王佳，陳格飛，孟清

東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620

鹽離子對(duì)次壺腹腺絲蛋白重組模塊的影響

王佳，陳格飛，孟清

東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620

為研究不同生理環(huán)境對(duì)蛛絲蛋白組裝及成絲的影響，首次以MiSp序列為對(duì)象，研究其NTR1SR2CT重組模塊在不同種類 (濃度) 鹽離子條件下的聚集和成纖維特性及其在成纖維過程中二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化?；诖蟾箞@蛛MiSp全長(zhǎng)序列構(gòu)建NTR1SR2CT模塊，并在大腸桿菌Escherichia coli BL21中成功表達(dá)。借助8 mol/L尿素裂解包涵體進(jìn)行變性純化得到NTR1SR2CT重組蛋白。NTR1SR2CT重組蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)則卷曲(Random coil) 或α螺旋 (Helix)，在自然成絲及凍干過程中部分random coil或helix轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B (β-sheet)，甲醇能促進(jìn)該轉(zhuǎn)變過程。另外，鉀離子和磷酸根離子有利于NTR1SR2CT重組蛋白聚集從而促進(jìn)絲纖維的形成。研究結(jié)果為成絲機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為工業(yè)化生產(chǎn)高品質(zhì)的蛛絲纖維提供了條件。

次壺腹腺絲蛋白，組裝，鹽離子，二級(jí)結(jié)構(gòu)，絲纖維

蜘蛛絲是一種天然高分子量蛋白質(zhì)纖維，具有良好的機(jī)械學(xué)性能和生物學(xué)品質(zhì)，如強(qiáng)度高、彈性好、質(zhì)地輕、耐高低溫及生物相容性好等，在生物醫(yī)學(xué)、材料、建筑和軍事等領(lǐng)域具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值[1-4]。近期蛛絲蛋白已成功應(yīng)用于人造皮膚和腫瘤細(xì)胞治療藥物傳送等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，但是由于蛛絲蛋白的組裝及成絲機(jī)制尚不明確等，限制了蛛絲蛋白的后續(xù)應(yīng)用[5-7]。

主壺腹腺絲由主壺腹腺分泌，具有高強(qiáng)度和良好的延展性，主要用于逃逸和編織網(wǎng)框[8]。由于主壺腹腺絲的優(yōu)良品質(zhì)及其分泌腺體易于分離，長(zhǎng)期以來一直是蛛絲蛋白研究的焦點(diǎn)[9]。2007年美國(guó)研究組克隆了第一條黑寡婦Latrodectus hesperus主壺腹腺絲蛋白 (Major ampullate spidroin, MaSp) 1和2亞基全長(zhǎng)編碼基因，證實(shí)了MaSp主要由poly-alanine、glycineglycine-X、glycine-X以及glycine-prolineglycine-X-X模塊組成 (X為其他氨基酸)，并可細(xì)分為N端非重復(fù)區(qū) (N terminal，NT)、C端非重復(fù)區(qū) (C terminal, CT) 以及重復(fù)區(qū)(Repetitive region, Rep)[10]。主壺腹腺由腺體尾(Tail)、壺狀體 (Ampulla) 以及逐漸細(xì)化的導(dǎo)管(Duct) 組成，絲素蛋白由腺體尾分泌，存儲(chǔ)于壺狀體，受導(dǎo)管逐漸細(xì)化及生理化學(xué)等多種變化而纖維化，如導(dǎo)管逐漸細(xì)化帶來的流速及剪切力變化、pH以及離子種類及濃度的變化等[9,11-12]。次壺腹腺與主壺腹腺結(jié)構(gòu)和組成相似，分泌的次壺腹腺絲 (Minor ampullate silk)生物學(xué)品質(zhì)和材料學(xué)性能與主壺腹腺絲相當(dāng)，用于捕捉和纏繞獵物等[13-14]。本課題組近期克隆鑒定了首條大腹園蛛Araneus ventrcosus次壺腹腺絲蛋白 (Minor ampullate spidroin, MiSp)全長(zhǎng)編碼基因序列，由該基因翻譯的蛋白質(zhì)甘氨酸 (Glycine) 和丙氨酸 (Alanine) 含量達(dá)到64%，且主要以glycine-X、glycine-X-X、glycine-X-X-X 和 poly-alanine 等重復(fù)模塊形式存在[15]。與MaSp結(jié)構(gòu)不同，MiSp全長(zhǎng)氨基酸序列除可劃分為NT、CT以及Rep外，還包含兩個(gè)氨基酸序列完全相同的間隔區(qū)(Spacer)，在蛛絲蛋白組裝成絲以及絲性能等方面分別行使不同的生物學(xué)功能[15-16]。

