王貝貝，施明雨，王冬，許驕陽，劉怡，楊洪江，戴住波，張學禮

1 天津科技大學生物工程學院，天津 300457

2 中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津 300308

3 中國科學院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308

代謝工程改造釀酒酵母生產(chǎn)β-胡蘿卜素

王貝貝1,2,3，施明雨1,2,3，王冬1,2,3，許驕陽2,3，劉怡2,3，楊洪江1，戴住波2,3，張學禮2,3

1 天津科技大學生物工程學院，天津 300457

2 中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津 300308

3 中國科學院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308

β-胡蘿卜素在食品、藥品和化妝品領域有廣泛用途。為獲得生產(chǎn)β-胡蘿卜素的微生物細胞工廠，本研究首先在釀酒酵母BY4742中過表達甲羥戊酸 (MVA) 途徑的限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR) 基因及二萜化合物合成的關鍵酶牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶 (GGPS) 基因，牻牻來提高牛兒基牛兒基焦磷酸 (GGPP) 的供給。在釀酒酵母底盤菌BY4742-T2的基礎上整合來源于成團泛菌和紅法夫酵母的β-胡蘿卜素合成基因，比較釀酒酵母工程菌生產(chǎn)β-胡蘿卜素的差別。結(jié)果表明提高釀酒酵母中HMGR和GGPS酶基因的表達能將工程菌中β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提高26.0倍。另外，來源于真核生物紅法夫酵母的合成基因相比成團泛菌，更有利于釀酒酵母生產(chǎn)β-胡蘿卜素。最終獲得的釀酒酵母工程菌BW02能生產(chǎn)1.56 mg/g細胞干重的β-胡蘿卜素，為進一步獲得高產(chǎn)β-胡蘿卜素細胞工廠提供基礎。

β-胡蘿卜素，成團泛菌，紅法夫酵母，釀酒酵母

類胡蘿卜素 (Carotenoids) 是一類重要的天然色素，主要包括β-胡蘿卜素 (β-carotene)、番茄紅素(Lycopene)、玉米黃素(Zeaxanthin)、角黃素(Canthaxanthin)和蝦青素 (Astaxanthin) 等[1]。其中β-胡蘿卜素是一種抗氧化劑，在人體內(nèi)能轉(zhuǎn)化為維生素A，活性顯著，在藥品、保健品、化妝品和食品上已有廣泛的應用[2]；在紅法夫酵母Xanthophyllomyces dendrorhous或雨生紅球藻Haematococcus pluvialis等生物體中被作為中間體進一步生物催化為抗氧化活性更強的蝦青素[1,3-4]。天然來源的β-胡蘿卜素優(yōu)于化學合成，更能被市場接受，目前市場上銷售的β-胡蘿卜素90%是通過化學合成法獲得，但隨著國內(nèi)外對天然β-胡蘿卜素市場需求的增加，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)具有廣闊的應用前景[5]。自然界很多微生物能合成β-胡蘿卜素，例如紅法夫酵母X. dendrorhous、三孢布拉氏霉菌Blakeslea trispora、噬夏孢歐文氏菌Erwinia uredovora和成團泛菌Pantoea agglomerans等，但由于自然產(chǎn)量低，很難工業(yè)化。

基于這類化合物的重要性，目前類胡蘿卜素生物合成途徑已經(jīng)基本解析清楚：如來源于真菌紅法夫酵母XdCrtBY、XdCrtI、XdCrtR 和XdCrtS基因組成的合成途徑能將其體內(nèi)二萜的基本前體牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸 (GGPP)依次催化獲得番茄紅素、β-胡蘿卜素和蝦青素等類胡蘿卜素[1,3]；細菌來源的成團泛菌中由PagCrtB、PagCrtI和PagCrtY基因組成的合成途徑能生產(chǎn)番茄紅素和β-胡蘿卜素等類胡蘿卜素[6](圖1)。

圖1 釀酒酵母中MVA途徑及引入的β-胡蘿卜素合成途徑Fig. 1 MVA pathway for isoprenoid biosynthesis in yeast and heterologous β-carotene synthetic pathway. Abbreviation: HMG-CoA, 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A; IPP, Isopentenyl diphosphate; DMAPP, Dimethylallyl diphosphate; GGPP, geranylgeranyl diphosphate.

