趙心清，張明明，徐桂紅，許建韌，白鳳武

大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024

釀酒酵母廣泛應(yīng)用于食品、釀造及生物能源生產(chǎn)等不同領(lǐng)域，良好的細(xì)胞活性有利于增加生物量的積累，促進(jìn)細(xì)胞循環(huán)使用，提高發(fā)酵效率，但釀酒酵母在生長(zhǎng)和發(fā)酵過(guò)程中，尤其是在工業(yè)生產(chǎn)條件下，經(jīng)常受到高濃度乙醇、極端溫度 (冷凍或高溫等)、低pH及高滲透壓等環(huán)境脅迫因素的影響，這些環(huán)境脅迫條件抑制細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝，從而影響了生產(chǎn)效率。因此，釀酒酵母細(xì)胞對(duì)環(huán)境脅迫因素的反應(yīng)和耐受性機(jī)制一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)[1-5]。

燃料乙醇是目前廣泛生產(chǎn)使用的可再生清潔能源，以來(lái)源豐富、價(jià)格低廉的纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但目前限制燃料乙醇大規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵問(wèn)題是成本過(guò)高。在纖維素乙醇生產(chǎn)中，原料預(yù)處理過(guò)程中產(chǎn)生的弱酸類﹑醛類和酚類等抑制物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)酵具有抑制作用，這些抑制物中，弱酸類化合物中的乙酸含量最高。乙酸由木質(zhì)纖維素預(yù)處理過(guò)程中木糖脫乙酰作用生成，在纖維素原料水解液中的濃度受所使用的生物質(zhì)種類及預(yù)處理技術(shù)的影響而不同，但濃度大約在1–10 g/L[6]。釀酒酵母不同菌株對(duì)乙酸的耐受性不同，如當(dāng)乙酸濃度大于2 g/L時(shí)，木糖共發(fā)酵重組酵母6508-127的木糖利用率和生物量積累受到明顯影響，乙酸濃度為10 g/L時(shí)，酵母細(xì)胞停止利用木糖和生長(zhǎng)，而絮凝酵母SPSC01可在15 g/L乙酸中生長(zhǎng)和發(fā)酵[5,7]。作為纖維素原料水解液中主要的毒性副產(chǎn)物，乙酸對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和乙醇發(fā)酵具有強(qiáng)抑制作用，但長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)乙酸如何產(chǎn)生毒性，酵母細(xì)胞如何響應(yīng)乙酸脅迫，以及如何調(diào)整代謝抵抗乙酸的毒性了解得還不夠深入。與纖維素水解液中的其他抑制物相比，乙酸對(duì)細(xì)胞全局基因轉(zhuǎn)錄的影響要大很多，如當(dāng)細(xì)胞在分別含有乙酸、糠醛和羥甲基糠醛等抑制物質(zhì)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的時(shí)候，轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明[8]，有150個(gè)基因在乙酸影響下表達(dá)出現(xiàn)顯著變化，其中 120個(gè)是特異響應(yīng)乙酸的，含有72個(gè)上調(diào)基因，而在含有糠醛和羥甲基糠醛的培養(yǎng)基中，分別只有27個(gè)和31個(gè)基因的表達(dá)出現(xiàn)明顯變化。因此，乙酸耐性分子機(jī)制的功能基因組研究引起了普遍關(guān)注。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)在毒性水平的乙酸作用條件下釀酒酵母細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)及耐受性的分子機(jī)理進(jìn)行了深入研究，利用細(xì)胞全局轉(zhuǎn)錄分析、蛋白組學(xué)分析及單基因敲除突變體文庫(kù)表型組等手段，發(fā)現(xiàn)了很多新的與酵母菌乙酸耐性相關(guān)的基因，本文著重介紹近年來(lái)酵母菌乙酸耐性的功能基因組研究進(jìn)展。

