還報道，轉(zhuǎn)葡萄RS基因NS-Vitis3的草莓中沒有檢測到預(yù)期的Res或其衍生物，但葉片代謝物中肉桂酸、香豆酸和阿魏酸衍生物含量升高，類黃酮含量降低，并且這些酚類成分的變化導(dǎo)致該轉(zhuǎn)基因草莓對灰霉病的敏感性增加，認為這種現(xiàn)象可能與草莓中苯丙氨酸代謝途徑有關(guān)，但目前對該過程了解還不夠深入，因此對這種遺傳修飾結(jié)果還不能作很好的解釋[25]。

2.2 抗自由基活性

RS基因在植物中表達產(chǎn)生的Res及其衍生物都具有多酚結(jié)構(gòu)，因此具有很強的清除自由基和抑制自由基引起的氧化損傷的能力，可在提高抗氧化酶活性、降低 H2O2和O2-等活性氧(ROS) 水平方面發(fā)揮作用。2005年，Giovanna等的研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)RS基因StSy的番茄中，反式Res的含量隨番茄果實的成熟而發(fā)生變化，且含有反式Res的轉(zhuǎn)基因果實中抗壞血酸和谷胱甘肽等抗氧化成分的初級代謝物含量上升，轉(zhuǎn)基因番茄較野生型番茄的抗氧化活性升高，脂質(zhì)過氧化程度降低[7]。Morelli等利用電子順磁共振光譜 (EPR) 對導(dǎo)入RS基因后體內(nèi)Res合成增多的轉(zhuǎn)基因番茄果實進行抗自由基活性檢測，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因番茄的抗自由基活性是普通番茄的兩倍，且這種差異隨著果實的成熟而更加明顯[40]。

植物果實抗自由基活性的升高可用于提高果實的營養(yǎng)價值。2009年，Annalisa等報道了將果實特異性啟動子TomLoxB控制的葡萄RS基因StSy導(dǎo)入番茄以提高其營養(yǎng)價值，在成熟轉(zhuǎn)基因番茄果皮中檢測到有反式Res和反式白藜蘆醇糖苷的積累，果實的抗壞血酸和抗氧化能力都有明顯升高[41]。這種營養(yǎng)效應(yīng)在試驗中也得到了證實。用經(jīng)RS基因遺傳修飾后的番茄果實飼喂老鼠，較以未經(jīng)改造的番茄飼喂的老鼠表現(xiàn)出更好的心臟機能，如心肌梗塞規(guī)模減小，心肌細胞凋亡數(shù)目減少，氧化程度降低等[40]。另有研究指出，轉(zhuǎn)RS基因的番茄果實提取物，對抗生素佛波酯 (Phorbol ester) 在單核巨噬細胞中引起的促炎作用有更好的抑制能力，推測轉(zhuǎn)基因番茄中合成的Res等芪類代謝物可能通過抑制細胞內(nèi)環(huán)加氧酶活性而發(fā)揮作用[41]。同時，這種抗自由基活性的提高還可用于許多果實，特別是農(nóng)作物相關(guān)果實的儲存。Ureňa等就曾用0.16 mmol/L的Res對采摘后的蘋果作短時間(5 s) 處理，與未處理的蘋果于室溫條件下儲存75 d后做比較，發(fā)現(xiàn)Res處理過的蘋果保存良好，而未處理的蘋果已經(jīng)腐爛變質(zhì)，顯見其有效性，但目前有關(guān)轉(zhuǎn)RS基因果實與非轉(zhuǎn)基因果實在儲存方面差異的報道仍較少[42]。