釀酒酵母為安全的模式微生物，已成功被遺傳改造為能生產(chǎn)青蒿酸[7]、丹參酮類[8-9]、白藜蘆醇[10]和人參皂苷[11]等多種天然產(chǎn)物的工程菌株。釀酒酵母中存在能生物合成萜類的甲羥戊酸 (MVA) 途徑，其能利用乙醇、半乳糖和葡萄糖等簡單碳源合成萜類基本單元異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸 (DMAPP)，這兩個萜類單元能被法呢烯焦磷酸合酶 (FPS，ERG20基因編碼) 和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶 (GGPS，BTS1基因編碼) 依次催化得到二萜類的通用前體牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)；GGPP能繼續(xù)被CrtB、CrtI和CrtY等胡蘿卜素基因編碼的酶催化形成β-胡蘿卜素(圖1)。Yamano等利用噬夏孢歐文氏菌的β-胡蘿卜素合成途徑基因，在釀酒酵母中構(gòu)建出能生產(chǎn)0.1 mg/g細胞干重的工程菌[12]；Verwaal等利用紅法夫酵母的β-胡蘿卜素合成途徑基因，在釀酒酵母中構(gòu)建出生產(chǎn)5.9 mg/g干重細胞的工程菌[13]；Li等在釀酒酵母中通過對紅法夫酵母β-胡蘿卜素合成途徑的XdCrtBY和XdCrtI基因中的相關密碼子進行優(yōu)化，結(jié)合過量表達MVA途徑中的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶 (HMGR) 基因的策略，獲得產(chǎn)量為0.39 mg/g干重細胞的工程菌[2]。

我們前期在大腸桿菌中引入成團泛菌的β-胡蘿卜素合成途徑，再通過對大腸桿菌的MEP、β-胡蘿卜素合成、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑和ATP合成5個功能模塊的組合調(diào)控，將β-胡蘿卜素的生產(chǎn)能力提高了74倍。最終β-胡蘿卜素產(chǎn)量達2.1 g/L，含量達60 mg/g干重細胞[6]。在本研究中，我們首先構(gòu)建了一個高產(chǎn)GGPP的底盤釀酒酵母細胞，在此基礎上，比較了來源于原核生物成團泛菌和來源于真核生物紅法夫酵母的兩條β-胡蘿卜素合成途徑，發(fā)現(xiàn)紅法夫酵母的基因更適合釀酒酵母生產(chǎn)β-胡蘿卜素，為構(gòu)建高產(chǎn)β-胡蘿卜素的釀酒酵母工程菌提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 工具酶與試劑

PrimeSTAR HS DNA聚合酶和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (PrimeScript 1st Strand cDNA SynthesisKit) 購自大連寶生物工程公司；限制性內(nèi)切酶SexAⅠ、PacⅠ和AscⅠ購自 Fermentas公司；快連酶購自NEB公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自美國 Axygen公司；酵母DNA提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；DNA回收試劑盒購自美國Biomiga公司；氨芐青霉素購自上海生工生物工程有限公司；酵母選擇培養(yǎng)基 (四缺，Ura-Trp-Leu-His) 購自北京泛基諾(功能基因組)科技有限公司；番茄紅素標品、β-胡蘿卜素標品和5-FOA均購自美國Sigma-Aldrich 公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

PCR擴增儀，Eppendorf Mastercycler gradient；全自動凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad Molecular Imager Gel DOC XR；臺式高速離心機，Eppendorf 5415D；紫外可見分光光度計，Shimadzu UV-2550；高速冷凍離心機，Thermo Sorvall Evolution RC；高效液相色譜，Agilent Technologies Series 1260。

