施和平，余武，張國鵬，曾寶強，周卓輝

1 華南師范大學生命科學學院 廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，廣東 廣州 510631

2 香港教育學院科學與環(huán)境學系，香港 新界

廣藿香毛狀根多倍體誘導及其植株再生

施和平1，余武1，張國鵬1，曾寶強2，周卓輝2

1 華南師范大學生命科學學院 廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，廣東 廣州 510631

2 香港教育學院科學與環(huán)境學系，香港 新界

為了提高藥用植物廣藿香的次生物質(zhì)廣藿香醇含量，采用秋水仙素人工誘導染色體加倍技術(shù)，進行了廣藿香毛狀根多倍體誘導及其植株再生、倍性鑒定和揮發(fā)油組分廣藿香醇含量的測定。結(jié)果表明，廣藿香毛狀根多倍體誘導的最佳條件為0.05 %秋水仙素處理36 h，其多倍體誘導率可達40%以上；經(jīng)秋水仙素加倍的廣藿香毛狀根在MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 d后可獲得毛狀根多倍體再生植株。與對照 (二倍體植株) 相比，廣藿香毛狀根多倍體再生植株根系更發(fā)達、莖更粗、節(jié)間變短、葉片的長度、寬度和厚度均較二倍體明顯增大。根尖細胞染色體壓片觀察證實，所獲得的廣藿香毛狀根多倍體再生植株為四倍體，其根尖細胞染色體數(shù)約為128；同時，其葉片的氣孔保衛(wèi)細胞體積及其葉綠體數(shù)目均約為對照的兩倍；但其氣孔密度則隨著倍性增加而下降，二倍體植株葉片的氣孔密度約為四倍體植株葉片的1.67倍。GC-MS測定結(jié)果表明，廣藿香毛狀根多倍體再生植株的廣藿香揮發(fā)油組分廣藿香醇的含量為4.25 mg/g 干重，約為二倍體植株的2.30倍。該結(jié)果證實毛狀根多倍體化可提高藥用植物廣藿香的廣藿香醇含量。

廣藿香，秋水仙素，多倍體，再生植株

多倍體 (Polyploids) 在植物中廣泛存在，也是植物進化的途徑之一[1]；但由于自然界產(chǎn)生多倍體的過程相當漫長，因而許多國家的育種工作者大都通過人工誘導的方法來獲得多倍體植株。最常見的人工誘導方法是用化學誘變劑——秋水仙素 (堿) (Colchicine) 處理植物的種子和生長點[2]、葉片[3]或愈傷組織[4]來進行多倍體誘導，并已在百合Hemerocallis flava L.[5]、莨菪Hyoscyamus niger[6]、丹參Salvia miltiorrhiza Bge.[7]、可樂豆木Colophospermum mopane[8]等多種藥用和花卉植物中獲得成功。已有的研究表明，與原二倍體植株相比，由于染色體加倍，多倍體植株不僅表現(xiàn)在根、莖、葉和花等器官上具有“巨型性”，而產(chǎn)生出較大的營養(yǎng)器官和繁殖器官[5,9-10]；而且通過物種的染色體數(shù)目加倍，大都能增強植物的次生代謝，而具有更高的次生物質(zhì)含量[6,11-12]。因而，對大多數(shù)以收獲營養(yǎng)器官為對象且大多通過營養(yǎng)繁殖的藥用植物而言，運用秋水仙素誘導產(chǎn)生多倍體藥用植物一直以來被用作大幅度提高以相應部位入藥的藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的有效育種措施。