植物體內(nèi)抗自由基活性的增強，除了有利于提高轉(zhuǎn)基因植物果實的營養(yǎng)價值和延長儲存時間，也可參與提高植物對自然界的脅迫抗性過程，如降低因紫外輻射對植物造成的傷害和延緩葉片衰老等[43]。目前，大氣中臭氧層的破壞導(dǎo)致光照中紫外輻射強度增加，對植物生長發(fā)育造成嚴重影響，表現(xiàn)為破壞蛋白質(zhì)、核酸和膜脂，影響光合系統(tǒng)和代謝產(chǎn)物合成，造成植株發(fā)育不良，農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降[44]。Res和RS基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累均受到UV誘導(dǎo)，表明它們之間存在一定的相關(guān)性。2010年，Tang等報道，花生經(jīng)UV-C處理后內(nèi)源性Res和RS基因的mRNA迅速且大量地積累，UV-C輻射前用Res處理可減少UV-C導(dǎo)致的花生葉片銹斑和枯萎，且SOD、谷胱甘肽還原酶 (GSR)、抗壞血酸過氧化物酶 (APX) 和脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR) 等物質(zhì)的活性在Res處理后都有所提高，而以3,4-亞甲基二氧肉桂酸抑制Res活性則可加劇UV-C造成的損傷，說明Res可通過影響植物體內(nèi)抗氧化酶活性以應(yīng)對UV-C引起的氧化脅迫[45]，轉(zhuǎn)入RS基因以提高受體植物體內(nèi)Res含量可作為一種減少紫外輻射造成植物傷害的有效途徑。研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)RS基因的煙草受紫外脅迫后傷害癥狀較野生型輕，且轉(zhuǎn)基因煙草株系脅迫損傷后其恢復(fù)情況與體內(nèi)Res含量正相關(guān)，說明轉(zhuǎn)RS基因在緩解植株紫外損傷方面有一定作用[29]。

葉片衰老是植物生長過程中的正常生理現(xiàn)象，除自然老化外，自然界中的諸多脅迫因素，如光照不足、紫外輻射、低溫、干旱、營養(yǎng)缺乏、機械損傷和病原體侵染等，都能引起植物葉片早衰。葉片早衰伴隨著光合作用能力下降、蛋白質(zhì)降解和脂質(zhì)過氧化，直接導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量銳減，是全球農(nóng)作物產(chǎn)量損失的一個主要原因[46]。前文所述，Res的積累可降低植物細胞內(nèi)ROS水平，從而推測其可直接作用于延緩植物葉片衰老，RS基因的異源轉(zhuǎn)化與受體植物延緩葉片衰老之間存在一定相關(guān)性。本實驗室前期研究中，已將RS基因PNRS1轉(zhuǎn)入水稻品種“圣稻13”中進行表達[30]，目前正以獲得的轉(zhuǎn)基因水稻為材料，對RS基因與紫外脅迫、葉片衰老等性狀的相關(guān)性進行研究。同時，Res可降低UV對動物細胞的損傷及延長微生物與動物壽命的研究已有報道[2]，然而關(guān)于轉(zhuǎn)RS基因植物中Res及其衍生物的積累如何參與植物抗UV脅迫以及延緩葉片衰老的研究還鮮有報道，隨著對Res這種物質(zhì)及抗自由基活性研究的深入，這些問題有望被逐一解答。