1 乙酸毒性的分子機(jī)制

胞內(nèi)環(huán)境酸化是乙酸抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的主要原因。當(dāng)培養(yǎng)基的 pH值低于乙酸的解離常數(shù)(pKa 4.76) 時(shí)，分子態(tài)的乙酸可通過(guò)自由擴(kuò)散或水甘油通道蛋白Fps1p以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ady2p和Jen1p轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)[9-11]，從而導(dǎo)致胞內(nèi)酸化，因此乙酸毒性與細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境pH有關(guān)。研究在pH值分別為 5、5.5和6時(shí)不同濃度的乙酸對(duì)酵母葡萄糖和木糖共發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)隨著pH值的增加，乙酸對(duì)葡萄糖和木糖利用的抑制得到明顯的緩解；如在15 g/L乙酸條件下，pH為5時(shí)，60 g/L葡萄糖需要60 h才被消耗完，而在 pH為6時(shí)只需12 h完成發(fā)酵[12]，因此調(diào)節(jié)pH值可以緩解乙酸對(duì)酵母的毒害作用。但是酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵的最適pH值偏酸性，而且當(dāng)培養(yǎng)基中存在高濃度乙酸時(shí)不可能通過(guò)加入大量的堿來(lái)調(diào)節(jié)其pH值，提高發(fā)酵菌株的乙酸耐受性，可保證酵母細(xì)胞在乙酸濃度較高的條件下具有較好的細(xì)胞活性。

利用約5 000多個(gè)BY4741宿主背景的釀酒酵母菌單基因敲除突變體文庫(kù)研究與乙酸耐性相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)有 650個(gè)基因與乙酸響應(yīng)相關(guān)[13]。酵母細(xì)胞對(duì)乙酸的響應(yīng)及乙酸的毒性機(jī)制見(jiàn)圖 1，包括與乙酸轉(zhuǎn)運(yùn)、胞內(nèi)酸化后胞內(nèi)pH維持、細(xì)胞壁重構(gòu)、轉(zhuǎn)錄因子對(duì)細(xì)胞代謝的全局調(diào)控、氧化脅迫反應(yīng)以及金屬離子對(duì)乙酸耐性的作用等[11,13-18]。本文將分別就這些過(guò)程相關(guān)的功能基因組研究進(jìn)行綜述。

1.1 細(xì)胞壁相關(guān)蛋白與乙酸耐性

利用釀酒酵母 BY4741宿主來(lái)源的單基因敲除的突變體，通過(guò)考察其在含乙酸平板上的生長(zhǎng)情況，鑒別了多個(gè)與細(xì)胞壁功能相關(guān)的基因[13]，其功能可能與乙酸脅迫條件下細(xì)胞的生長(zhǎng)有關(guān)，這些基因的功能包括合成細(xì)胞壁組分的基因，如MNN2、MNN9、FKS1、ROT2，與細(xì)胞壁合成調(diào)控作用相關(guān)的基因，如ROM2，以及功能未知但敲除后影響出芽的基因，如BEM4等。細(xì)胞壁葡聚糖酶基因EGT2和SCW11分別與分裂后的細(xì)胞分離和有性生殖中細(xì)胞結(jié)合有關(guān)，其敲除后乙酸和乳酸的耐性均得到提高[18]，此外，細(xì)胞壁功能相關(guān)的基因SED1和SPI1都編碼與脅迫反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞壁蛋白，SPI1的敲除可導(dǎo)致細(xì)胞在乙酸中的生長(zhǎng)受到抑制[19]，并發(fā)現(xiàn)該基因受轉(zhuǎn)錄因子Haa1p和Msn2p的調(diào)控[20]，但SED1敲除后，只提高了乳酸的耐受性，說(shuō)明不同有機(jī)酸對(duì)細(xì)胞的毒性和細(xì)胞的反應(yīng)存在一定差異。推測(cè)乙酸脅迫條件下細(xì)胞壁出現(xiàn)重構(gòu)，因此與細(xì)胞壁合成相關(guān)的基因及一些細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白的合成發(fā)生變化。細(xì)胞壁的合成能減少多孔的結(jié)構(gòu)，因此通過(guò)細(xì)胞壁的重構(gòu) (Cell wall remodeling) 阻止乙酸通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，從而減少乙酸的毒性。

1.2 膜蛋白及膜磷脂合成相關(guān)基因與乙酸耐性

細(xì)胞膜蛋白中與乙酸耐性相關(guān)的包括乙酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白 (如Fps1p)，以及功能與質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)偶聯(lián)的其他膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。釀酒酵母通過(guò)膜質(zhì)ATP酶維持胞內(nèi)pH的穩(wěn)定，也通過(guò)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的重構(gòu) (Membrane reconfiguration) 降低對(duì)分子態(tài)乙酸的吸收和防止乙酸對(duì)膜的損傷。為維持質(zhì)膜電位、防止胞內(nèi)酸化，細(xì)胞膜上的腺苷三磷酸酶 H+-ATPase (PMA1基因編碼) 可水解ATP產(chǎn)生能量，將質(zhì)子泵出細(xì)胞來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)正常的中性環(huán)境。因此在弱酸存在時(shí)，必須有足夠的能量供細(xì)胞利用，但是在高濃度乙酸存在時(shí)，ATP消耗過(guò)多導(dǎo)致缺乏，細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)子不能完全被泵出，從而引起胞內(nèi)酸化，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝[16]。

圖1 釀酒酵母中乙酸脅迫的反應(yīng)機(jī)制Fig. 1 Mechanisms of acetic acid stress response in S. cerevisiae cells.