廣藿香Pogostemon cablin (Blanco) Benth.是一種經(jīng)濟價值很高的熱帶藥用和香料作物，原產(chǎn)于菲律賓、印度尼西亞等國，宋朝時引種至廣東栽培。其揮發(fā)油組分廣藿香醇和廣藿香酮具有芳香化濁、開胃止嘔、發(fā)表解暑及抗菌和抗腫瘤等功效[13-16]。然而，廣藿香在我國是無性繁殖植物，不開花或罕見開花但不結(jié)果，很難采用傳統(tǒng)的有性生殖方法進行育種；同時，由于在其藥材生產(chǎn)中長期只能采用扦插繁殖，引起植株生長緩慢、抗逆性弱；導致品種退化，藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量下降，難以滿足醫(yī)療及制藥工業(yè)的巨大需求[17]；因而迫切需要引入新的技術(shù)和方法才能進行種質(zhì)資源的創(chuàng)新和新品種的選育，培育出廣藿香揮發(fā)油含量更高而穩(wěn)定的廣藿香新品種，以滿足藥材生產(chǎn)的種植需要和醫(yī)療制藥工業(yè)不斷增長的需求。但目前未見有關(guān)利用廣藿香多倍體培育來提高其藥用成分含量的系統(tǒng)研究報道。

由發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化植物細胞產(chǎn)生的毛狀根不僅能在無外源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基上快速自主生長，而且具有次生代謝產(chǎn)物量高且穩(wěn)定，并易通過組織培養(yǎng)途徑獲得再生植株等優(yōu)點[18-19]；而且同源四倍體青蒿Artemisia annua毛狀根具有比二倍體毛狀根更高的青蒿素含量[20]；表明可自主生長的毛狀根應該非常適合用作秋水仙素人工誘導多倍體的實驗體系。然而，到目前為止，未見更多利用毛狀根作為倍性誘導起始材料來進行藥用植物多倍體誘導的研究報道；也未見利用毛狀根多倍體化來獲得廣藿香多倍體植株的研究報道。

我們曾用含野生農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌對藥用植物廣藿香的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了可在無激素培養(yǎng)基上快速自主生長的毛狀根[21];但能否利用該毛狀根的多倍體化來創(chuàng)新廣藿香種質(zhì)和進一步提高其揮發(fā)油含量和產(chǎn)量，目前國內(nèi)外未見相關(guān)報道。為此，本文利用業(yè)已獲得的發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的可自主生長的廣藿香毛狀根作為倍性誘變的起始材料，進行了廣藿香毛狀根多倍體的誘導、植株再生和倍性鑒定及其揮發(fā)油組分廣藿香醇含量測定，旨在為今后利用廣藿香毛狀根多倍體再生植株來提高廣藿香揮發(fā)油的產(chǎn)量以及生產(chǎn)出揮發(fā)油含量更高的廣藿香新種質(zhì) (種苗) 奠定實驗技術(shù)基礎(chǔ)和提供可能性。

1 材料與方法

1.1 植物材料

采用由含農(nóng)桿堿型野生Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834遺傳轉(zhuǎn)化石牌廣藿香 (即牌香)葉片外植體所產(chǎn)生的、能在無外源激素培養(yǎng)基上自主快速生長的毛狀根作為人工倍性誘變的起始材料；其誘導和繼代培養(yǎng)見Shi等的方法[21]。

1.2 廣藿香毛狀根多倍體的誘導及其植株再生

采用根尖浸泡法來進行廣藿香毛狀根多倍體的誘導。首先將生長旺盛的廣藿香毛狀根根尖段置于6,7?V液體培養(yǎng)基[22]中振蕩培養(yǎng)15 d，使毛狀根進入快速生長時期，并獲得足夠多的生長同步化根尖段；然后切取約3?4 cm長的毛狀根根尖段分別置于添加0、0.05%、0.1%和0.2% 秋水仙素的MS液體培養(yǎng)基[23]中，于100 r/min轉(zhuǎn)速、25℃下振蕩培養(yǎng)，并分別在處理12、24、36和48 h后觀察并統(tǒng)計根尖膨大的情況。每個處理約20個帶根尖根段。將經(jīng)秋水仙素處理后膨大的根尖段用無菌水沖洗2?3次后，轉(zhuǎn)接入無激素的MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，再將毛狀根根尖段轉(zhuǎn)接至MS+6-BA