為研究不同生理環(huán)境對(duì)蛛絲蛋白的組裝及成絲的影響，本研究以A. ventrcosus MiSp全長(zhǎng)編碼基因?yàn)榛A(chǔ)，克隆并表達(dá)NTR1SR2CT (其含有MiSp完整的NT和CT，R1和R2分別為不同的部分重復(fù)區(qū)，S為Spacer) 重組蛋白，結(jié)合多種分析方法研究不同 (濃度) 鹽離子對(duì)NTR1SR2CT重組蛋白聚集、成纖維的影響及其在成纖維過程中二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。用于Western blotting 二抗HRP-Goat anti-mouse IgG (H+L)、底物、PVDF (0.45 μm) 膜購(gòu)自Invitrogen公司。EcoRⅠ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶購(gòu)自Fermentas公司。BsaⅠ限制性內(nèi)切酶和Phusion High-Fidelity PCR Master Mix購(gòu)自NEB公司。6×His-tag (anti-mouse) 抗體購(gòu)自Merck公司。Ni-NTA樹脂購(gòu)自Qiagen公司。實(shí)驗(yàn)中所用到的宿主菌E. coli BL21 (DE3) 購(gòu)自天跟生化科技 (北京) 有限公司。

1.2 克隆構(gòu)建

以A. ventrcosus MiSp全長(zhǎng)基因?yàn)槟０?，引物R1SR2-RS和R1SR2-RR PCR擴(kuò)增R1SR2，引物 CS和CR擴(kuò)增CT，分別由BsaⅠ酶切，酶切片段回收后由T4 DNA連接酶體外連接。以連接產(chǎn)物為模板，引物R1SR2C-RS和R1SR2C-RR擴(kuò)增R1SR2CT，引物NS和NR擴(kuò)增NT，分別由BsaⅠ酶切，酶切片段回收后由T4 DNA連接酶體外連接。以連接產(chǎn)物為模板，引物NR1SR2C-NS和NR1SR2C-NR擴(kuò)增NTR1SR2CT，產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切后與載體連接，引物序列見表1。

表1 PCR引物列表Table 1 Primer sequence

1.3 蛋白表達(dá)、鑒定和純化

轉(zhuǎn)接BL21 (DE3) 重組子于3 mL LB培養(yǎng)基 (含30 μg/mL卡那霉素)，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.6，培養(yǎng)溫度降至25 ℃，加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h。誘導(dǎo)蛋白表達(dá)前后分別取1 mL菌液收集菌體，加入40 μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液，制備誘導(dǎo)前后蛋白樣。蛋白樣于100 ℃水浴10 min，冰浴5 min，取適量電泳。樣品經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)，并進(jìn)行Western blotting Anti-his特異性檢測(cè)，具體方法參照Invitrogen操作手冊(cè)。

Western blotting鑒定重組蛋白成功表達(dá)后，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接BL21(DE3)重組子于3 mL LB培養(yǎng)基 (含30 μg/mL卡那霉素)，37 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)。按1∶100轉(zhuǎn)接于250 mL 新鮮LB培養(yǎng)基 (含30 μg/mL卡那霉素)，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.6。培養(yǎng)溫度降至25 ℃ 加入終濃度為0.8 mm/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá) 6 h。高速低溫離心8 min (8 000 r/min，4 ℃)，收集菌體。加入10 mL裂解緩沖液 (500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0) 重懸菌體，200 W超聲波破碎(超聲5 s，間隔8 s) 70次。破碎菌液高速低溫離心40 min (10 000 r/min，4 ℃)，收集上清和沉淀。若NTR1SR2CT重組蛋白在上清中，則進(jìn)行非變性純化；若重組蛋白形成了包涵體，則進(jìn)行變性純化。