細(xì)胞對(duì)乙酸毒性的很重要的反應(yīng)是阻止乙酸進(jìn)入細(xì)胞。細(xì)胞可通過(guò)瞬時(shí)激活Hog1p蛋白激酶，將質(zhì)膜水甘油通道蛋白 Fps1p磷酸化并發(fā)生內(nèi)吞，因此減少乙酸通過(guò)這個(gè)孔蛋白的擴(kuò)散進(jìn)入[21]。敲除 Fps1p編碼基因可提高釀酒酵母乙酸耐性，并提高乙醇產(chǎn)率[22]。

日本學(xué)者對(duì)一株耐乙酸的釀酒酵母菌ATCC 38555進(jìn)行全基因組轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)，與不耐受乙酸的菌株相比，乙酸沖擊條件下 ATCC 38555菌株的TOP2轉(zhuǎn)錄上調(diào)更明顯，是對(duì)照菌提高倍數(shù)的 3倍，提示該膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能與乙酸耐性有關(guān)。TOP2編碼多胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其對(duì)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與質(zhì)子的轉(zhuǎn)運(yùn)偶聯(lián)，已有報(bào)道表明，TOP2敲除后菌株的乙酸耐性下降，而該蛋白是與乙酸適應(yīng)相關(guān)的重要調(diào)節(jié)蛋白 Haa1p的下游調(diào)控蛋白，但該蛋白在乙酸耐性中的具體作用還不清楚[23]。

由于細(xì)胞膜的成分在細(xì)胞脅迫反應(yīng)中具有重要作用，而細(xì)胞膜中磷脂的組成和比例對(duì)膜的特性具有重要影響[24]。研究者對(duì)乙酸、糠醛和酚類物質(zhì)聯(lián)合處理?xiàng)l件下細(xì)胞膜磷脂的成分和相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)對(duì)混合抑制物具有良好耐受性的 T菌株具有較長(zhǎng)的磷脂脂肪酸鏈，親本菌株耐性不好的 P菌株中多個(gè)編碼脂肪酸延長(zhǎng)酶和脂肪酸合成酶的基因，包括FEN1、SUR4、FAS1和FAS2在混合抑制物中生長(zhǎng)后表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，但在耐性好的 T菌株中除了FEN1基因外沒(méi)有明顯下調(diào)，而且FEN1在T菌株中的下調(diào)也不如P菌株明顯。此外，T菌株同時(shí)具有較低的磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS) 含量和較慢的PS向磷酯酰乙醇胺 (Phosphatidylethanolamine, PE) 轉(zhuǎn)化的效率，作者發(fā)現(xiàn)編碼PS合成酶的CHO1基因在耐性較好的菌株中受抑制物沖擊后表達(dá)下調(diào)，而親本菌株耐性不好的P菌株CHO1基因在受抑制物沖擊后表達(dá)上調(diào)。磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine, PC) 由 PE經(jīng)過(guò)甲基化后合成，在該研究中還發(fā)現(xiàn)，耐性好的 T突變株具有較低的 PE/PC的比例，與此相應(yīng)的，T菌株具有較高的CHO2基因轉(zhuǎn)錄水平，該基因編碼一個(gè)關(guān)鍵的PE甲基化酶[25]。