0.2 mg/L+NAA 0.05 mg/L的固體培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導和植株再生；約60 d后將愈傷組織產(chǎn)生的幼芽切下并轉(zhuǎn)接到無外源激素的MS固體培養(yǎng)基中進行生根誘導，發(fā)育成完整的再生植株，并進行其倍性鑒定。

1.3 毛狀根多倍體再生植株的倍性檢測

1.3.1 采用根尖細胞染色體數(shù)觀察法進行鑒定

根尖細胞染色體數(shù)觀察基本按Martinez-Gomez等的方法進行[24]。首先，取待鑒定的毛狀根多倍體再生植株3?4 cm長的根尖段，用卡諾氏固定液 (95%乙醇：冰醋酸體積比=3∶1)室溫固定20 h, 1 mo1/L鹽酸室溫解離5 min、蒸餾水中低滲20 min后，用醋酸洋紅溶液染色20 min后，進行常規(guī)制片和用Olympus顯微鏡觀察并拍照；隨機統(tǒng)計200個分裂相細胞，統(tǒng)計其中的多倍體細胞染色體條數(shù)并計算其誘導率。

1.3.2 毛狀根多倍體再生植株葉片的氣孔形態(tài)觀察

毛狀根多倍體再生植株葉片的氣孔大小和密度按陳佰鴻等的透明膠帶法進行測量[25]。取同一位置的不同倍性的毛狀根再生植株葉片進行制片，并置于高倍顯微鏡下觀察。隨機統(tǒng)計測量10個植株，每個倍性株系取第3片真葉10片，每片真葉觀察10個視野，共測100個視野；每個株系隨機測量10個保衛(wèi)細胞的大小和氣孔密度，取其平均值。利用目鏡測微尺，測量其保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)目和保衛(wèi)細胞的長、寬；同時用目鏡測微尺測出視野直徑和視野內(nèi)氣孔數(shù)，并計算出氣孔密度。

1.4 廣藿香毛狀根多倍體再生植株廣藿香醇含量的測定

1.4.1 揮發(fā)油的提取

分別取盆栽約2個月的廣藿香毛狀根及其多倍體再生植株地上部和2年生對照野生植株地上部60 ℃恒溫烘干后，用粉粹機粉碎，過60目篩后，基本按《中華人民共和國藥典 (一部)》 (2010版)附錄XD的揮發(fā)油測定方法 (甲法)[15]進行揮發(fā)油提取。首先，準確稱取各植株干粉2 g，置于100 mL具塞三角瓶中，加50 mL甲醇，超聲處理浸提3次，每次20 min，過濾，合并濾液，提取液低溫揮干，殘渣加乙醚溶解后，再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，即制得各倍性植株的廣藿香揮發(fā)油測定樣品液。

1.4.2 GC-MS分析條件

采用島津GC-16A氣相色譜儀進行樣品的廣藿香揮發(fā)油組分廣藿香醇含量的GC-MS測定。色譜條件為：色譜柱：DB-5 石英毛細管色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；載氣為高純度氦氣，流速為1.3 mL/min；進樣口溫度250 ℃，聯(lián)接口溫度280 ℃；升溫程序：柱溫50 ℃，保持5 min，15 / mi℃n升溫至210 ℃；再以20 /min℃升溫至280 ℃，保持10 min；柱前壓為80 kPa，分流比60∶1，進樣量為1.0 μL。質(zhì)譜條件：電離電壓1 500 V,電子能量70 eV，電離方式EI (電子轟擊)，全波段掃描。以百秋里醇 (即廣藿香醇) 標準品 (購自南方標準物質(zhì)網(wǎng)深圳市時得佳科技有限公司，產(chǎn)品標準編號：vq10284;有效含量≥98%) 制作標準曲線: y=82.44x+2052.32, r2=0.99998; 并依據(jù)標準曲線計算各樣品的廣藿香醇含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣藿香毛狀根多倍體誘導及其植株再生