1.4 蛋白聚集

1.4.1 NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer測(cè)定蛋白上清濃度

NTR1SR2CT重組蛋白透析于20 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) (4 ℃，12 h)，高速冷凍離心30 min (4 ℃，10 000 r/min) 除去透析中產(chǎn)生的沉淀。取400 μL蛋白溶液分別加入100 μL含有不同 (濃度) 鹽離子的緩沖液中 (20 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0)，濃度如表2所示，重組蛋白終濃度約為2 mg/mL。重組蛋白質(zhì)在不同 (濃度)鹽離子緩沖液中出現(xiàn)不同程度的聚集，將所得蛋白樣離心 (8 000 r/min，20 min)，分別取4 μL上清液上樣，測(cè)定其在280 nm處的吸光度(A280)，即上清中蛋白濃度 (mg/mL)。

1.4.2聚集蛋白表面形態(tài)觀察

不同 (濃度) 鹽離子緩沖液中NTR1SR2CT重組蛋白的制樣如NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer測(cè)定蛋白上清濃度制樣。取60 μL樣品于半徑1 cm的鋁箔片上，37 ℃ 過夜干燥，于掃描電子顯微鏡 (Scanning electron micrographs, SEM) 下觀察蛋白質(zhì)聚集物的表面形態(tài)。

1.4.3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

將透析到20 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 的NTR1SR2CT重組蛋白上清溶液倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，先放入?80 ℃ 冰箱冷凍至固體后再放入冷凍干燥機(jī)至液體完全升華。取5 μL冷凍干燥前的蛋白溶液測(cè)定其紅外光譜 (ATR-FTIR)，并在其自然蒸發(fā)干燥后再次測(cè)定。將冷凍干燥后的不規(guī)則重組蛋白纖維浸入70%甲醇中2 h，分別測(cè)定甲醇浸泡前后的紅外光譜。

表2 不同濃度鹽溶液樣品的制備Table 2 Prparation of different kinds of salt solution

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白的表達(dá)、純化和鑒定

NTR1SR2CT與經(jīng)改造的pET載體pHTH連接，重組子質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司正反向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)分析無突變，預(yù)測(cè)NTR1SR2CT重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為78 kDa。超聲破碎誘導(dǎo)后的BL21 (DE3) 菌體發(fā)現(xiàn)，NTR1SR2CT重組蛋白可溶性較差，幾乎全在沉淀組分中 (圖1A)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western blotting鑒定為預(yù)期的重組蛋白NTR1SR2CT (圖1B)。為了摸索裂解包涵體的最優(yōu)尿素 (Urea)濃度，分別用含有2、4、6 mol/L 尿素的包涵體裂解緩沖液 (500 mmol/L NaCl，2、4、6 mol/L尿素，20 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0) 裂解包涵體碎片，振蕩裂解 (100 r/min，5 h)。如圖2所示，上清中目的蛋白 (S4、S3、S2) 逐漸增多，沉淀中蛋白 (P4、P3、P2) 逐漸減少。當(dāng)尿素濃度為8 mol/L時(shí)，沉淀組分中的重組蛋白基本全部可溶。

圖1 NTR1SR2CT重組蛋白的 SDS-PAGE 和Western blotting 圖譜Fig. 1 SDS-PAGE (A) and Western blotting (B) analysis of NTR1SR2CT recombinant proteins. M: protein marker; S and P: supernatant and pellets after centrifuge respectively; 1: non-induced cells; 2: cells induced with IPTG.

圖2 不同濃度urea純化NTR1SR2CT包涵體蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE and Western blotting analysis of urea of different concentrations for inclusion body purification of NTR1SR2CT. M: protein marker; S: supernatant; W1, W2 and W3: the first, second, third wash solution; S1, S2, S3, S4: supernatants of 8, 6, 4, 2 mol/L urea treatment respectively; P1, P2, P3, P4: pellets of 8, 6, 4, 2 mol/L urea treatment respectively.

