王志宏+丁瑩瑩+馮嬌嬌+李連青+潘衛(wèi)+郭存九

[摘要] 目的 構(gòu)建重組質(zhì)?？滤_奇病毒A組16型（coxsackievirus group A type 16，CA16）VP1，并進(jìn)行原核表達(dá)及鑒定。方法 用PCR方法擴(kuò)增CA16 VP1序列，構(gòu)建其重組表達(dá)質(zhì)粒pET21b-CA16 VP1，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌E. coli BL21（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及純化，SDS-PAGE鑒定表達(dá)及純化產(chǎn)物，間接ELISA方法檢測重組蛋白CA16 VP1的抗原性和有效性。結(jié)果 成功原核表達(dá)并純化了CA16 VP1蛋白，可與小鼠抗CA16病毒血清特異性結(jié)合，與太原市老年人群中部分血清存在高反應(yīng)性。 結(jié)論 CA16 VP1蛋白獲得成功表達(dá)，ELISA檢測具有良好的抗原性和有效性，為CA16診斷試劑盒的研究奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 柯薩奇病毒A組16型；VP1蛋白；原核表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附

[中圖分類號] R373.2；R392-33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）14-0069-04

手足口病（Hand foot and mouth disease，HFMD）是一種全球性的傳染病，自1957年新西蘭首次報道以來[1]，世界各地均有不同程度的流行[2-5]。近年來，手足口病疫情呈不斷上升的趨勢，尤其在亞太地區(qū)。2008年，我國將其列為法定丙類傳染病進(jìn)行監(jiān)測，目前 HFMD的發(fā)病率和死亡率在丙類傳染病中仍居首位。引起HFMD的腸道病毒有20多種，其中柯薩奇病毒A組16型（coxsackievirus group A type 16，CA16）和EV71最為常見[6]，其他腸道病毒像CA4、CA5、CA9、CA10、CB2和CB5也可以引起[7]。CA16 基因組全長7410 bp，其中VP1基因長891 bp，編碼297個氨基酸殘基[8]，CA16 VP1含有許多線性中和表位，VP1基因與腸道病毒血清型完全對應(yīng)，可作為腸道病毒屬內(nèi)不同血清分類依據(jù)，也可作為小RNA病毒科分類依據(jù)[9]。因此，CA16 VP1基因已成為研究CA16的重要對象。本實(shí)驗旨在構(gòu)建pET21b-CA16 VP1重組表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中原核表達(dá)并純化CA16 VP1重組蛋白，并檢測其抗原性和有效性，為CA16診斷試劑盒的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞、病毒及試劑

原核表達(dá)載體pET21b購自Novagen公司，大腸桿菌（E. coli）BL21（DE3）和Top10菌株購自TAKARA公司。CA16病毒和RD細(xì)胞由上海市疾病預(yù)防控制中心提供。限制性核酸內(nèi)切酶BamH I、HindIII和DNA Marker（DL2000）購自寶生物工程（大連）有限公司；Taq DNA 聚合酶試劑盒購自天根生化科技有限公司；T4 DNA連接酶（Ligation High kit）購自東洋紡（中國上海）生物科技有限公司；PCR小量膠回收試劑盒購自北京天恩澤科技有限公司。金屬螯合親和層析介質(zhì)（Ni-NTA）購自德國QIAGEN公司。重組質(zhì)粒pET32a-CA16 VP1、純化的pET32a蛋白和LD5由第二軍醫(yī)大學(xué)病原生物學(xué)教研室制備并保存，其中LD5為一種新型免疫球蛋白結(jié)合分子（NEIBM），可與Ig的VH3和Vk區(qū)域雙結(jié)合，與IgG有較高的親和力[10-12]。

1.2 實(shí)驗動物及血清標(biāo)本

清潔級BALB/C小鼠，雌性，6周齡，16～18 g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗動物中心提供；2013年5月29日～5月30日山西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科95份太原市老年人血清，其中男48例，女47例，平均年齡（61.0±14.0）歲。

1.3 引物的設(shè)計及合成

根據(jù)CA16 VP1基因（NCBI 登錄號：AEO12126.1）序列自行設(shè)計引物，上游P1：5′-GGCCCGGGGATCCGGGTGACCCGATCGCTGAC-3′（下劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn)），下游P2：5′-CGCCCGCGGAAGCTTCAGAGTAGTGATTTTGTC-3′（下劃線部分為Hind III酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增片段大小為891 bp。引物由上海生工生物有限公司合成。