1.3 能量代謝相關(guān)基因與乙酸耐性

細(xì)胞的能量主要來(lái)自糖酵解、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化，由于膜質(zhì)ATP酶和液泡ATP酶泵出質(zhì)子抵抗胞內(nèi)酸化需要消耗能量，所以能量代謝與乙酸耐性密切相關(guān)。利用單基因敲除的突變體文庫(kù)進(jìn)行乙酸耐性相關(guān)基因的篩選發(fā)現(xiàn)，敲除HXK2、PFK1、LPD1、PYC1、ATP1和COX9等和能量代謝相關(guān)的基因后，細(xì)胞在含有4.2–5.4 g/L乙酸的平板上生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制甚至無(wú)法生長(zhǎng)[13]。日本學(xué)者對(duì)耐乙酸的釀酒酵母菌ATCC 38555在6 g/L乙酸處理30 min后的全局基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行分析結(jié)果表明，與能量代謝相關(guān)的很多基因，包括ATP15、ATP17、ATP18、COX7、COX9、COX12和COX13等表達(dá)明顯上調(diào)，而乙酸耐性不強(qiáng)的酵母菌在同樣的乙酸沖擊條件下未發(fā)現(xiàn)這些基因表達(dá)的明顯變化，顯示了耐性菌快速調(diào)節(jié)能量代謝相關(guān)基因是其對(duì)乙酸的耐性提高的一個(gè)原因[23]。

我國(guó)天津大學(xué)學(xué)者對(duì)工業(yè)酵母在含 18 g/L乙酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 min后轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果中，揭示了高濃度乙酸沖擊條件下，與呼吸作用相關(guān)的細(xì)胞色素C氧化還原酶基因COR1、COX11、PET309、COX20和CBP4表達(dá)明顯下調(diào)，同時(shí)，線粒體 ATP酶基因ATP4和與能量產(chǎn)生有關(guān)的線粒體無(wú)機(jī)焦磷酸酶基因PPA2的表達(dá)也受到明顯抑制，另外，負(fù)責(zé)糖原代謝和海藻糖代謝的基因表達(dá)也出現(xiàn)下調(diào)，表明高濃度乙酸沖擊對(duì)能量?jī)?chǔ)存、電子傳遞、以及 ATP再生具有一定影響。作者還發(fā)現(xiàn)很多線粒體核糖體蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)明顯下調(diào)，表明高濃度乙酸對(duì)線粒體的功能具有重要影響作用[26]。對(duì)乙酸糠醛等脅迫抑制化合物具有良好耐性的菌株及親本菌株在乙酸糠醛酚類同時(shí)存在條件下進(jìn)行比較蛋白組分析，發(fā)現(xiàn)糖酵解途徑關(guān)鍵酶Eno1p、Fba1p和Adh1p等在耐性菌株和敏感菌株中均上調(diào)，但在敏感菌中上調(diào)更明顯，說(shuō)明敏感菌需產(chǎn)生更多的能量抵抗抑制劑的毒害作用[27]。

1.4 氨基酸合成及蛋白代謝與乙酸耐性

氨基酸代謝對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和正常代謝至關(guān)重要。細(xì)胞在乙酸毒性作用下氨基酸的合成可能受到抑制，蛋白折疊和蛋白降解也受到影響，因此氨基酸合成和蛋白代謝基因的功能與乙酸耐性相關(guān)。對(duì)酵母菌單基因敲除突變體在乙酸平板上的生長(zhǎng)比較結(jié)果表明，參與甲硫氨酸和半胱氨酸合成的基因MET4和CYS3，參與組氨酸合成的HIS4，參與甘氨酸合成相關(guān)的GLY1和谷氨酰胺合成的GDH1基因破壞后，細(xì)胞在乙酸平板上的生長(zhǎng)受到影響[13]。前期研究還發(fā)現(xiàn)，高濃度乙酸沖擊可引起細(xì)胞內(nèi)精氨酸、組氨酸和色氨酸合成基因的上調(diào)[26]，說(shuō)明氨基酸合成與乙酸毒性的反應(yīng)密切相關(guān)。進(jìn)一步的研究表明，氨基酸代謝的變化不僅僅與氨基酸合成蛋白有關(guān)，也與蛋白降解有關(guān)[27]。在添加含有乙酸的混合抑制劑的處理后，與蛋白折疊和蛋白降解相關(guān)的很多蛋白表達(dá)均出現(xiàn)上調(diào)，其中變化較明顯的包括Hsp60p、Dka1p和20S蛋白酶體Pre8p以及Pre1p等，因此作者推測(cè)，在乙酸等抑制物的存在條件下，細(xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫，因此造成蛋白變性，而蛋白折疊和降解相關(guān)的蛋白表達(dá)，有助于細(xì)胞恢復(fù)正常的生理代謝功能。