將包涵體漂洗緩沖液 (500 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)、1 mol/L 尿素、1% (V/V) TritonX-100)加入超聲破碎后獲得的包涵體沉淀中，重懸，低溫離心40 min (10 000 r/min，4 ℃)，棄上清，重復(fù)3次。第3次洗滌時(shí)，漂洗緩沖液不含有1% (V/V) TritonX-100。三次漂洗后，加入適量8 mol/L尿素裂解緩沖液重懸碎片，超聲破碎一次，振蕩裂解 (100 r/min，5 h)。低溫離心40 min (10 000 r/min，4 ℃)，收集上清。如圖2所示，包涵體漂洗緩沖液 (W1、W2、W3) 中不含有目的蛋白。目的蛋白在含8 mol/L尿素的裂解緩沖液中基本完全溶解 (圖2中S1和P1)。將溶解的蛋白梯度透析到20 mmol/L Tris-HCL (pH 8.0) 保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 重組蛋白聚集

2.2.1蛋白上清濃度

重組蛋白加入到不同 (濃度) 鹽離子溶液中時(shí)出現(xiàn)不同程度聚集現(xiàn)象，當(dāng)KCl、NaH2PO4、NaCl、KH2PO4終濃度分別為300、300、100、500 mmol/L時(shí)，上清中蛋白含量最少，即蛋白聚集程度最大 (圖3)，詳細(xì)見討論部分。高濃度的KH2PO4溶液促進(jìn)蛋白的聚集，而高濃度的NaCl溶液可相對(duì)穩(wěn)定蛋白。

圖3 在不同濃度的4種鹽溶液中可溶蛋白的濃度Fig. 3 Salt-induced aggregation of NTR1SR2CT proteins after incubation for 5 min at RT: induced by the presence of potassium chloride, potassium phosphate, sodium chloride and sodium phosphate.

2.2.2蛋白聚集產(chǎn)物的形態(tài)觀察

圖4 蛋白在4種不同濃度鹽溶液下干燥成膜后的掃描電子顯微鏡圖Fig. 4 SEM of fibrils formed from the NTR1SR2CT recombinant proteins in different concentrations of four kinds of salt. A1, A2, A3 and A4: 100, 200, 300 and 500 mmol/L potassium chloride; B1, B2, B3 and B4: 100, 200, 300 and 500 mmol/L potassium phosphate; C1, C2, C3 and C4: 100, 200, 300 and 500 mmol/L sodium chloride; D1, D2, D3 and D4: 100, 200, 300, 500 mmol/L sodium phosphate.

如圖4所示，NTR1SR2CT重組蛋白在不同(濃度) 鹽離子下聚集表現(xiàn)出不同的形態(tài)。在KCl溶液中的蛋白聚集后出現(xiàn)微晶，且隨著濃度增大，微晶形狀越趨向于方形，排列愈整齊。當(dāng)濃度到300 mmol/L時(shí)，排列最為整齊 (A3)。處于KH2PO4溶液中的蛋白，當(dāng)KH2PO4濃度低時(shí) (100 mmol/L)，呈現(xiàn)無序狀(B1)；濃度增大到200 mmol/L時(shí)，出現(xiàn)直徑10 μm左右絲纖維，表面粗糙 (B2)；濃度增加到300 mmol/L時(shí)，絲纖維表面變得光滑且直徑比較均勻 (B3)；濃度為500 mmol/L時(shí)，出現(xiàn)直徑80 μm的超大纖維及直徑2 μm左右直徑均勻表面光滑的超細(xì)纖維(B4)。當(dāng)鹽離子為100 mmol/L NaCl時(shí)，形成不規(guī)則微晶 (C1)；濃度增大后，微晶消失，形成不規(guī)則片狀物 (C2、C3、C4)。NTR1SR2CT蛋白在100 mmol/L NaH2PO4溶液中可形成不規(guī)則泡沫狀薄膜 (D1)；當(dāng)濃度為200 mmol//L時(shí)，出現(xiàn)纖維取向 (D2)；濃度增至300 mmol/L時(shí)，纖維取向明顯且光滑；濃度繼續(xù)增大時(shí)(500 mmol/L)，無纖維取向，形成不規(guī)則泡沫狀薄膜 (D4)。

2.2.3蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖5 NTR1SR2CT蛋白衰減全反射-傅立葉變換紅外光譜圖Fig. 5 ATR-FTIR spectra of the NTR1SR2CT recombinant proteins. A and B: spectra of the protein solution of NTR1SR2CT recombinant proteins before and after drying; C and D: spectra of the protein film of NTR1SR2CT recombinant proteins before and after methanol treatment.

