王曉花，章建程，王慶敏，李中付，周宏元，袁海霞

·論著·

白細(xì)胞介素-1對(duì)新生大鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞再生能力的影響

王曉花，章建程，王慶敏，李中付，周宏元，袁海霞

目的 通過(guò)在新生SD大鼠毛細(xì)胞培養(yǎng)液中加入P27抑制劑白細(xì)胞介素-1(IL-1)，觀察IL-1介導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶/細(xì)胞周期蛋白D(CDK4/cyclinD)復(fù)合體表達(dá)增強(qiáng)對(duì)毛細(xì)胞再生能力的影響。方法 提取16只7 d齡SD大鼠的內(nèi)耳基底膜上皮細(xì)胞層，按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組(8只)和IL-1組(8只)，離體培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)第7天、第14天細(xì)胞生長(zhǎng)情況，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)毛細(xì)胞內(nèi)CDK4、cyclinD的表達(dá)。結(jié)果 培養(yǎng)第7天，40倍光鏡下3個(gè)隨機(jī)視野內(nèi)IL-1組毛細(xì)胞細(xì)胞球數(shù)量(139.33±13.50)個(gè)，與對(duì)照組［(69.00±12.49)個(gè)］相比明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);培養(yǎng)第14天，毛細(xì)胞細(xì)胞球數(shù)量仍然有增多趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，IL-1組毛細(xì)胞內(nèi)CDK4和cyclinD表達(dá)增強(qiáng)，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);CDK4和cyclinD陽(yáng)性細(xì)胞率［分別為(48.23± 8.87)%和(28.43±1.34)%］增高，與對(duì)照組［分別為(35.03±1.94)%和(17.43±2.20)%］相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 IL-1可能對(duì)新生大鼠毛細(xì)胞的再生有一定的促進(jìn)作用。

毛細(xì)胞;再生;離體培養(yǎng);白細(xì)胞介素-1

近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道，新生SD大鼠耳蝸內(nèi)存在一種具有高度自我增殖能力的細(xì)胞，體外培養(yǎng)下可以誘導(dǎo)分化為具有毛細(xì)胞和神經(jīng)元標(biāo)志物的細(xì)胞。周期依賴性蛋白激酶抑制因子p27選擇性地表達(dá)于支持細(xì)胞表面，抑制支持細(xì)胞的分化。同時(shí)，p27作為細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，與細(xì)胞周期蛋白(cyclin)相互競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclindependent kinase，CDK)，從而抑制細(xì)胞周期正性調(diào)控蛋白cyclin-CDK全酶的活性［1-2］。cyclin-CDK2和cyclin-CDK4復(fù)合體是細(xì)胞周期中催化細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵酶，能夠抑制Rb蛋白的功能。Rb基因編碼的核內(nèi)磷酸化蛋白R(shí)b對(duì)毛細(xì)胞細(xì)胞周期有抑制作用，如果有效關(guān)閉該基因，則可促使毛細(xì)胞自身分裂。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在新生SD大鼠毛細(xì)胞培養(yǎng)液中加入P27的抑制劑白細(xì)胞介素-1(IL-1)，通過(guò)降低毛細(xì)胞內(nèi)P27的表達(dá)，從而促進(jìn)支持細(xì)胞轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞;同時(shí)增強(qiáng)cyclin-CDK4復(fù)合體的表達(dá)，抑制Rb蛋白的功能，促進(jìn)毛細(xì)胞自身分裂，觀察IL-1對(duì)毛細(xì)胞再生能力的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 SD大鼠16只，鼠齡7 d，由海軍醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按數(shù)字表法隨機(jī)分為2組:對(duì)照組(8只)，提取耳蝸毛細(xì)胞，在無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng);IL-1組(8只)，提取耳蝸毛細(xì)胞，在無(wú)血清培養(yǎng)液中加IL-1(10μg/L)培養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器 (1)主要試劑:IL-1 (Shenandoah公司)，10μg/L;DMEM/F12培養(yǎng)液(Invitrogin公司);B27 supplement(Invitrogin公司); bFGF，20μg/L(Invitrogin公司);EGF，20μg/L(Invitrogin公司);青霉素G(Sigma P-7794)，2.5mg;多聚賴氨酸(SIGMA公司);0.125%的胰蛋白酶(SIGMA公司);4%多聚甲醛(SIGMA公司);羊抗小鼠的二抗FITC(DSHB公司);CyclinD抗體(Santa Cruz公司);CDK4抗體(Santa Cruz公司)。(2)消化酶溶液的配制:將嗜熱菌蛋白酶(Thermolysin，Sigma公司)溶于pH 7.4的D-Hank溶液中，濃度為0.5 g/L。(3)無(wú)血清培養(yǎng)液成分:DMEM/F12培養(yǎng)液、B27 supplement、bFGF(20μg/L)、EGF(20μg/L)、青霉素G 2.5 mg。(4)主要儀器:解剖顯微鏡、尼康DIAPHOT倒置相差顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡;Bio Photometer分光光度計(jì)(美國(guó)Eppendorf)、高速離心機(jī)、5%CO2培養(yǎng)箱。