1.5 與乙酸耐性相關(guān)的金屬代謝

許多金屬離子是細(xì)胞中多種酶的輔酶，其吸收和在細(xì)胞內(nèi)的移動(dòng)影響細(xì)胞代謝。利用酵母菌單基因敲除突變體研究乙酸耐性相關(guān)基因時(shí)發(fā)現(xiàn)[13]，個(gè)別金屬離子代謝相關(guān)基因與乙酸耐性有關(guān)。與鉀離子吸收相關(guān)的基因有TRK1和ARL1，前者是鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，后者作為GTPase調(diào)控鉀離子的內(nèi)流。TRK1敲除后的菌株在4.2 g/L乙酸平板上完全不能生長(zhǎng)，而ARL1敲除后細(xì)胞可有微弱生長(zhǎng)。培養(yǎng)基中添加0.01 mol/L和0.02 mol/L的氯化鉀可明顯緩解2.4 g/L乙酸對(duì)細(xì)胞的毒性。添加鉀離子能提高酵母的乙酸耐受性，主要原因是在乙酸脅迫條件下，膜質(zhì)ATP酶Pma1p泵出質(zhì)子以維持胞內(nèi)pH穩(wěn)定性，而鉀離子是主要回流的離子，因此乙酸脅迫條件下鉀離子的吸收有助于質(zhì)膜的電位平衡。與鐵吸收相關(guān)基因FRE3、FIT2和FIT3敲除后，細(xì)胞在乙酸平板上的生長(zhǎng)也受到抑制，但不如ARL1破壞后生長(zhǎng)抑制程度明顯，培養(yǎng)基中添加1–100 μmol/L FeSO4也沒(méi)有看到對(duì)乙酸毒性的緩解作用，但發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在4.2 g/L乙酸中培養(yǎng)30 min后，胞內(nèi)鐵的含量比沒(méi)有經(jīng)過(guò)乙酸脅迫處理的細(xì)胞提高了 2倍，說(shuō)明乙酸可促進(jìn)鐵的吸收。由于鐵可誘導(dǎo)氧化脅迫，因此細(xì)胞對(duì)鐵的獲得、代謝及氧化脅迫相關(guān)基因和蛋白的調(diào)控比較嚴(yán)格，這解釋了為什么添加鐵對(duì)細(xì)胞的乙酸耐性沒(méi)有影響。本課題組近期研究表明，培養(yǎng)基中添加硫酸鋅可明顯改善細(xì)胞在高濃度乙酸(10–15 g/L) 條件下的乙醇發(fā)酵[7]。對(duì)高濃度乙酸存在條件下鋅對(duì)細(xì)胞全局基因轉(zhuǎn)錄的影響進(jìn)行研究，初步結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與金屬轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的多個(gè)基因在鋅添加樣品中出現(xiàn)明顯下調(diào)，這些基因除了編碼鋅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白(包括 Zrt1p、Zrt2p和Yke4p)以外，還包括銅轉(zhuǎn)運(yùn)(Ctr3p高親和質(zhì)膜銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)、鉀轉(zhuǎn)運(yùn)(Kha1p，高爾基體K+/H+抗轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)以及鐵轉(zhuǎn)運(yùn)(Mmt2p，負(fù)責(zé)線粒體鐵積累的未知金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)相關(guān)的蛋白等。這些金屬代謝相關(guān)蛋白基因轉(zhuǎn)錄的變化與乙酸耐性的關(guān)系正在研究中。

1.6 與乙酸耐性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子

通過(guò)乙酸耐受性相關(guān)的基因聚類分析，與之相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子包括 Msn2p、Rim101p、Haa1p、Skn7p、War1、Pdr1、Stb5p、Nrg1p、Cbf1p、Gcr2p、Mig1p、Swi6p、Ume6p、Stp1p、Ace2p、Ino2p、Cst6p和 Rtg3p等[13]，其中 Haa1p是最主要的調(diào)節(jié)蛋白，負(fù)責(zé)調(diào)控 80%與乙酸耐性相關(guān)的基因[28-29]。對(duì)S. cerevisiaeBY4741親本以及HAA1△突變體在含3 g/L乙酸、pH值為4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 h，發(fā)現(xiàn)破壞子的延滯期比野生型延長(zhǎng)了2.5倍，而且在此時(shí)期破壞子中活細(xì)胞數(shù)目相對(duì)野生型減少，而同樣條件下不含酸的培養(yǎng)基中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，因此提出HAA1基因的表達(dá)可以縮短酵母在乙酸脅迫條件下生長(zhǎng)的延滯期[13]。