2.3 花青素著色改變和雄性不育現(xiàn)象

研究報道，RS基因經(jīng)異源轉(zhuǎn)化、表達后，大部分受體植物的生長發(fā)育正常，但在煙草、擬南芥和番茄等少數(shù)物種中發(fā)現(xiàn)，RS基因的過表達對花青素著色和花粉發(fā)育具有一定影響。1997年，F(xiàn)ischer等的研究結(jié)果顯示，過表達RS基因Vst1的煙草株系花色著色發(fā)生改變，究其原因可能與導(dǎo)入的RS與內(nèi)源CHS競爭底物相關(guān)，并指出而該特性可應(yīng)用于改變花色的研究中[31]。2011年，Liu等報道，轉(zhuǎn)虎杖RS基因PcRS的擬南芥種子的種皮顏色與野生型擬南芥種子的種皮顏色存在差異，檢測表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥中花青素含量明顯下降，而CHS基因表達未受影響，認為導(dǎo)入的外源RS與植物內(nèi)源CHS在底物利用上存在競爭從而導(dǎo)致該表型的出現(xiàn)[12]。2012年，Rimando等也報道，轉(zhuǎn)高粱O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因SbOMT3和花生RS基因AhRS3的煙草中，雖檢測到具有更高生物活性的Res衍生物紫檀芪的積累，但轉(zhuǎn)基因煙草花色著色降低，二氫槲皮素衍生的黃酮類和苯丙氨酸結(jié)合的多胺類成分大幅下降，文中指出RS基因的轉(zhuǎn)化應(yīng)考慮將其對苯丙氨酸衍生代謝物的影響最小化[36]。綜合以上研究結(jié)果，顯示煙草和擬南芥中花青素著色改變，與外源轉(zhuǎn)入RS基因后合成的表達產(chǎn)物RS與受體植物內(nèi)源的CHS競爭底物直接相關(guān)，即RS基因過表達使得RS積累，導(dǎo)致CHS可利用底物減少，以致合成花青素所需的類黃酮等代謝物合成減少而引起花色改變。然而，除煙草和擬南芥外，其他植物中的轉(zhuǎn)RS基因研究并未提及這種表型改變，且研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)RS基因的地黃和啤酒花生長發(fā)育均正常[9,24]，這或許與外源RS基因表達水平較低，或這些受體植物內(nèi)源的丙二酰輔酶A等底物水平較高有關(guān)。

RS基因的表達還可導(dǎo)致花粉雄性不育。Fischer等報道，過表達RS基因Vst1的煙草株系表現(xiàn)出完全的雄性不育，而在基因表達水平較低的株系中雄性不育現(xiàn)象則不是很明顯，且當(dāng)Vst1基因由金魚草Antirrhinum majus絨氈層特異性啟動子tap1驅(qū)動表達時，所有株系均表現(xiàn)出雄性不育現(xiàn)象，說明RS基因與花粉發(fā)育及育性有一定的相關(guān)性；另外，實驗結(jié)果還顯示，外源補加CHS所需的前體物質(zhì)可在一定程度上緩解花粉雄性不育，因此推測，花粉育性的改變可能也是因為導(dǎo)入的RS基因與內(nèi)源CHS競爭底物，使得類黃酮等物質(zhì)的合成減少所致[31]。但隨著研究的深入，研究者否認了類黃酮等物質(zhì)合成減少導(dǎo)致花粉敗育的可能性。2006年，H?fig等的研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化松樹雄果特異性啟動子PrMALE1所驅(qū)動的RS基因的煙草，有70%表現(xiàn)出完全的雄性不育表型，顯微觀察顯示轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草在花粉發(fā)育過程中存在差異，失活花粉的孢子外壁層與正?；ǚ鄣脑诮Y(jié)構(gòu)上有所不同，但孢子花粉素的合成并沒有受影響，且黃酮類物質(zhì)只在正?；ǚ郯l(fā)育的晚期產(chǎn)生，因此排除了黃酮類物質(zhì)合成減少是導(dǎo)致花粉敗育的原因[47]。2011年，Ingrosso等的研究結(jié)果也表明，轉(zhuǎn)入葡萄RS基因StSy的番茄表現(xiàn)為花粉雄性不育，其花粉顯微結(jié)構(gòu)與正常花粉的存在差異，轉(zhuǎn)基因番茄中柚皮素合成明顯下降，其他糖基化類黃酮物質(zhì)含量上升，該結(jié)果進一步排除了類黃酮合成下降是導(dǎo)致番茄單性結(jié)實的原因[48]。同時，對其他成分的分析發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素和孢子花粉素合成所需前體物質(zhì)香豆酸和阿魏酸的含量明顯下降，推測這些結(jié)構(gòu)成分的破壞可能是導(dǎo)致花粉失活的原因，但具體機制還有待于進一步驗證[48]。綜合以上研究成果，認為RS基因的轉(zhuǎn)化在一定程度上可導(dǎo)致部分受體材料雄性不育，該現(xiàn)象在遺傳轉(zhuǎn)化過程中應(yīng)受到一定的關(guān)注。同時，該特性在雜交育種中也具有潛在的應(yīng)用價值。