表1和圖1 A分別為秋水仙素濃度及其處理時間對廣藿香毛狀根多倍體誘導效率的影響。從表1可見，在供試的各濃度秋水仙素溶液中，廣藿香毛狀根根尖存活率之間沒有明顯差異，但秋水仙素溶液處理時間長短則對毛狀根根尖成活率有明顯影響，其中以秋水仙素誘導處理12 h的毛狀根根尖成活率較高，如秋水仙素濃度為0.05%時，處理12 h后毛狀根根尖成活率最高，可達42% (圖1A)；但處理48 h后根尖成活率則明顯降低，這說明秋水仙素浸泡時間太長可能不利于其多倍體誘導，甚至還會造成毛狀根根段壞死。然而，對毛狀根多倍體誘導率而言，則以秋水仙素誘導處理毛狀根根尖36 h的多倍體誘導率最高；其中以0.05%秋水仙素的誘導率最高，其多倍體誘導率達40%，其次是0.1%，最低是0.2%，表明秋水仙素誘導廣藿香毛狀根根尖多倍體的最佳誘導處理條件是0.05%秋水仙素處理36 h；而隨著秋水仙素濃度升高，會加重其對根尖的毒害，反而不利于毛狀根多倍體的誘導。

將不同濃度秋水仙素處理后根尖膨大部位(圖1A) 切下，并轉(zhuǎn)接至MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.2 mg/L的培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導，10 d后大部分膨大的廣藿香毛狀根根尖段逐漸由白色發(fā)育成淡綠色的愈傷組織 (圖1B和C)；30 d后將所產(chǎn)生的淺綠色愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS +6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L的不定芽誘導培養(yǎng)基中進行不定芽分化，約15 d后可見從淺黃綠色的愈傷組織上不斷分化出綠色的芽點，并逐漸形成不定芽 (圖1D)。60 d后統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，經(jīng)秋水仙素加倍的不同毛狀根根尖產(chǎn)生的愈傷組織的不定芽分化頻率 (平均每個毛狀根根尖形成的愈傷組織產(chǎn)生的不定芽數(shù)目) 最高為22，最低為5.2。當愈傷組織產(chǎn)生的不定芽生長至3?4 cm時，將不定芽轉(zhuǎn)接至無外源激素的MS培養(yǎng)基中進行生根誘導，約4?5 d后從不定芽基部不斷產(chǎn)生出白色的不定根，發(fā)育成完整植株 (圖1E)。

表1 秋水仙素濃度和處理時間對廣藿香毛狀根多倍體誘導率的影響Table 1 Effect of colchicine concentration and treatment time on induction rate of polyploid hairy roots in P. cablin

圖1 廣藿香毛狀根多倍體誘導、植株再生及其倍性鑒定Fig. 1 Induction of polyploid hairy roots, its plant regeneration and ploidy identification in P. cablin. (A) Swollen hairy roots after treated with colchicine for 36 hours. (B) Callus formation from colchicine-induced swollen root tips of hairy roots after cultured for 15 days. (C) The adventitious buds from callus after 30 days. (D) Adventitious buds from callus after 45 days. (E) Regenerated plants from calli of polyploid hairy roots after cultured for 60 days. (F) Wild-type diploid plants. (G) Regenerated plants from polyploid hairy roots. (H) Roots of wild-type diploid. (I) Roots of regenerated plants from polyploid hairy roots. (J) Leaves of diploid plants (left) and polyploid plants (right). (K) Diploid chromosomes (2n=64). (L) Polyploid chromosomes (4n = 128). (M) Stomata of diploid plants (10×100). (N) Stomata of polyploid plants (10 × 100). (O) Morphology of stomata guard cells in diploid plants. (P) Morphology of stomata guard cells in polyploid plants. Bars in A?J of Fig. 1=2.5 cm, bars in K?P of Fig. 1=20 μm.