1.3 耳蝸基底膜上皮層的分離與毛細(xì)胞培養(yǎng) 先用75%乙醇浸泡出生后7 d的2組大鼠進(jìn)行消毒，然后將大鼠斷頭，完整取出聽(tīng)泡，置于0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中。在顯微鏡下打開(kāi)聽(tīng)泡，小心地剝離蝸殼。由于新生的大鼠耳蝸尚未骨化，僅為軟骨組織，可以完整地去除骨性耳蝸。去除螺旋韌帶，自基底膜底轉(zhuǎn)完整撕下基底膜，放入含有0.5 g/L嗜熱菌蛋白酶的D.Hank溶液中，于體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱(37℃)內(nèi)進(jìn)行25 min酶消化。酶消化后，耳蝸上皮組織和結(jié)締組織之間的結(jié)合會(huì)變得較為疏松，在高倍顯微鏡下，用超細(xì)鎢絲刀將包括大上皮嵴、小上皮嵴、內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞在內(nèi)的一層大鼠耳蝸基底膜上皮層組織自基底膜上鏟下。再經(jīng)過(guò)0.125%的胰蛋白酶消化15 min，用含有10%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)液終止消化，1 500 r/min離心3 min(離心半徑3 cm)，棄上清，用配好的2ml無(wú)血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。接種至直徑35mm的培養(yǎng)皿中，放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。

細(xì)胞懸浮培養(yǎng)14 d，培養(yǎng)期間隔天換液，每日在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)基顏色、透明度及細(xì)胞生長(zhǎng)情況。第14天計(jì)數(shù)結(jié)束后，將懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁培養(yǎng)7 d:培養(yǎng)皿中放入蓋玻片，涂抹多聚賴氨酸，將細(xì)胞懸液滴在蓋玻片上，待24 h后，懸浮的細(xì)胞球基本貼緊玻片后，加入含10%FBS的培養(yǎng)液，隔天換液，第7天固定染色。

1.4 細(xì)胞球計(jì)數(shù) 按前述的耳蝸分離與細(xì)胞培養(yǎng)方法，培養(yǎng)至第7天和第14天，在低倍(40倍)倒置相差顯微鏡下，隨機(jī)取3個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞球計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn):(1)細(xì)胞球的形態(tài)為圓形或橢圓形;(2)細(xì)胞球直徑在1.0 cm或以上;(3)如2個(gè)或數(shù)個(gè)細(xì)胞球重疊在一起，則按1個(gè)細(xì)胞球計(jì)數(shù);(4)僅計(jì)數(shù)懸浮的細(xì)胞球，貼壁的細(xì)胞球不計(jì)入。

1.5 cyclinD、CDK4的檢測(cè) 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶連接(SP)免疫組織化學(xué)方法。具體操作步方法:細(xì)胞甩片經(jīng)3 ml/L Triton X-100/PBS、10 ml/L H2O2/PBS處理后，用正常兔血清封閉，37℃溫育 30 min。分別滴加兔抗大鼠 cyclinD (1∶100)和CDK4(1∶100)多抗(一抗)，4℃過(guò)夜。次日晨滴加山羊抗兔IgG血清(1∶200，二抗)，37℃溫育30 min。滴加SP復(fù)合物，37℃溫育30 min(以上各步間均以PBS充分振洗)。DAB顯色，室溫5 min，PBS振洗中止顯色反應(yīng)，蘇木精襯染，逐級(jí)乙醇脫水后二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片;陰性對(duì)照用PBS代替一抗，其他同前。

1.6 結(jié)果判定 cycinD陽(yáng)性著色定位于細(xì)胞核，CDK4陽(yáng)性著色定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞中相應(yīng)部位出現(xiàn)紅色或綠色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。每張片選擇5個(gè)典型的高倍(200倍)視野，計(jì)數(shù)至少500個(gè)細(xì)胞，并計(jì)數(shù)5個(gè)視野中的細(xì)胞總數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，然后計(jì)算出每張片的陽(yáng)性細(xì)胞百分率(參考:陽(yáng)性細(xì)胞率≥10%為陽(yáng)性，＜10%為陰性)。