1.1.3 菌株、引物和質(zhì)粒

本次研究所用菌株、引物和質(zhì)粒已經(jīng)分別在表1–3中列出。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：1% 蛋白胨，0.5% 酵母膏，1%氯化鈉，100 mg/L氨芐青霉素；SM-URA篩選培養(yǎng)基：0.8%酵母選擇培養(yǎng)基 (四缺，Ura-Trp-Leu-His)，2%葡萄糖，0.01% His，0.01% Trp，0.01% Leu；SM-HIS篩選培養(yǎng)基：0.8% 酵母選擇培養(yǎng)基 (四缺，Ura-Trp-Leu-His)，2% 葡萄糖，0.01% Trp，0.01% Leu，0.01% Ura；YPD培養(yǎng)基：2% 蛋白胨，1% 酵母膏，2% 葡萄糖；SM-5FOA篩選培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基，0.1% 5-FOA。上述液體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂配成固體培養(yǎng)基。

表1 本研究所用的菌株Table 1 Strains used in this work

表2 本研究所用到的引物Table 2 Primers used in this work

表3 本研究所用的質(zhì)粒Table 3 Plasmids used in this study

1.2 方法

1.2.1 功能基因克隆與分析

于YPD液體培養(yǎng)基中，20 ℃振蕩培養(yǎng)紅法夫酵母X. dendrorhous，10 000×g離心收集菌體，液氮研磨后，用Trizol法提取總RNA和用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit) 獲得紅法夫酵母cDNA模板[15]，分別用引物組合XdCrtI-ASC/SexA-XdCrtI，SexA-XdCrtYB/XdCrtYB-ASC-2擴增獲得XdCrtI和XdCrtBY基因。

于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)成團泛菌P. agglomerans，10 000×g離心收集菌體，用DNA提取試劑盒提取擴增模板基因組，分別用引物組合SexA-CrtBI/Asc1-CrtB、SexA-CrtI/ Asc1-CrtB/I和Pac1-PagCrtY/PagCrtY-ASC1擴增獲得pagCrtB、pagCrtI和pagCrtY基因。

將獲得的紅法夫酵母和成團泛菌β-胡蘿卜素合成途徑基因序列導入CAIcal在線服務器中(http://genomes.urv.es/CAIcal) 計算密碼子適應指數(shù)(Codon Adaptation Index, CAI)[16]。

1.2.2 表達功能模塊構(gòu)建

以質(zhì)粒pLHis-ERG20/BTS1-SaGGPS為模板，SexA-SaGGPS/Asc1-SaGGPS為引物擴增到SaGGPS基因片段。用SexAⅠ和AscⅠ分別雙酶切pδ-tHMG1質(zhì)粒，SaGGPS基因片段，及方法“1.2.1”中獲得的pagCrtB和XdCrtBY基因片段，割膠回收目的片段，分別酶連得到重組載體pδ-SaGGPS、pδ-pagCrtB和pδ-XdCrtBY (表3)。用SexAⅠ和AscⅠ分別雙酶切pM3-SynPgPPDS質(zhì)粒和方法“1.2.1”中獲得的pagCrtI和XdCrtI基因片段，割膠回收目的片段，分別酶連得到重組載體pM3-pagCrtI和pM3-XdCrtI。用PacⅠ和AscⅠ分別雙酶切pM11-ERG1質(zhì)粒和方法“1.2.1”中獲得的pagCrtY基因片段，割膠回收目的片段，酶連得到重組載體pM11-pagCrtY。以上質(zhì)粒均由華大基因測序驗證。

1.2.3 二萜底盤菌構(gòu)建

BY4742 感受態(tài)細胞制備和轉(zhuǎn)化用醋酸鋰方法[11]。pδ-tHMG1和pδ-SaGGPS分別用XhoⅠ酶切和膠回收。酶切后的δ-tHMG1基因片段，轉(zhuǎn)入BY4742 感受態(tài)細胞中，用SM-URA固體篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，陽性克隆再經(jīng)過SM-5FOA固體篩選培養(yǎng)基篩選和PCR驗證 (引物Sac11-pGK1/Asc1-HMG1) 獲得工程菌BY4742-T；進一步，酶切后的δ-SaGGPS基因片段轉(zhuǎn)入BY4742-T感受態(tài)細胞中，用SM-URA固體篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，陽性克隆再經(jīng)過SM-5FOA固體篩選培養(yǎng)基篩選和PCR驗證 (引物Sac11-pGK1/Asc1-SaGGPS) 獲得工程菌BY4742-T2。