經(jīng)過不同處理方式的NTR1SR2CT蛋白在1 650 cm–1(Random coil或α-helix)、1 630 cm–1(β-sheet) 附近表現(xiàn)出不同的吸收強(qiáng)度 (圖5)[17]：冷凍干燥前蛋白溶液 (A) 及其自然干燥后 (B)、冷凍干燥后蛋白纖維 (C) 及其經(jīng)甲醇浸泡30 min后 (D) 在1 650 cm–1處的峰值依次減弱，在1 630 cm–1處峰值依次增強(qiáng)。另外，在1 530 cm–1附近 (β-sheet) 只有B、C、D有吸收峰。這說明在水溶液中的蛛絲蛋白主要以random coil或α-helix 存在，在水分蒸發(fā)、凍干及甲醇處理的過程中，部分random coil或α-helix轉(zhuǎn)化為β-sheet，且A、B、C、D各蛋白中β-sheet含量依次增多。

3 討論

園網(wǎng)蜘蛛可分泌6種不同力學(xué)性能的絲纖維，雖然組成氨基酸各不相同，但均擁有相似的蛋白組成模式：NT、CT和Rep，其中Rep占90%以上[10,15,18-19]。NT模塊在中性條件下主要為單體構(gòu)象，隨著pH降低，NT逐漸二聚化，最后形成穩(wěn)定的二聚體；CT在蛛絲蛋白成絲過程中可扮演晶核的作用，另外也有CT促進(jìn)蛛絲蛋白高度可溶的報(bào)道，但具體功能目前尚不明確[20-22]；NT和CT模塊在蛛絲蛋白進(jìn)化過程中高度保守，參與蛛絲蛋白成絲的調(diào)節(jié)，而Rep則表現(xiàn)較大的生物學(xué)多樣性，不同的絲纖維蛋白由不同的Rep構(gòu)成，分別擁有不同的力學(xué)性能。因此，成絲機(jī)理的研究主要集中在NT和CT的功能以及Rep對(duì)絲性能的影響上。本課題組前期通過篩選基因組文庫(kù)獲得了A. ventrcosus MiSp全長(zhǎng)編碼基因，但是由于該基因大小為10 kb左右，很難完成全長(zhǎng)基因的表達(dá)。且由于蛛絲蛋白主要由甘氨酸和丙氨酸組成的小模塊重復(fù)組成，占到整個(gè)蛋白的70%左右。因此現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng)無法完成全長(zhǎng)蛛絲蛋白的表達(dá)，這也是現(xiàn)在蛛絲研究領(lǐng)域的難題[15]。由于蛛絲蛋白的模塊性質(zhì)，如重復(fù)區(qū)是由小的模塊重復(fù)組成，因此我們以部分蛛絲蛋白模塊為研究對(duì)象來研究成絲機(jī)理。根據(jù)A. ventrcosus全長(zhǎng)MiSp序列，我們構(gòu)建了重組子NTR1SR2CT (NTR1SR2CT含有A. ventrcosus MiSp完整的NT、CT和Spacer及部分Rep)。本文將S引入到成絲機(jī)理的研究，更能代表MiSp的成絲特性。

主壺腹腺由tail、ampulla和逐漸細(xì)化的duct組成，絲素蛋白由tail分泌，存儲(chǔ)于ampulla，流經(jīng)duct時(shí)受到物理及生理化學(xué)變化的作用發(fā)生聚集、組裝及最后形成絲纖維[9,16]。絲素蛋白溶液向絲纖維轉(zhuǎn)變的過程中，鈉離子和鉀離子濃度分別從3.1 mg/g和0.75 mg/g下降/上升為0.3 mg/g和2.9 mg/g，同時(shí)磷酸鹽濃度升高至少5倍[23]。Nephila edulis蜘蛛主壺腹腺內(nèi)腔內(nèi)的MaSp紡絲原液含有150 mmol/L的氯化鈉，在成絲過程中濃度降低，另外紡絲原液流經(jīng)導(dǎo)管時(shí)，鈉離子與鉀離子交換，氯離子與磷酸根離子交換，從而導(dǎo)致鈉離子與氯離子的降低及鉀離子與磷酸根離子的升高[24]。對(duì)NT的研究發(fā)現(xiàn)，NaCl可穩(wěn)定NT單體構(gòu)象，延遲二聚化轉(zhuǎn)變[25]。為研究鹽離子種類及濃度對(duì)絲蛋白聚集及成絲的影響，重組蛋白NTR1SR2CT經(jīng)多種方法進(jìn)行測(cè)試，研究其受鹽離子種類及濃度的影響。