2 結(jié)果

40倍光鏡下，培養(yǎng)第7天IL-1組毛細(xì)胞細(xì)胞球數(shù)量增多，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);培養(yǎng)第14天，毛細(xì)胞細(xì)胞球數(shù)量仍存在增多趨勢(shì)，但與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。免疫組織化學(xué)測(cè)定結(jié)果顯示，IL-1組CDK4和cyclinD陽(yáng)性細(xì)胞率增多，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);且熒光強(qiáng)度(以單位面積內(nèi)光密度IOD/area計(jì))增強(qiáng)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。顯微鏡下毛細(xì)胞內(nèi)綠色為CDK4陽(yáng)性表達(dá)，紅色為cyclinD陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果見(jiàn)表1及圖1、2。

圖1 2組懸浮培養(yǎng)14 d和貼壁培養(yǎng)7 d后CDK4表達(dá)組織圖(免疫組化 ×200)

3 討論

內(nèi)耳毛細(xì)胞是機(jī)械-電感受器，對(duì)維持聽(tīng)覺(jué)和平衡覺(jué)起著關(guān)鍵作用。任何原因?qū)е碌膬?nèi)耳毛細(xì)胞的變性、壞死均可引起聽(tīng)覺(jué)和平衡功能障礙［3-6］。因此，對(duì)內(nèi)耳毛細(xì)胞的再生研究一直是重點(diǎn)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，將新生大鼠耳蝸Corti器進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，可見(jiàn)細(xì)胞球形成，且細(xì)胞球內(nèi)細(xì)胞能被Brdu標(biāo)記，認(rèn)為其內(nèi)存在一種增殖細(xì)胞，該增殖細(xì)胞存在于基底膜的大上皮嵴區(qū)域，可以誘導(dǎo)分化為具有毛細(xì)胞和神經(jīng)元標(biāo)志物的細(xì)胞。

圖2 2組懸浮培養(yǎng)14 d和貼壁培養(yǎng)7 d后cyclinD表達(dá)組織圖(免疫組化 ×200)

內(nèi)耳毛細(xì)胞發(fā)育、分化及再生機(jī)制的研究，因內(nèi)耳結(jié)構(gòu)復(fù)雜、部位深在、組織來(lái)源少、分離出的組織對(duì)環(huán)境變化敏感、活性難以保持而受到一定限制。體外組織細(xì)胞培養(yǎng)條件下的實(shí)驗(yàn)研究避免了全身因素的干擾和影響，使實(shí)驗(yàn)條件更加純化，有利于研究組織細(xì)胞在單因素改變下的變化規(guī)律和變化機(jī)制，研究途徑更為便捷可靠［7］。一般認(rèn)為，哺乳動(dòng)物的毛細(xì)胞是一種高度分化和穩(wěn)定的感覺(jué)細(xì)胞，具有恒定的DNA總量，通常不再具有分裂增殖能力，因此毛細(xì)胞的離體培養(yǎng)較其他組織細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)具有更高的要求和難度［8-9］。耳蝸器官培養(yǎng)的材料大多采用出生數(shù)天的小鼠或者大鼠，主要是因?yàn)樾∈蠛痛笫笤诔錾髷?shù)天尚未完全骨化，比較容易對(duì)耳蝸內(nèi)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分離和取材。同時(shí)此階段小鼠和大鼠的耳蝸細(xì)胞尚未發(fā)育完全處于比較原始階段，因此比較容易培養(yǎng)成功［10-11］。

本實(shí)驗(yàn)提取了新生大鼠耳蝸基底膜上皮細(xì)胞，進(jìn)行離體培養(yǎng)，觀察IL-1對(duì)新生大鼠毛細(xì)胞再生能力的影響。結(jié)果顯示:培養(yǎng)第7天，IL-1組毛細(xì)胞細(xì)胞球數(shù)量與對(duì)照組相比明顯增多;培養(yǎng)第14天，毛

表1 2組毛細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間后細(xì)胞球數(shù)量及免疫組織化學(xué)測(cè)定結(jié)果(±s，每組n=8)

表1 2組毛細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間后細(xì)胞球數(shù)量及免疫組織化學(xué)測(cè)定結(jié)果(±s，每組n=8)

注:IL-1為白細(xì)胞介素-1;CDK4為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶;cyclinD為細(xì)胞周期蛋白D;IOD/area為單位面積內(nèi)光密度值。與對(duì)照組比較aP＜0.05