1.2.4 產(chǎn)β-胡蘿卜素工程菌構(gòu)建

β-胡蘿卜素工程菌的構(gòu)建使用多片段同源重組方法[11]。首先，按照表4中DNA模板和引物搭配方案，用PrimeSTAR HS DNA高保真酶PCR分別擴增獲得用于同源重組的基因模塊。BY4742或BY4742-T2感受態(tài)細胞用醋酸鋰方法制備，按照表4中的 Group A和圖2A所示進行搭配轉(zhuǎn)化后，在SM-HIS篩選培養(yǎng)基篩選分別獲得工程菌BW01和BW03；按照表4中的Group B和圖2B所示進行搭配轉(zhuǎn)化后，在SM-HIS篩選培養(yǎng)基篩選分別獲得工程菌BW02、BW04和BW-CK，陽性克隆根據(jù)菌斑的顏色來直接鑒定 (產(chǎn)胡蘿卜素的菌顯黃色)。

表4 多片段酵母同源重組信息表Table 4 Information of the DNA assembler

圖2 多片段同源重組法在釀酒酵母Trp1基因位點整合β-胡蘿卜素生物合成途徑基因的示意圖 (A: 整合PagCrtB、PagCrtY和PagCrtI (或XdCrtI) 基因；B: 整合XdCrtBY和XdCrtI (或PagCrtI) 基因)Fig. 2 Strains construction using the DNA assembler method. (A) The PagCrtB, PagCrtY and PagCrtI (or XdCrtI) genes were integrated into Trp1 site of BY4742-T2. (B) The XdCrtBY, XdCrtI (or PagCrtI) genes were integrated into Trp1 site of BY4742-T2.

1.2.5 搖瓶發(fā)酵方法

挑取平板活化的單克隆菌株于相應的液體篩選培養(yǎng)基中制備發(fā)酵種子液 (30 ℃，250 r/min，16 h)；離心收集菌體，轉(zhuǎn)移至含10 mL YPD液體培養(yǎng)基100 mL三角瓶中，調(diào)OD至0.1，30 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，檢測OD600及產(chǎn)物含量。

1.2.6 β-胡蘿卜素產(chǎn)量的檢測方法

取2 mL培養(yǎng)的發(fā)酵液于12 000×g離心3 min，無菌水清洗后，加適量玻璃珠 (0.5 mm)和1 mL提取液 (甲醇∶乙腈∶二氯甲烷= 21∶21∶8)，振蕩破碎5 min，冰水中超聲30 min，10 000×g離心5 min，取上清液 (提取二次，合并上清液)；上清液過0.22 μm有機膜后用高效液相色譜分析番茄紅素和β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。檢測條件：DAD 檢測器，Waters Symmetry?C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動相為甲醇∶乙腈∶二氯甲烷(21∶21∶8)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長450 nm；每個待測樣品進行3個生物學重復試驗；番茄紅素和β-胡蘿卜標準品用于定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生產(chǎn)二萜化合物的底盤釀酒酵母細胞的構(gòu)建

菌株BY4742來源于釀酒酵母S288C標準菌株，其萜類生物合成途徑中存在合成二萜的通用前體GGPP。野生型釀酒酵母細胞合成GGPP的能力很差[8]。已有實驗表明，過表達釀酒酵母的tHMG1基因 (截去了酵母HMG1基因中編碼N-端含反饋抑制區(qū)的相關序列) 和嗜酸熱硫化葉菌SaGGPS基因能有效提高釀酒酵母合成GGPP和二萜化合物的能力[8]。為獲得高產(chǎn)GGPP的底盤釀酒酵母細胞，通過同源重組法[11]，攜帶強啟動子PGK1的tHMG1基因和SaGGPS基因被整合到釀酒酵母BY4742的δDNA位點。陽性克隆經(jīng)過特異引物驗證后(圖3)，獲得生產(chǎn)二萜化合物的底盤釀酒酵母細胞BY4742-T2。

圖3 工程菌BY4742-T和BY4742-T2的PCR驗證Fig. 3 PCR verification of strains BY4742-T and BY4742-T2. M: DNA marker; Lane 1 and 2 are PCR products amplified from control strain BY4742; Lane 3 and 4 are PCR products amplified from BY4742-T; Lane 5 and 6 are PCR products amplified from BY4742-T2. Primer set Sac11-pGK1/Asc1 -HMG1 was used to amplify tHMG1 gene (Lane 1, 3 and 5). Primer set Sac11-pGK1/Asc1-SaGGPS was used to amplify SaGGPS gene (Lane 2, 4 and 6).