陸游在夔州時(shí)曾作《風(fēng)雨中望峽口諸山奇甚戲作短歌》，一度認(rèn)為“白鹽赤甲天下雄，拔地突兀摩蒼穹”這樣的景致過于雄健而直露，所謂“凜然猛士舞長(zhǎng)劍，空有豪健無雍容”，并因此而發(fā)出“不令氣象少渟滀，常恨天地?zé)o全功”的感嘆，但在一個(gè)風(fēng)雨大作的日子，他卻忽然發(fā)現(xiàn)了云遮雨罩中白鹽赤甲景象的奇妙：“今朝忽悟始嘆息，妙處元在煙雨中”。平時(shí)不太美的景致，之所以會(huì)在通常令人悲傷的風(fēng)雨中而變得完美可人，除了上天的幫助外，主要應(yīng)該是陸游創(chuàng)作時(shí)的精神狀態(tài)在起作用，是他的情緒由身在蠻鄉(xiāng)的一貫低沉消極而偶然變得平和愉悅了。

NTR1SR2CT重組蛋白理論相對(duì)分子質(zhì)量為78 kDa，經(jīng)BL21 (DE3) 表達(dá)后主要分布在沉淀組分中。分析NT的氨基酸組成發(fā)現(xiàn)，NT中含有兩個(gè)保守的半胱氨酸 (Cystein)，可形成鏈內(nèi)二硫鍵[15]。BL21 (DE3) 內(nèi)環(huán)境不適合二硫鍵的形成，因此表達(dá)的重組蛋白形成包涵體，可溶性較差，需采用8 mol/L 尿素裂解緩沖液進(jìn)行包涵體純化 (圖2)。NTR1SR2CT重組蛋白加入到不同濃度的NaCl、KCl、NaH2PO4和KH2PO4溶液中后出現(xiàn)不同程度的聚集現(xiàn)象，其中當(dāng)KCl、NaH2PO4、NaCl、KH2PO4終濃度分別為300、300、100、500 mmol/L時(shí)，蛋白聚集程度最高 (圖3)。重組蛋白在KH2PO4和NaH2PO4中的聚集動(dòng)力學(xué)相似，均隨著濃度的增加而不斷聚集。對(duì)比KCl和KH2PO4以及NaCl和NaH2PO4，磷酸根離子更易促進(jìn)重組蛋白的聚集。在KCl濃度為300 mmol/L時(shí)，該蛋白出現(xiàn)最大程度的聚集。到目前為止，蜘蛛主壺腹腺導(dǎo)管末端鉀離子濃度還無法確定，我們推測(cè)可能會(huì)存在一個(gè)最優(yōu)的鉀離子濃度，在該濃度下，蛛絲蛋白更易聚集成絲。NaCl能穩(wěn)定NT單體構(gòu)象，增大蛛絲蛋白的溶解性，不利于蛛絲蛋白的聚集，這里我們發(fā)現(xiàn)隨著鈉離子濃度的升高，蛋白聚集程度減弱。

在不同種類及濃度的鹽離子環(huán)境中，NTR1SR2CT重組蛋白聚集物分別擁有不同的表面形態(tài)。在300 mmol/L的KCl中，重組蛋白聚集粒徑最大，排列最為整齊。在KH2PO4溶液中，隨著濃度增大到500 mmol/L左右時(shí)，出現(xiàn)直徑80 μm的超大纖維及均勻直徑2 μm左右表面光滑的超細(xì)纖維。而在NaCl溶液中，只有在低濃度100 mm/L時(shí)，出現(xiàn)不規(guī)則微晶，隨著濃度增大，呈現(xiàn)無序狀。在NaH2PO4溶液中，當(dāng)濃度增大至300 mm/L，薄膜表面出現(xiàn)有取向的纖維。4種鹽離子溶液，只有在KH2PO4溶液中形成絲纖維，且濃度越高，所形成的纖維表面越光滑。因此，鉀離子、磷酸根離子促進(jìn)蛋白的聚集即自組裝，從而促進(jìn)絲纖維的形成；而鈉離子、氯離子則不利于纖維的形成。