1.4 CA16 VP1基因的擴(kuò)增

以pET32a-CA16 VP1質(zhì)粒為模板，P1、P2為上下游引物，PCR擴(kuò)增CA16 VP1基因， PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；4℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個循環(huán)；72℃ 延伸10 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將試劑盒回收的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET21b用BamH I和Hind III雙酶切，回收目的基因片段和載體片段，以T4 DNA連接酶16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coliTOP10中，過夜培養(yǎng)后挑取單克隆菌落，37℃搖菌16 h后提取質(zhì)粒，用BamH I和Hind III雙酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒送上海杰李生物技術(shù)有限公司測序。

1.6 重組蛋白的表達(dá)

將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）中，挑取單克隆菌落，接種于2 mL LB（100 μg/mL Amp+15μg/ mL Kana）培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)7 h，按1%接種量接種到50 mL LB培養(yǎng)基中，37℃、230 rpm振蕩培養(yǎng)過夜；將50 mL過夜菌液轉(zhuǎn)接至新鮮的450 mL LB中，37℃、230 rpm振蕩培養(yǎng)至A600為0.6，加IPTG 至終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)4 h，離心收集細(xì)菌沉淀，在冰浴的條件下超聲300次，每次超聲3 s，間隔3 s；離心收集上清和沉淀，進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。

1.7 重組蛋白的純化endprint

取重組菌破菌沉淀，加8 mol/L（pH8.0）尿素10 mL重懸，4℃裂解過夜；離心收集上清用于純化，純化按Qiagen公司Ni-NTA說明書進(jìn)行。12% SDS-PAGE分析，BandScan軟件分析重組蛋白的純度。

1.8 小鼠抗CA16病毒血清的制備

將RD細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中，當(dāng)RD細(xì)胞長滿80%時，加入CA16病毒懸液，37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d，收集細(xì)胞并反復(fù)凍融三次，離心收集病毒懸液并腹腔注射5只BALB/c小鼠，病毒劑量按200 μL/只，共注射3次，每次間隔2周。第3次注射后1周采血，分離血清。

1.9 間接ELISA法檢測重組蛋白的抗原性及有效性

將重組蛋白pET21b-CA16 VP1和pET32a用100 mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.6）以1：200稀釋，分別包被于酶標(biāo)板100 μL/孔，37℃孵育2 h，棄上清；10%的脫脂奶粉37℃封閉2h；每孔加入2倍系列稀釋（1：20～1：5120）的小鼠抗CA16 病毒血清和太原市老年人血清100 μL，37℃孵育45 min，PBST洗液洗4次；加入1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的LD5 100 μL，37℃孵育45 min；PBST洗液洗4次，TMB顯色液顯色，于450 nm波長處測定吸光度值（A450）。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗數(shù)據(jù)使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)符合偏態(tài)分布，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果

2.1 CA16 VP1 基因的擴(kuò)增

以pET32a-CA16 VP1質(zhì)粒為模板，P1、P2為上下游引物，PCR擴(kuò)增CA16 VP1基因，CA16 VP1基因經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見891bp的特異性條帶，大小與理論值相符，見圖1。

2.2 pET21b-CA16 VP1質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒pET21b-CA16 VP1經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見約5400 bp的載體片段和891 bp的目的基因片段，與理論值相符，見圖2。

M：DL2000 Marker ；1：未酶切pET21b-CA16 VP1；

2：pET21b-CA16 VP1雙酶切后產(chǎn)物

2.3 CA16 VP1蛋白的表達(dá)

將pET21b-CA16 VP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)12% SDS-PAGE檢測，結(jié)果可見相對分子質(zhì)量約34KDa的條帶，大小與理論值相符，重組蛋白pET21b-CA16 VP1主要存在于破菌沉淀中，以包涵體形式表達(dá)。經(jīng)BandScan軟件分析，目的蛋白表達(dá)量約占菌體總蛋白的24%，見圖3。

2.4 CA16 VP1蛋白的純化

重組蛋白CA16 VP1經(jīng)Ni-NTA親和層析純化后，12% SDS-PAGE檢測，結(jié)果可見相對分子質(zhì)量約34KDa的單一蛋白條帶，經(jīng)BandScan軟件分析，重組蛋白的純度達(dá)90%以上。見圖4。