2.2 底盤釀酒酵母細胞BY4742-T2中引入成團泛菌β-胡蘿卜素合成途徑

成團泛菌能合成β-胡蘿卜素，實驗室前期研究表明成團泛菌β-胡蘿卜素合成途徑的基因在大腸桿菌中能被很好地表達。利用成團泛菌的基因，在系統(tǒng)優(yōu)化的大腸桿菌中β-胡蘿卜素產(chǎn)量能達到2.1g/L[6]。在本研究中，通過多片段同源重組法[11,17]，來源于成團泛菌的pagCrtB、pagCrtI和pagCrtY基因，和對應的PGK1、TEF1和TDH3強啟動子，被整合到底盤釀酒酵母細胞BY4742-T2的Trp1位點，獲得工程菌BW01。該菌發(fā)酵96 h，能生產(chǎn)0.04 mg/g的β-胡蘿卜素和0.06 mg/g的番茄紅素 (圖4)。

2.3 底盤釀酒酵母細胞BY4742-T2中引入紅法夫酵母的β-胡蘿卜素合成途徑

圖4 釀酒酵母工程菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素和番茄紅素Fig. 4 Production of β-carotene and lycopene by metabolically engineered S. cerevisiae strains.

紅法夫酵母能合成強抗氧化活性物質(zhì)蝦青素，同時中間產(chǎn)物β-胡蘿卜素由XdCrtI 和雙功能基因XdCrtBY催化獲得。在本研究中，通過多片段同源重組法，來源于紅法夫酵母的XdCrtBY和XdCrtI 基因，和對應的PGK1和TEF1強啟動子，被整合到底盤釀酒酵母細胞BY4742-T2的Trp1位點，獲得工程菌BW02。該菌發(fā)酵96 h，能生產(chǎn)1.56 mg/g的β-胡蘿卜素和0.4 mg/g的番茄紅素，其含量分別是BW01菌的39.0倍和6.7倍 (圖4)。

2.4 過表達tHMG1基因和SaGGPS基因的作用

為了進一步驗證過表達tHMG1基因和SaGGPS基因?qū)ιa(chǎn)類胡蘿卜素化合物的影響，通過多片段同源重組法，來源于紅法夫酵母的XdCrtBY和XdCrtI 基因和對應的PGK1和TEF1強啟動子，被整合到酵母細胞BY4742的Trp1位點，獲得工程菌BW-CK。該菌發(fā)酵96 h，能生產(chǎn)0.06 mg/g的β-胡蘿卜素和0.01 mg/g的番茄紅素。過表達tHMG1基因和SaGGPS基因后，β-胡蘿卜素和番茄紅素的含量分別提高了26.0和40.0倍，總類胡蘿卜素化合物含量提高了28.0倍，進一步證明這兩個基因的過表達能提高釀酒酵母細胞中GGPP的供給。

為了進一步研究紅法夫酵母的XdCrtBY和XdCrtI基因是否比對應的成團泛菌的基因更有利于β-胡蘿卜素合成，我們對紅法夫酵母和成團泛菌β-胡蘿卜素合成途徑的基因進行了組合。紅法夫酵母XdCrtI基因和成團泛菌pagCrtB與pagCrtY基因組合后，獲得工程菌BW03。其β-胡蘿卜素和番茄紅素的含量分別為0.06 mg/g和0.17 mg/g。

紅法夫酵母的雙功能基因XdCrtBY和成團泛菌pagCrtI基因組合后，獲得工程菌BW04。其β-胡蘿卜素和番茄紅素的含量分別為0.75 mg/g和0.07 mg/g。