在 Haa1p調(diào)控的靶基因很多，但很多基因的具體功能還不清楚。這些靶基因中，SAP30和HRK1表現(xiàn)出最強(qiáng)烈的對(duì)乙酸毒害的保護(hù)作用。SAP30編碼脫乙酰酶復(fù)合體的一個(gè)亞基，HRK1編碼調(diào)節(jié)質(zhì)膜轉(zhuǎn)錄活性的蛋白家族中的一個(gè)蛋白激酶。敲除HRK1基因的酵母菌體內(nèi)的乙酸的積累明顯增加，提示這兩個(gè)基因的作用很可能與降低胞內(nèi)乙酸的含量有關(guān)[29]。Haa1p調(diào)節(jié)的基因還包括上文提到的編碼細(xì)胞質(zhì)膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Tpo2p和Tpo3p。過(guò)表達(dá)HAA1可提高釀酒酵母的乙酸耐性，并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子中TPO2和TPO3等Haa1p的靶基因上調(diào)[30]。

Haa1p轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控許多能夠響應(yīng)乙酸脅迫的基因表達(dá)。對(duì)這些可能的調(diào)控基因的啟動(dòng)子區(qū)域的 DNA結(jié)合基序 (Binding motif)的研究表明，Haa1p的最小結(jié)合基序是5'-(G/C)(A/C)GG(G/C)G-3'。已發(fā)現(xiàn)有56個(gè)基因的表達(dá)受 Haa1p的直接調(diào)控，這些基因包括編碼熱激蛋白 Hsp30p和 Hsp26p，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pdr12p、Tpo2p和 Tpo3p以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白Nrg1p、Msn4p、Mcm1p和Fkh2p等，所涉及的代謝過(guò)程包括細(xì)胞脅迫反應(yīng)、糖代謝、細(xì)胞周期控制、蛋白合成以及降解等。此外，Haa1p還可通過(guò)對(duì)Msn4p和Mcm1p等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控間接地調(diào)控近30個(gè)基因的表達(dá)，形成了復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步的研究表明，與 Haa1p親和力最高的結(jié)合基序是5'-GAGGGG-3'，含有這個(gè)基序的基因包括TPO3、TPO2、STF2和AQR1等，但雖然具有這個(gè)基序的基因TPO2在乙酸脅迫下提高18.7倍，但是同樣含有這個(gè)基序的AQR1只提高1.5倍，可見(jiàn)HAA1激活基因的表達(dá)還需要其他因子的參與。已發(fā)現(xiàn)無(wú)論培養(yǎng)基是否有乙酸存在，Haa1p都能與其下游調(diào)控基因TPO3結(jié)合，推測(cè) Haa1p在無(wú)乙酸脅迫的條件下不具有功能，可能在乙酸脅迫條件下才具有轉(zhuǎn)錄激活功能[18]。

Msn2p和Msn4p是同一個(gè)家族的鋅指蛋白，和酵母的多種耐性響應(yīng)相關(guān)，如營(yíng)養(yǎng)缺乏、高溫、高滲透壓、氧化脅迫等[31]。受 Msn2p和Msn4p調(diào)控的響應(yīng)乙酸的基因包括編碼分子伴侶蛋白Hsp26p和Sse2p的基因，與碳代謝相關(guān)的基因HXK1和GPD1和抗氧化相關(guān)的基因CTT1和GPX1等[32]，MSN2基因敲除后細(xì)胞在乙酸上的生長(zhǎng)受到抑制，但MSN4敲除對(duì)細(xì)胞在乙酸上的生長(zhǎng)影響不大，可能與Msn4p的作用比較溫和有關(guān)[13]。本課題組對(duì)高濃度乙酸存在條件下鋅添加對(duì)酵母菌全局基因轉(zhuǎn)錄影響的研究中，發(fā)現(xiàn)與未添加鋅的對(duì)照組相比，鋅添加可明顯提高M(jìn)SN2的轉(zhuǎn)錄水平 (未發(fā)表資料)，提示鋅對(duì)高濃度乙酸脅迫條件下細(xì)胞活性的保護(hù)作用可能與MSN2的作用有關(guān)，但深入的分子機(jī)理還有待探討。

Rim101p是C2H2(Cys2His2) 型鋅指蛋白，已知有35個(gè)基因受其調(diào)控，這些靶點(diǎn)基因的功能與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的維持和鐵的吸收有關(guān)，也有一些是功能未知的膜蛋白。敲除RIM101后細(xì)胞在乙酸中的生長(zhǎng)受到抑制，顯示該基因與細(xì)胞對(duì)乙酸毒性的反應(yīng)和耐性有關(guān)[33]。