組別 細(xì)胞球數(shù)量(個(gè))第7天 第1 4天C D K 4熒光強(qiáng)度( I O D / a r e a ) C D K 4陽(yáng)性細(xì)胞率( % ) c y c l i n D熒光強(qiáng)度( I O D / a r e a ) c y c l i n D陽(yáng)性細(xì)胞率( % ) a對(duì)照組 6 9.0 0 ± 1 2.4 9 3 8.0 0 ± 9.5 4 6 2.9 2 ± 8.5 3 3 5.0 3 ± 1.9 4 6 7.0 1 ± 5.9 2 1 7.4 3 ± 2.2 0 I L -1組 1 3 9.3 3 ± 1 3.5 0a4 1.0 0 ± 6.2 5 7 6.7 7 ± 6.4 9a4 8.2 3 ± 8.8 7a7 7.0 4 ± 7.8 9a2 8.4 3 ± 1.3 4

細(xì)胞細(xì)胞球數(shù)量仍然有增多趨勢(shì)，且免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，毛細(xì)胞CDK4和cyclinD表達(dá)增強(qiáng)，CDK4和cyclinD陽(yáng)性細(xì)胞率增高。這一結(jié)果初步說(shuō)明，IL-1對(duì)新生大鼠毛細(xì)胞的再生可能有一定的促進(jìn)作用。可能機(jī)制:IL-1通過(guò)抑制周期依賴性蛋白激酶抑制因子p27的表達(dá)，一方面促進(jìn)了支持細(xì)胞分化為新的毛細(xì)胞;另一方面促進(jìn)cyclin/CDK4復(fù)合體的表達(dá)，抑制了Rb蛋白的功能，催化毛細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，促使毛細(xì)胞自身分裂。在培養(yǎng)第14天，IL-1組毛細(xì)胞細(xì)胞球數(shù)量與對(duì)照組相比呈增多趨勢(shì)，可能原因?yàn)槊?xì)胞周期中潛伏期約48 h，倍增時(shí)間24～36 h，指數(shù)增生期持續(xù)2～4 d，培養(yǎng)1周后，毛細(xì)胞細(xì)胞球達(dá)80%融合，而后增殖能力受到一定的抑制，該細(xì)胞具有接觸抑制能力。

內(nèi)耳毛細(xì)胞的發(fā)育和再生是一個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題，研究人員一直在探索通過(guò)外源性的生長(zhǎng)因子或通過(guò)基因治療的辦法來(lái)解決損傷后毛細(xì)胞再生的問(wèn)題。經(jīng)過(guò)各國(guó)學(xué)者20多年的研究，在毛細(xì)胞再生方面已取得了突破性的進(jìn)展，如果基因治療臨床應(yīng)用成功，將會(huì)有效解決因?yàn)槊?xì)胞的變性壞死導(dǎo)致的聽(tīng)力障礙和平衡功能障礙。

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Effect of IL-1 on the regeneration of the inner ear hair cells in newborn rats

WANG Xiao-hua，ZHANG Jian-cheng，WANG Qing-min，LIZhong-fu，ZHOU Hong-yuan，YUAN Hai-xia

(Naval Medical Research Institute，Shanghai200433，China)

Objective To observe the effectof enhanced expression of CDK4/cyclinD complex on the regeneration of hair cells in newborn rats through addition of P27 inhibitor IL-1 into the culture.Methods The epithelium collected from the supportingmembrane of the inner ear in the 167 day old ratswere cultured in vitro and the animalswere divided into 2 groups:the blank control group and the IL-1 group，each consisting of8 rats.Cell growth was observed respectively at day 7 and day 14，and the expressions of CDK4 and cyclinD in hair cells were detected by immunohistochemistry.Results At day 7 after culture，the number of cell balls of hair cells(139.33± 13.50)in the IL-1 group increased significantly in 3 randomized visual fields under the electron lightmicroscope，when itwas compared with that of the blank control group(69.00±12.49)，and statistical significance could be noticed，when comparisonsweremade between them(P＜0.05).At day 14 after culture，the number of cell balls of hair cells still displayed an increasing trend，butwithout statistical significance(P＞0.05).Immunohistochemistry revealed that the expressions of CDK4 and cyclinD(76.77±6.49 and 77.04±7.89)in hair cells of the IL-1 group were enhanced，butwithout statistical significance(P＞0.05)，as compared with those of the control group (P＞0.05).Positive rates of CDK4 and cyclinD were respectively increased(48.23±8.87 and 28.43±1.34)，and statistical significance could be seen，as compared with those［(35.03±1.94)%and(17.43±2.20)%］of the control group，with statistical significance(P＜0.05).Conclusion IL-1might have a certain enhancing effect on the regeneration of hair cells in newborn rats.

Hair cell;Regeneration;In vitro culture;IL-1

R764

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2014.05.004

2013-09-12)

(本文編輯:施 莼)

200433 上海，海軍醫(yī)學(xué)研究所