相比全部使用成團泛菌基因的工程菌BW01、BW03和BW04中β-胡蘿卜素和番茄紅素的含量有不同程度提高，但均低于全部使用紅法夫酵母基因的工程菌BW02的產(chǎn)量 (圖4)。這表明紅法夫酵母的XdCrtBY和XdCrtI基因都比對應的成團泛菌的基因更有利于釀酒酵母中β-胡蘿卜素的合成。

2.6 紅法夫酵母和成團泛菌β-胡蘿卜素合成途徑基因的密碼子適應指數(shù)(CAI)分析

密碼子適應指數(shù)(Codon adaption index. CAI)能評估某基因的密碼子與宿主細胞中高表達基因集所用密碼子的接近程度 (0–1.0，值越接近1.0程度越高)，它一般用來預測基因的表達水平[16,18-19]。根據(jù)CAIcal服務器中提供的模式物種釀酒酵母和大腸桿菌的密碼子使用參考數(shù)據(jù)庫[16,20]，分別計算紅法夫酵母XdCrtBY和XdCrtI基因，及成團泛菌pagCrtB、pagCrtI和pagCrtY基因的密碼子適應指數(shù)。結(jié)果表明在真核宿主釀酒酵母中紅法夫酵母來源基因的CAI值 (分別為0.68和0.69) 均高于成團泛菌來源基因的CAI值 (分別為0.62、0.63和0.61)；然而，在原核生物大腸桿菌中成團泛菌來源基因的CAI值 (分別為0.82、0.82和0.81) 均高于紅法夫酵母來源基因的CAI值 (分別為0.68和0.70) (表5)。

表5 密碼子適應指數(shù)分析Table 5 Analysis of Codon Adaptation Index

3 討論

萜類化合物在自然界廣泛存在，目前發(fā)現(xiàn)的萜類就超過5萬多種[21]，其中大部分是藥用植物中的活性成分。由4個IPP單元組成的GGPP能在各種二萜環(huán)合酶的作用下，生產(chǎn)多樣的二萜類化合物。功能基因組分析結(jié)合工程菌構(gòu)建生產(chǎn)目標產(chǎn)品已經(jīng)被廣泛用于天然產(chǎn)物的生物合成途徑解析和產(chǎn)物合成，如次丹參酮二烯[8-9]、齊墩果酸[22-23]和原人參二醇[11,24]等。HMGR是酵母MVA途徑中的第一個關鍵酶，提高其編碼基因HMG1的表達水平能顯著提高整個萜類的生物合成通量[8-9,11,15,25]。編碼GGPS酶的BTS1基因是酵母合成二萜類產(chǎn)物的另一關鍵酶，在工程菌中一般過表達BTS1基因能提高二萜合成分支的代謝通量[9,13]。本研究通過對tHMG1基因和SaGGPS基因的過表達調(diào)控，構(gòu)建了底盤釀酒酵母細胞BY4742-T2。其能顯著提高胞內(nèi)GGPP的供給，不僅可以作為構(gòu)建高產(chǎn)二萜化合物和類胡蘿卜素化合物的出發(fā)菌，而且能作為底盤細胞，用于解析新二萜化合物的生物合成途徑。

式中:Ci表示每組氣體的第i次測量濃度值,C表示每組氣體測量濃度值的算數(shù)平均值,n表示每組氣體的測量次數(shù)。

在高產(chǎn)GGPP的底盤釀酒酵母細胞中引入紅法夫酵母β-胡蘿卜素合成途徑后，β-胡蘿卜素和番茄紅素的含量比引入成團泛菌β-胡蘿卜素合成途徑的要高39.0倍和6.7倍，表明紅法夫酵母β-胡蘿卜素合成途徑在釀酒酵母中的活性更高。然而，在大腸桿菌中引入成團泛菌β-胡蘿卜素合成途徑能獲得很高的β-胡蘿卜素的產(chǎn)量 (60 mg/g)[6]，這種差異可能是由于來源于原核生物的基因在真核生物中存在密碼子使用的偏好性問題，使其不能很好地表達[18-19]。對各基因的密碼子適應指數(shù) (CAI值) 進一步分析發(fā)現(xiàn)，成團泛菌β-胡蘿卜素合成途徑基因在真核生物釀酒酵母中的CAI值 (平均值0.62)均低于紅法夫酵母來源基因(平均值0.69)，但其在原核生物大腸桿菌中有較高的CAI值，平均值為0.82，結(jié)果提示紅法夫酵母來源基因可能更容易在釀酒酵母中表達，而成團泛菌來源基因更適于在大腸桿菌中表達[16]。另一方面，紅法夫酵母的XdCrtBY是一個雙功能酶，其能使上一步反應的底物更快地結(jié)合到第二個酶的催化位點，加快第二個反應的進行，從而在空間上更有利于兩個催化反應的進行[9,26]。