Nrg1p和Nrg2p是葡萄糖抑制作用的調(diào)節(jié)因子，近來(lái)報(bào)道它們也參與酵母菌的脅迫耐性響應(yīng)基因的調(diào)控。當(dāng)NRG1和NRG2兩個(gè)基因都被敲除，菌體對(duì)高滲和氧化脅迫的抗性增強(qiáng)。Nrg所抑制的基因大都含有 STREs或者類似STRE的序列，而且還與MSN2和MSN4相關(guān)。推測(cè)NRG1/NRG2與MSN2/MSN4存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，從而避免過(guò)度響應(yīng)環(huán)境脅迫[34]。

值得指出的是，每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)靶基因的調(diào)控并不是相互獨(dú)立的，不同轉(zhuǎn)錄因子可能具有共同的下游基因。利用YEASTRACT數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.yeastract.com)，將本文討論的乙酸耐性相關(guān)基因中與能量代謝、氨基酸代謝的基因，以及與細(xì)胞壁合成相關(guān)基因和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因進(jìn)行分析，得到的這些基因與 Msn2p、Nrg1p和Haa1p之間的相互關(guān)聯(lián)見(jiàn)圖2。

圖 2 乙酸脅迫時(shí)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 Msn2p、Nrg1p和Haa1p之間的關(guān)聯(lián)Fig. 2 Transcriptional regulatory associations of Msn2p, Nrg1p and Haa1p in yeast cells under acetic acid stress. The model is based on the microarray data obtained in this study and on the information available in the YASTRACT database. Arrows indicate activation,lines indicate repression, solid lines mean documented regulation, dashed arrows or lines show potential regulation.

表 1為與乙酸脅迫反應(yīng)相關(guān)的主要相關(guān)基因[8,13,20]。除了上文中提到的基因以外，還包括與蛋白修飾相關(guān)的基因及與細(xì)胞骨架蛋白合成及形態(tài)發(fā)生相關(guān)的基因。由于乙酸對(duì)細(xì)胞的影響主要是延遲期的延長(zhǎng)，推測(cè)細(xì)胞骨架和形態(tài)發(fā)生相關(guān)基因破壞后，細(xì)胞不能在乙酸上很好生長(zhǎng)的原因與突變體細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制有關(guān)。

表1 釀酒酵母乙酸脅迫反應(yīng)相關(guān)的基因Table 1 Genes related to acetic acid stress in S. cerevisiae

2 提高乙酸耐性的代謝工程操作

對(duì)釀酒酵母乙酸耐性的功能基因組研究發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與乙酸耐性相關(guān)的基因，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了相應(yīng)的代謝工程改造方法。例如，過(guò)表達(dá)與乙酸耐受性密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因HAA1，所獲得的菌株具有較高的乙酸耐性，在7 g/L乙酸平板上能較好生長(zhǎng)，而對(duì)照在該乙酸濃度下沒(méi)有檢測(cè)到生長(zhǎng)。這是利用功能基因組研究提高乙酸耐性的典型范例。

代謝物譜 (Metabolic profiling) 分析研究發(fā)現(xiàn)，在乙酸脅迫條件下木糖發(fā)酵的過(guò)程中，非氧化性的 PPP代謝途徑代謝物核酮糖-5-磷酸、核糖-5-磷酸和景天庚酮糖-4-磷酸等明顯積累，表明乙酸明顯的減慢了木糖發(fā)酵速率, 因而通過(guò)對(duì)在這個(gè)過(guò)程中起重要作用的基因TAL進(jìn)行過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)后菌株在1.8 g/L乙酸條件下的乙醇產(chǎn)量提高了1.72倍，而且有趣的是TAL過(guò)表達(dá)突變體在0.03 mol/L乙酸條件下比在沒(méi)有乙酸條件下乙醇產(chǎn)量提高1.35倍，突變體核酮糖-5-磷酸、核糖-5-磷酸和景天庚酮糖-4-磷酸的含量都下降[35]。

對(duì)兩株發(fā)酵性能相似的菌株YJS329和ZK2在不同抑制物條件下發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、中心碳的代謝和抗氧化因子的不同是造成這兩個(gè)菌株耐受性差異的主要因素，推測(cè)ZK2菌中油酸相關(guān)的基因ELO1、FEN1和OLE1的表達(dá)量高，所以具有較高的乙酸耐性，因此選擇對(duì)ELO1在兩株酵母菌YJS329和ZK2過(guò)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)油酸分別提高了 17.6%和 9.4%，此外在高濃度乙酸 (10 g/L, pH 4.0) 沖擊2 h后，過(guò)表達(dá)ELO1的重組酵母的細(xì)胞存活率明顯提高。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，兩株菌過(guò)表達(dá)ELO1的重組菌細(xì)胞活性提高程度有一定的差距，分析是由于YJS329和 ZK2的遺傳背景的不同導(dǎo)致。因此對(duì)菌株進(jìn)行改造時(shí)需要考慮宿主遺傳背景的影響[36]。