存儲(chǔ)于蛛絲腺體中的絲素蛋白溶液二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為random coil和helix，但是絲纖維的結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，蛛絲纖維的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)組分為β-sheet[7]。因此絲素蛋白溶液在經(jīng)過導(dǎo)管的過程以及蜘蛛紡絲的過程中，絲素蛋白會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。這里我們分別利用不同的處理方式處理NTR1SR2CT重組蛋白并分析ATR-FTIR光譜，MiSp蛋白原液二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是random coil和helix，當(dāng)水分蒸發(fā)后，random coil或helix立即有一部分轉(zhuǎn)化為β-sheet。因此，蛋白溶液在遇空氣凝結(jié)成纖維的過程，是一個(gè)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?sheet的過程。在研究絲素蛋白時(shí)，常常采用凍干的方法，然而研究發(fā)現(xiàn)凍干后，二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，random coil或helix大部分轉(zhuǎn)變?yōu)棣?sheet結(jié)構(gòu)，因此在研究其相關(guān)結(jié)構(gòu)時(shí)，過程中采用凍干的方法不夠嚴(yán)謹(jǐn)，同時(shí)這也解釋了為什么凍干后的蛋白是不易溶于水的。凍干后的蛋白纖維經(jīng)過甲醇處理后，β-sheet變多，說明甲醇能夠促進(jìn)蛋白形成β-sheet，從而增強(qiáng)蛛絲的強(qiáng)度。

本次研究通過對(duì)NTR1SR2CT重組蛋白的表達(dá)、純化、聚集傾向和二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，證實(shí)了鉀離子、磷酸根離子可促進(jìn)絲素蛋白的組裝，從而促進(jìn)絲纖維的形成；而鈉離子、氯離子則可抑制絲素蛋白纖維化。另外，我們證實(shí)NTR1SR2CT重組蛋白在水溶液中二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是random coil或helix，自然干燥和冷凍干燥可促使random coil或helix轉(zhuǎn)變成β-sheet，甲醇可促進(jìn)該轉(zhuǎn)變的發(fā)生。本研究為蛛絲蛋白成絲機(jī)理提供了次壺腹腺絲的研究線索，為仿生高品質(zhì)的蛛絲纖維提供了條件。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Effect of salt on minor ampullate silk spidroin modules

Jia Wang, Gefei Chen, and Qing Meng

Institute of Biological Sciences and Biotechnology, Donghua University, Shanghai 201620, China

To study the effect of physiological conditions on spidroins, we analyzed NTR1SR2CT module secondary structure, aggregation and silk-formation influenced by different salts (in different concentration intervals). According to the full-length Araneus ventricosus MiSp sequence, NTR1SR2CT module was constructed and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3), and the recombinant proteins were purified by denaturation method mediated by 8 mol/L urea. Random coil and helix are the main secondary structures of NTR1SR2CT and could be induced into beta-sheet by drying natively and lyophilization, where methanol can be used as a promoter. Furthermore, potassium and phosphate cations can cause significant NTR1SR2CT protein aggregationand silk-formation. The results could be a basis for the determination of silk-formation mechanism, and also useful for industrialized generation of high performance spider silk-like fibers.

minor ampullate spidroin, assembly, salt, secondary structure, fibers

November 18, 2013; Accepted: January 7, 2014

Qing Meng. Tel: +86-21-67792737; E-mail: mengqing@dhu.edu.cn

王佳, 陳格飛, 孟清. 鹽離子對(duì)次壺腹腺絲蛋白重組模塊的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(8): 1308?1317.

Wang J, Chen GF, Meng Q. Effect of salt on minor ampullate silk spidroin modules. Chin J Biotech, 2014, 30(8): 1308?1317.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31070698), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA03Z451), Science and Technology Commission of Shanghai Key Project of Basic Research (No. 10JC1400300), Doctoral Science Fund Project of the Ministry of Education of China (No. 20120075110007).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31070698)，國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863 計(jì)劃) (No. 2006AA03Z451)，上海市科委基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No. 10JC1400300)，教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目 (No. 20120075110007) 資助。