2.5 CA16 VP1的抗原性分析

5只BALB/c小鼠經(jīng)CA16病毒4次免疫后，用間接ELISA方法檢測純化的重組蛋白CA16 VP1與倍比稀釋的小鼠抗CA16病毒血清的反應(yīng)性，結(jié)果顯示，小鼠抗CA16病毒血清可與純化的重組蛋白特異性結(jié)合，A450值隨小鼠抗CA16病毒血清濃度的稀釋逐漸降低，以1∶20～1∶60稀釋度下降尤為明顯，與pET32a蛋白僅有較弱的結(jié)合，見圖5。

2.6 CA16 VP1的有效性分析

95份太原市老年人血清與重組蛋白CA16 VP1的間接ELISA檢測，結(jié)果顯示：重組蛋白 CA16 VP1與太原市老年人血清反應(yīng)的A450（中位數(shù)0.912，四分位數(shù)間距0.638）明顯高于對照組pET32a蛋白與人血清反應(yīng)的A450（中位數(shù)0.486，四分位數(shù)間距0.172），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖6。將重組蛋白 CA16 VP1與太原老年人血清反應(yīng)的A450值從高到低依次排列顯示，A450值呈線性分布，出現(xiàn)高、中、低三種A450值，而且有7例血清的A450值明顯高于其他人血清的A450值，見圖7。

3 討論

以往研究認(rèn)為CA16僅引起輕微癥狀[13]，EV71能引起嚴(yán)重的并發(fā)癥及死亡率[14，15]，因此大多數(shù)手足口病的研究主要針對EV71，CA16常被忽視。然而近幾年研究發(fā)現(xiàn)，感染CA16的患者也能引起嚴(yán)重并發(fā)癥[16]，甚至死亡[17]，CA16日益受到人們的重視。

本實(shí)驗構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET21b-CA16 VP1，并在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)了CA16 VP1蛋白，SDS-PAGE分析顯示，表達(dá)的重組蛋白CA16 VP1主要以包涵體形式存在，之所以出現(xiàn)包涵體是因為這些蛋白在體內(nèi)過量表達(dá)，以至于沒有足夠的時間正確折疊，二硫鍵不能正確地配對，過多的蛋白間非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度[18]，重組蛋白經(jīng)Ni柱親和層析純化后純度達(dá)90%以上，由于載體蛋白pET21b分子量很小，僅含有27個氨基酸，因此，選擇pET32a載體蛋白作為陰性對照。

為確定重組蛋白CA16 VP1是否具有抗原性，我們用小鼠抗CA16病毒血清來檢測重組蛋白CA16 VP1，結(jié)果表明，重組蛋白CA16 VP1與小鼠抗CA16病毒血清的反應(yīng)明顯高于與pET32a蛋白的反應(yīng)，表明CA16 VP1蛋白具有良好的抗原性和特異性。本實(shí)驗結(jié)果還顯示，在每個血清稀釋下，5只小鼠抗CA16病毒血清與重組蛋白CA16 VP1反應(yīng)的A450值有高有低，而與pET32a蛋白反應(yīng)的A450值均小于0.5且它們之間的差異很小，表明不同小鼠對相同CA16病毒產(chǎn)生的抗體不同，小鼠之間存在個體差異；小鼠抗CA16病毒血清與pET32a蛋白無結(jié)合反應(yīng)。endprint

為進(jìn)一步了解重組蛋白CA16 VP1能否有效檢測人群中抗CA16 VP1抗體，我們用表達(dá)的重組蛋白CA16 VP1檢測太原市老年人血清，結(jié)果表明，重組蛋白CA16 VP1作為抗原能有效檢測人群中抗CA16 VP1抗體，有7例血清與重組蛋白存在高的結(jié)合反應(yīng)，表明表達(dá)的重組蛋白能夠成為一種臨床檢測用抗原。由于本次實(shí)驗沒有對這7例血清進(jìn)行中和實(shí)驗來確定他們是否感染過CA16病毒，有待我們在后續(xù)的實(shí)驗中進(jìn)一步驗證。

綜上所述，本實(shí)驗成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET21b-CA16 VP1，原核表達(dá)并純化了CA16 VP1重組蛋白，能與小鼠抗CA16病毒血清發(fā)生特異性反應(yīng)，能檢測出人血清中抗CA16抗體，說明其具有良好的抗原性和有效性，本實(shí)驗為CA16診斷試劑盒的研究奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2014-03-13）endprint

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