3 RS基因在微生物中的轉(zhuǎn)化及應(yīng)用

RS基因在微生物中的轉(zhuǎn)化，主要是為構(gòu)建工業(yè)化生產(chǎn)Res的平臺作準備。鑒于Res等植物次級代謝產(chǎn)物都具有多樣化的生物活性，故在醫(yī)藥、保健和食品等行業(yè)存在廣泛的需求，該方面的工作被認為是應(yīng)對這些需求的一條有效途徑。Res屬于聚酮類化合物家族中的芪合物家族，具有多酚結(jié)構(gòu)，因此利用RS基因在微生物或動物細胞中代謝產(chǎn)生Res，需保證苯丙氨酸類底物或酪氨酸類底物的充足，以供代謝使用，即需在微生物中導(dǎo)入相關(guān)基因構(gòu)建Res合成途徑。已知酵母中存在RS的底物丙二酰輔酶A，但是沒有p-香豆酰輔酶A，所以在酵母中引入RS的催化反應(yīng)，需要先使酵母產(chǎn)生p-香豆酰輔酶A。Res在酵母中代謝合成的一個實例是基于白酒品質(zhì)的改善，即葡萄中Res主要積累于果皮中，而在果肉中含量很低，這使得帶果皮發(fā)酵產(chǎn)生的紅酒中Res含量明顯高于白酒。于是Becker等構(gòu)建了楊樹Hybrid poplar輔酶A連接酶基因4CL216和RS基因Vst1的共表達系統(tǒng)，并轉(zhuǎn)化釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeFY23，實驗證實轉(zhuǎn)基因酵母菌株能夠?qū)⑵咸压泻械某煞謕-香豆酸代謝生成p-香豆酰輔酶A，進而合成Res，從而提高發(fā)酵產(chǎn)生的紅酒和白酒中Res含量，以提高酒類的品質(zhì)[49]。類似的方法也被應(yīng)用于大腸桿菌，Watts等報道了將花生RS基因和擬南芥4-香豆酰輔酶A連接酶基因4CL1共轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coliBW27784，在培養(yǎng)基中通過添加4-香豆酸后，可在產(chǎn)物里檢測到大于100 mg/L的Res[50]。

然而，如何通過條件優(yōu)化以達到提高Res產(chǎn)量的目的，是廣大科研工作者面臨的一大難題。表2列出了在不同培養(yǎng)條件下，不同酵母和大腸桿菌菌株中Res的合成及產(chǎn)出情況。目前認為，影響Res產(chǎn)量的因素主要包括菌株、目標基因來源、載體、培養(yǎng)基和前體等，不同研究者選取的條件不同，著重的優(yōu)化方向也不同。Zhang等的研究結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)化擬南芥4CL基因和葡萄RS基因的酵母，在添加4-香豆酸的培養(yǎng)基中可合成Res，但當(dāng)從紅假單胞菌Rhodobacter sphaeroides中分離的一個翻譯融合蛋白加入到4CL和RS之間后，酵母細胞的Res產(chǎn)量由0.65 mg/L提高到5.25 mg/L，說明4CL和RS這兩種酶的協(xié)同作用有利于Res的合成，該實驗室進一步對合成條件進行了優(yōu)化，最終可使酵母細胞中Res的產(chǎn)量達到14.4 mg/L[51]。2010年，Sydor等報道，共轉(zhuǎn)化擬南芥4CL基因和葡萄RS基因的酵母，在富營養(yǎng)YEPD培養(yǎng)基中的Res產(chǎn)量比在普通SD培養(yǎng)基中的高，而都生長于YEPD培養(yǎng)基中時，酵母菌Saccharomyces cerevisiaeCEN.PK2-1的Res產(chǎn)量為262 mg/L，而酵母菌S. cerevisiaeBarra Grande的Res產(chǎn)量為391 mg/L，這是目前酵母中Res產(chǎn)量的最高報道[52]。2011年，Lim等比較了不同物種來源的RS基因、不同表達系統(tǒng)、不同遺傳背景和底物水平對轉(zhuǎn)基因大腸桿菌合成Res能力的影響，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化含有擬南芥4CL基因和葡萄RS基因的pUC系統(tǒng)的大腸桿菌 (BW27784) 株系中，Res產(chǎn)量可達1.4 g/L，進一步在培養(yǎng)基中加入0.05 mmol/L脂肪酸合成抑制劑淺藍菌素(Cerulenin) 后，Res產(chǎn)量可增高至2.3 g/L[53]。以上這些對培養(yǎng)條件和Res合成影響因子的研究，將對在微生物中構(gòu)建工業(yè)化生產(chǎn)Res等植物代謝物的平臺起到極大的促進作用。