我國(guó)浙江大學(xué)學(xué)者首次將 RNA結(jié)合蛋白Lsm6p編碼基因在木糖共發(fā)酵工業(yè)酵母中過(guò)表達(dá)，得到的轉(zhuǎn)化子對(duì)硫酸的耐受性提高，而且轉(zhuǎn)化子具有較高的木糖利用率和發(fā)酵效率。目前對(duì)于LSM蛋白在乙酸耐性中的研究還不多，其提高耐性的機(jī)理也不清楚[37-38]。

隨著利用單基因敲除突變體文庫(kù)獲得的功能基因組學(xué)信息的不斷積累，人們希望通過(guò)所獲得的信息設(shè)計(jì)代謝工程改造的方法，提高菌株的發(fā)酵效率。分析BY4741敲除突變體相關(guān)結(jié)果，研究者找到11個(gè)基因與乙醇、乙酸及另外兩種常見(jiàn)的纖維素水解液中的毒性抑制物糠醛及香草醛耐性相關(guān)的基因，并利用相應(yīng)突變體進(jìn)行超高濃度乙醇發(fā)酵及小麥秸稈水解液發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，證明BUD31和HPR1與乙醇收率和發(fā)酵速率有關(guān)，ERG1、PRS3、RAV1、PRP4和VMA8與小麥秸稈水解液中細(xì)胞活性的保持和利用該底物的發(fā)酵速率有關(guān)[39]，但這些基因在工業(yè)酵母中的作用沒(méi)有進(jìn)行研究，也沒(méi)有進(jìn)行這些基因過(guò)表達(dá)后乙醇發(fā)酵性能的評(píng)價(jià)。

3 存在問(wèn)題和展望

提高酵母菌的乙酸耐受性可以保證酵母菌發(fā)酵過(guò)程中較好的細(xì)胞活性和較高的發(fā)酵性能，隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等手段的發(fā)展，對(duì)釀酒酵母乙酸耐受性的機(jī)理研究不斷深入，然而目前存在的問(wèn)題是：

1) 目前的研究多使用轉(zhuǎn)錄組，研究基因轉(zhuǎn)錄的變化，但由于存在轉(zhuǎn)錄后和翻譯后修飾，以及蛋白間相互作用等調(diào)節(jié)，酵母菌轉(zhuǎn)錄組學(xué)的變化不一定反映到蛋白水平的變化。

2) 耐受性與乙醇發(fā)酵效率受不同的基因控制，耐性的提高不一定必然帶來(lái)發(fā)酵效率的提高[32]，因?yàn)槟托韵嚓P(guān)基因的作用只有在特定脅迫條件下才發(fā)揮作用。

3) 目前對(duì)功能基因組的研究更多地關(guān)注結(jié)構(gòu)基因的功能，但酵母菌的非編碼RNA，啟動(dòng)子活性等都對(duì)代謝工程改造具有重要影響[40-41]。

未來(lái)對(duì)釀酒酵母乙酸耐性的研究將深入揭示翻譯后修飾等水平的調(diào)節(jié)機(jī)制，并進(jìn)一步開(kāi)發(fā)非編碼RNA和啟動(dòng)子等遺傳組件，將其用于利用合成生物學(xué)手段構(gòu)建高效的發(fā)酵菌株，將具有廣闊的應(yīng)用前景。在制定代謝工程策略的時(shí)候，需要結(jié)合不同宿主背景和培養(yǎng)條件，考慮不同層次的代謝調(diào)控。隨著對(duì)釀酒酵母乙酸耐性分子機(jī)制研究的深入，更多理性的代謝工程改造將成功用于選育高效的工業(yè)釀酒酵母菌株。此外，乙酸也作為食品防腐劑用于抑制一些導(dǎo)致腐敗的酵母。對(duì)這些腐敗相關(guān)酵母的乙酸耐性機(jī)理具有深入認(rèn)識(shí)，也對(duì)食品領(lǐng)域防止食品腐敗具有重要應(yīng)用意義。

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