2.2 廣藿香毛狀根多倍體植株形態(tài)觀察及其倍性鑒定

圖1的F、G、H、I和J為廣藿香毛狀根多倍體再生植株與二倍體植株的生長形態(tài)。從圖1可見，與二倍體植株 (圖1F和H) 相比，所產(chǎn)生的廣藿香毛狀根多倍體再生植株 (圖1G) 的根系更發(fā)達 (圖1I)、莖更粗、節(jié)間略短、葉圓、葉脈明顯加粗、且葉背面較皺，葉片的長度、寬度、厚度也較二倍體明顯增大 (圖1J)。而圖1的K和L為采用根尖細胞染色體數(shù)目觀察法對廣藿香毛狀根多倍體再生植株倍性鑒定的結(jié)果。從圖1的K和L可見，對照 (野生型二倍體) 植株的根尖細胞染色體數(shù)目為64 (2n=64)，而毛狀根多倍體再生植株根尖的染色體數(shù)目大都為128 (4n=128)。這表明所獲得的廣藿香毛狀根多倍體再生植株是同源四倍體。

此外，還對廣藿香毛狀根多倍體再生植株葉片氣孔及其保衛(wèi)細胞形態(tài)以及其葉綠體數(shù)目和分布范圍進行了比較觀察，結(jié)果如圖1的M、N、O和P及表2所示。從表2可見，兩種倍性不同植株間的氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)目的變化幅度都較大，且其差異達到極顯著 (P＜0.01)；其中二倍體植株的氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)目最少的只有18個葉綠體，最多則可達26個，但其大部分細胞 (約85%) 的氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)目介于21?25之間，平均為22.43個，表明二倍體廣藿香植株的氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)目約為22個。而大部分 (約87%) 的廣藿香毛狀根多倍體再生植株的氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)目介于41?45和46?50之間，平均值為45.01個，表明毛狀根多倍體再生植株的氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)目約為45個?？梢姡捎诙啾扼w的染色體倍性增加，其葉片氣孔保衛(wèi)細胞的葉綠體數(shù)也相應成倍增加。

圖1O、1P和表3為廣藿香毛狀根多倍體再生植株的氣孔形態(tài)以及其保衛(wèi)細胞長度和密度的測量結(jié)果。雖然廣藿香毛狀根多倍體再生植株的氣孔形態(tài)較二倍體沒有太大的變化,但其大小和密度則差異極顯著(表3)。對照 (二倍體野生植株) 的氣孔長33.10 μm，寬21.82 μm，而二倍體毛狀根再生植株則與對照相似；但廣藿香毛狀根多倍體再生植株的氣孔長度約為66.92 μm，寬度約43.12 μm，均約為二倍體植株氣孔的2倍；但從葉片氣孔密度測量而言，廣藿香毛狀根多倍體再生植株的氣孔密度平均為23.89個/mm2，而對照和二倍體毛狀根再生的廣藿香植株的氣孔密度為38.93個/mm2和39.81個/mm2?？梢?，與二倍體植株相比，多倍體植株的氣孔大小隨著倍性增加而成倍增加，但其氣孔密度則隨著倍性的增加而相應降低(圖1O和P)。

2.3 廣藿香毛狀根多倍體再生植株揮發(fā)油廣藿香醇含量的測定

圖2和表4為廣藿香毛狀根多倍體再生植株揮發(fā)油廣藿香醇含量的GC-MS測定圖譜及其分析結(jié)果。結(jié)果表明，廣藿香毛狀根多倍體再生植株的廣藿香揮發(fā)油廣藿香醇含量達到4.25 mg/g干重；與對照 (兩年生野生型的二倍體植株) 和二倍體毛狀根再生植株相比，其廣藿香醇含量分別約為對照和二倍體毛狀根再生植株的2.3倍和2.14倍。這表明，運用廣藿香毛狀根多倍體化可提高藥用植物廣藿香的藥用成分廣藿香醇的含量。