表2 通過基因工程手段在微生物中進行Res的生產(chǎn)Table 2 Production of Res in microbes by genetic engineering

此外，2009年，Trantas等的研究結(jié)果表明，共導(dǎo)入楊樹苯丙氨酸解氨酶PAL、細胞色素P450還原酶CPR、大豆肉桂酸4-羧化酶C4H、4CL以及葡萄RS后的酵母，能夠利用苯丙氨酸合成Res[56]。2012年，Shin等也報道，共轉(zhuǎn)化苯丙氨酸解氨酶基因PAL、擬南芥肉桂酸4-羧化酶基因C4H、擬南芥4CL基因和花生RS類基因的釀酒酵母，在含有2%半乳糖的培養(yǎng)基中可產(chǎn)生2.6 mg/Lp-香豆酸和3.3 mg/L Res，進一步在原重組酵母的基礎(chǔ)上過表達乙酰輔酶A羧化酶基因ACC1以解決酵母中丙二酰輔酶A缺乏的問題后，重組酵母中Res的產(chǎn)量提高到了4.3 mg/L，當(dāng)酪氨酸添加到培養(yǎng)基中后，Res的產(chǎn)量可達到5.8 mg/L[55]。該方面的研究為利用廉價氨基酸實現(xiàn)高經(jīng)濟效益Res的生產(chǎn)提供了線索及參考依據(jù)，預(yù)期可產(chǎn)生較大的經(jīng)濟效益。

4 研究展望

轉(zhuǎn)RS基因旨在增加植物體內(nèi)Res及其衍生物的積累，以提高植物應(yīng)對病原菌脅迫和非生物脅迫的能力，滿足人們對健康及保健產(chǎn)品日益增加的需求。本實驗室前期研究結(jié)果表明：轉(zhuǎn)RS基因不僅可提高植株對病菌的抗性，更能增加植株應(yīng)對紫外脅迫時的緩解能力，以及通過降低植物體內(nèi)ROS的水平，從而對延緩葉片衰老起到積極作用。隨著RS基因被越來越多的應(yīng)用于不同物種的基因工程研究，特別是農(nóng)作物的遺產(chǎn)改良及品種培育，對于RS如何參與脅迫響應(yīng)及其作用機制還有待深入研究，以期進一步將RS及其代謝產(chǎn)物Res的生物學(xué)特性，如抗自由基活性、育性等，應(yīng)用于植物抗脅迫和生長發(fā)育調(diào)控過程；同時，通過轉(zhuǎn)入RS基因從而提高受體植物自身的營養(yǎng)附加值也是值得關(guān)注的一個方面。此外，提高轉(zhuǎn)RS基因的重組微生物中 Res的產(chǎn)量，從而形成有效的經(jīng)濟化生產(chǎn)平臺，以應(yīng)對 Res在食品、保健和醫(yī)藥等行業(yè)的需求也是一種發(fā)展的必然趨勢。

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