與前人的研究結(jié)果比較，本研究獲得的工程菌生產(chǎn)β-胡蘿卜素能力低于Verwaal等在釀酒酵母CEN.PK中構(gòu)建的工程菌[13]?？赡茉蚴荲erwaal等應用了不同遺傳改造策略：如過表達紅法夫酵母來源的CrtE基因和進一步增加了CrtI基因的拷貝數(shù)等[13]；另外，不同的釀酒酵母細胞株系合成萜類的能力也存在區(qū)別，CEN.PK株系可能有較強的合成萜類化合物前體的能力[2,27]。

本研究構(gòu)建的釀酒酵母工程菌為發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素提供了良好的菌株基礎。下一步擬采用密碼子優(yōu)化來提高成團泛菌β-胡蘿卜素合成途徑的基因在釀酒酵母中的表達強度。同時，還將在釀酒酵母中測試更多不同真核與原核生物的β-胡蘿卜素合成途徑，挖掘出更合適釀酒酵母的β-胡蘿卜素合成基因。

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(本文責編 郝麗芳)

Production of β-carotene by metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae

Beibei Wang1,2,3, Mingyu Shi1,2,3, Dong Wang1,2,3, Jiaoyang Xu2,3, Yi Liu2,3, Hongjiang Yang1，Zhubo Dai2,3, and Xueli Zhang2,3

1 College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China
2 Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China
3 Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

β-carotene has a wide range of application in food, pharmaceutical and cosmetic industries. For microbial production of β-carotene in Saccharomyces cerevisiae, the supply of geranylgeranyl diphosphate (GGPP) was firstly increased in S. cerevisiae BY4742 to obtain strain BY4742-T2 through over-expressing truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (tHMGR), which is the major rate-limiting enzyme in the mevalonate (MVA) pathway, and GGPP synthase (GGPS), which is a key enzyme in the diterpenoid synthetic pathway. The β-carotene synthetic genes of Pantoea agglomerans and Xanthophyllomyces dendrorhous were further integrated into strain BY4742-T2 for comparing β-carotene production. Over-expression of tHMGR and GGPS genes led to 26.0-fold increase of β-carotene production. In addition, genes from X. dendrorhous was more efficient than those from P. agglomerans for β-carotene production in S. cerevisiae. Strain BW02 was obtained which produced 1.56 mg/g (dry cell weight) β-carotene, which could be used further for constructing cell factories for β-carotene production.

β-carotene, Pantoea agglomerans, Xanthophyllomyces dendrorhous, Saccharomyces cerevisiae

November 18, 2013; Accepted: January 22, 2014

Xueli Zhang. Tel/Fax: +86-22-84861983; E-mail: zhang_xl@tib.cas.cn

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Wang BB, Shi MY, Wang D, et al. Production of β-carotene by metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae. Chin JBiotech, 2014, 30(8): 1204?1216.

Supported by: National High Technology Research and Development Program (863 Program) (No. 2012AA02A704), National Natural Science Foundation of China (No. 81202864), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CBA00800), Hundred Talent Program of the Chinese Academy of Sciences.

Zhubo Dai. Tel/Fax: +86-22-84861946; E-mail: dai_zb@tib.cas.cn

國家高技術研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2012AA02A704)，國家自然科學基金 (No. 81202864) ，國家重點基礎研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2011CBA00800)，中國科學院百人計劃資助。

時間：2014-03-10 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.130582.html