表2 廣藿香毛狀根多倍體再生植株的氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)目及其分布范圍Table 2 Number and its range of chloroplasts in stomata guard cells of polyploid hairy roots-regenerated plants of P. cablin

表3 廣藿香多倍體毛狀根再生植株與二倍體植株葉片氣孔保衛(wèi)細胞大小及其密度比較Table 3 Comparison of morphology of stomata guard cells and the stomata density between polyploid and diploid plants of P. cablin

圖2 廣藿香毛狀根多倍體再生植株廣藿香揮發(fā)油廣藿香醇含量測定的GC-MS圖譜Fig. 2 GC-MS analysis of patchouli alcohol in P. cablin. (A) Authentic patchouli alcohol. (B) Two-year-old wild plants. ( C) Plants regenerated from diploid hairy roots. (D) Plants regenerated from polyploid hairy roots.

表4 廣藿香毛狀根多倍體再生植株的廣藿香醇含量的GC-MS測定Table 4 GC-MS determination of patchouli alcohol content in polyploid hairy roots-regenerated plants of P. cablin

3 討論

至今為止，應用秋水仙素人工誘導染色體加倍技術(shù)來獲得藥用植物多倍體新種質(zhì)已在莨菪[6]、丹參[7]、可樂豆木[8]等多種藥用植物以及花卉植物如百合[5]、仙客來Cyclamen persicum[26]等獲得成功。然而，在人工誘導植物多倍體時，大都用化學誘變劑-秋水仙素處理植物的葉片[3]或愈傷組織[4]、根段[27]或種子和生長點[2]來進行多倍體誘導，少見利用可自主生長、單細胞起源的毛狀根作為倍性誘導起始材料的研究報道。至今也未見利用毛狀根多倍體化來獲得藥用植物廣藿香毛狀根多倍體及其再生植株的研究報道。在本實驗中，用秋水仙素處理廣藿香毛狀根不僅可獲得其多倍體毛狀根及其再生植株，而且所產(chǎn)生的多倍體易篩選，且多倍體誘導率也較高；而這表明可自主生長的毛狀根完全可用作人工多倍體誘變的良好起始材料；同時，與對照 (二倍體植株) 相比，通過組織培養(yǎng)所獲得的廣藿香毛狀根多倍體再生植株的揮發(fā)油組分廣藿香醇含量高達4.25 mg/g干重，約為對照的2.30倍。然而，De Jesus-Gonzalez和Weathers曾用秋水仙素人工誘導技術(shù)獲得了青蒿素含量比其二倍體毛狀根高6倍的同源四倍體青蒿毛狀根[20]；而這與本實驗的結(jié)果不一致。而這種差異的產(chǎn)生可能與植物及其毛狀根類型以及其次生物質(zhì)的種類等有關(guān)。

有研究報道，在秋水仙素人工誘導多倍體時，其多倍體的誘導率高低與植物類型、組織或器官特性以及秋水仙素的作用濃度和處理時間長短等有關(guān)[28-30]。如張海風等發(fā)現(xiàn)，以0.1%秋水仙素處理杜仲Eucommia ulmoides Oliv. 籽苗生長點時，處理12 h后達到最佳誘變效果，其多倍體誘導率36.7%[29]；但同樣濃度的秋水仙素處理非洲菊Gerbera jamesonii叢生芽時，則以秋水仙素處理48 h的誘導效果最佳[30]。然而，在比較秋水仙素濃度和作用時間對3種紫薇幼苗染色體加倍的效果時，0.5%和0.8%的秋水仙素處理紫薇Lagerstroemia indica和銀薇Lagerstroemia indica Linn. f. alba (Nichols.) Rehd. 48?96 h后，其植株多倍體誘導率均較高，其中以0.5%秋水仙素處理紫薇72 h的多倍體最高，達54.17%[31]。而這與本實驗利用秋水仙素處理廣藿香毛狀根來進行毛狀根多倍體誘導的結(jié)果不一致。在本實驗中，當不同濃度秋水仙素濃度溶液進行多倍體誘變處理時，以0.05%秋水仙素溶液處理36 h時，廣藿香毛狀根的多倍體誘導率最高，其多倍體誘導率達40%以上；但當秋水仙素濃度過高 (如0.1%和0.2%)，或浸泡時間過長 (如超過48 h) 時，其毛狀根多倍體誘導率反而下降。然而，用秋水仙素人工加倍處理獲得四倍體青蒿毛狀根時，則以0.25%或者0.5%的秋水仙素處理7 d的誘變效果最好，多倍體誘導率可達1%[20]。而這也與本實驗的結(jié)果不一致。這種差異的產(chǎn)生可能表明，秋水仙素人工誘導多倍體的效率高低可能與植物種類、外植體類型及其毛狀根的生長特性等有關(guān)。

目前對植物多倍體的倍性鑒定最常用的方法是根尖細胞染色體倍性觀察和氣孔大小和形態(tài)等方法進行鑒定[20,31]；但一些研究表明，以保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)為基礎(chǔ)的倍性鑒定也可作為一種快速、簡便的倍性鑒定方法[32]。而在本實驗中，通過毛狀根根尖壓片觀察，發(fā)現(xiàn)廣藿香二倍體植株的細胞染色體數(shù)為2n=64，而所產(chǎn)生的毛狀根多倍體再生植株為4倍體，其細胞染色體數(shù)為4n=128；同時發(fā)現(xiàn)，廣藿香二倍體和四倍體植株葉片的保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)目比值與其染色體數(shù)目比值一致，均為1∶2；這也表明，以保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)目多少也可作為鑒定廣藿香多倍體植株染色體倍性的快速而可靠的輔助方法。

廣藿香的藥用揮發(fā)油組分主要為廣藿香酮和廣藿香醇。一些研究表明，根據(jù)不同產(chǎn)地廣藿香揮發(fā)油成分差異的結(jié)果，可將產(chǎn)自廣州石牌和廣東高要的、揮發(fā)油組分以廣藿香酮為主的品種歸類為廣藿香酮型廣藿香；而將產(chǎn)自包括廣東吳川、雷州和海南省萬寧等地、其揮發(fā)油組分以廣藿香醇為主的廣藿香歸類為廣藿香醇型廣藿香[33]。雖然，組培廣藿香和扦插廣藿香藥材中百秋里醇和廣藿香酮的含量不存在顯著性差異[34]；但不少研究表明，廣藿香總揮發(fā)油的產(chǎn)量及其主要成分含量不僅與廣藿香類型和產(chǎn)地有關(guān)外，還與植株部位和采收季節(jié)等影響因素有關(guān)[33,35-37]。如牌香 (廣州石牌廣藿香)類的揮發(fā)油中均含有較多量的廣藿香酮，而瓊香 (產(chǎn)自海南) 類的揮發(fā)油組分中不含或含較少量的廣藿香酮，但含有較多量的廣藿香醇；且牌香的有效成分廣藿香酮含量在每年12月份時達到最高值[35]。而GC-MS分析測定表明，國產(chǎn)廣藿香精油中百秋里醇濃度可達

337.04 mg/mL，約比印尼產(chǎn)廣藿香高8.59%[36]。而羅集鵬等[37]報道，牌香藥材中葉片的揮發(fā)油含量遠大于莖，約為莖的4倍；且在不同采收期內(nèi)石牌廣藿香全株揮發(fā)油含量約為0.17%?0.26%；其莖部含油率約為0.05%?0.15%；但葉片含油率則為0.36%?0.96%。而這與我們的結(jié)果不完全一致。在我們的實驗中，對照 (2年生的二倍體野生植株) 的植株含油率為0.18%；而與對照相比，盆栽2個月的二倍體廣藿香毛狀根再生植株的廣藿香醇含量還略高于對照；其植株廣藿香醇含量為0.198%；而栽培2個月的廣藿香毛狀根多倍體再生植株的廣藿香醇含量則比對照和二倍體毛狀根再生植株分別高2.3倍和2.14倍，約為0.425%。而這種差異的產(chǎn)生可能與樣品的采收期和生長期、毛狀根特性以及植株的倍性水平等因素的影響有關(guān)；但同時表明，通過毛狀根多倍體化獲得的牌香類廣藿香多倍體植株，不僅具有多倍體的生長性狀，而且還具有比原植株更高的廣藿香揮發(fā)油組分廣藿香醇含量；但至于毛狀根多倍體化是否也會提高其揮發(fā)油組分廣藿香酮含量以及是否會引起廣藿香毛狀根多倍體再生植株的藥用成分指紋圖譜的變化以及毛狀根多倍體化提高廣藿香多倍體植株揮發(fā)油組分廣藿香醇含量的分子機理則待進一步研究。而本文所建立的廣藿香毛狀根多倍體再生植株系為今后利用該多倍體再生植株系來提高藥用植物廣藿香揮發(fā)油的含量和產(chǎn)量以及生產(chǎn)出揮發(fā)油含量更高的廣藿香新種質(zhì) (種苗) 提供了可能性。

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(本文責編 陳宏宇)

Induction of polyploid hairy roots and its plant regeneration in Pogostemon cablin

Heping Shi1, Wu Yu1, Guopeng Zhang1, Pokeung Eric Tsang2, and Cheuk Fai Stephen Chow2

1 Guangdong Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, Guangdong, China
2 Department of Science and Environmental Studies, The Hong Kong Institute of Education, New Territories, Hong Kong, China

In order to enhance the content of secondary metabolites patchouli alcohol in Pogostemon cablin, we induced polyploid hairy roots and their plant regeneration, and determined the content of patchouli alcohol through artificial chromosome doubling with colchicine. The highest rate of polyploidy induction was more than 40% when hairy roots were treated with 0.05% colchicine for 36 h. The obtained polyploid hairy roots formed adventitious shoots when cultured in an MS medium with 6-BA 0.2 mg/L and NAA 0.1 mg/L for 60 d. Compared with the control diploid plants, the polyploid hairy root-regenerated plants of P. cablin had more developed root systems, thicker stems, shorter internodes and longer, wider and thicker leaves. Observation of the chromosome number in their root tip cells reveals that the obtained polyploid regenerated plants were tetraploidy, with 128 (4n=128) chromosomes. The leaves contained around twice as many stomatal guard cells and chloroplasts as the controls, but the stomatal density declined with increasing ploidy. The stomatal density in diploid plants was around 1.67 times of that in polyploid plants. GC-MS analysis shows that the content of patchouli alcholol in the hairy root-derived polyploid plants was about 4.25 mg/g dry weight, which was 2.3 times of that in diploid plants. The present study demonstrates that polyploidization of hairy roots can stimulate the content of patchouli alcholol in medicinal plant of P. cablin.

Pogostemon cablin (Blanco) Benth, colchicines, polyploidy, plant regeneration

October 22, 2013; Accepted: December 23, 2013

Heping Shi. Tel: +86-20-85214793; E-mail: shihp@scnu.edu.cn

施和平, 余武, 張國鵬, 等. 廣藿香毛狀根多倍體誘導及其植株再生. 生物工程學報, 2014, 30(8): 1235?1246.

Shi HP, Yu W, Zhang GP, et al. Induction of polyploid hairy roots and its plant regeneration in Pogostemon cablin. Chin JBiotech, 2014, 30(8): 1235?1246.

Supported by: Committee of Science and Technology in Guangdong Province (No. 2008B020200005).

廣東省科技計劃項目 (No. 2008B020200005) 資助。