李玉元，米志強，安小平，周育森，童貽剛

1 廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021

2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

基于重組溶葡球菌酶和ATP生物發(fā)光技術(shù)特異定量檢測金黃色葡萄球菌

李玉元1,2，米志強2，安小平2，周育森1,2，童貽剛2

1 廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021

2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

基于重組溶葡球菌酶和ATP生物發(fā)光法建立特異定量檢測金黃色葡萄球菌的方法。優(yōu)化設(shè)計合成溶葡球菌酶序列，構(gòu)建重組表達(dá)載體pQE30-Lys，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌M15并誘導(dǎo)表達(dá)，鎳柱純化得到目的蛋白。利用重組溶葡球菌酶和ATP生物發(fā)光法特異定量檢測金黃色葡萄球菌并與平板計數(shù)對比。成功表達(dá)了重組溶葡球菌酶，并建立了特異定量檢測金黃色葡萄球菌的方法，與平板計數(shù)具有顯著線性關(guān)系。本研究建立的將重組溶葡球菌酶和ATP生物發(fā)光法相結(jié)合的檢測方法操作快捷簡單，具有良好的應(yīng)用前景。

金黃色葡萄球菌，重組溶葡球菌酶，ATP生物發(fā)光，特異和定量檢測

金黃色葡萄球菌 (簡稱金葡菌) 是人類皮膚表面常見菌群，但它同時也是一種非常重要的致病菌，能夠引起小到皮膚病大到肺炎及菌血癥這類威脅人類生命的疾病[1-5]。不僅僅是人類，家畜也容易感染金黃色葡萄球菌，金葡菌能夠?qū)е履膛Ｈ橄傺准半u傳染性關(guān)節(jié)炎，這嚴(yán)重威脅了食品健康，導(dǎo)致食品污染，帶來重大經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。值得注意的是，耐藥金葡菌的感染不斷增加，例如，耐甲氧西林金葡菌 (MRSA)和耐萬古霉素金葡菌 (VRSA) 已引起更多關(guān)注，因為金葡菌是醫(yī)院感染最常見的原因[8-12]。因此，建立快速檢測金黃色葡萄球菌的方法，對于防治金黃色葡菌球菌感染，進(jìn)行早期治療減少損失是非常必要的。

本研究基于重組溶葡球菌酶和ATP生物發(fā)光法建立金黃色葡萄球菌快速檢測方法。溶葡球菌酶 (Lysostaphin) 是從模仿葡萄球菌Staphylococcus simulans中分離出來的一種含鋅的金屬蛋白酶，具有水解葡萄球菌細(xì)胞壁肽聚糖五肽橋聯(lián)的催化活性，對金葡菌有強大的溶菌作用[13-15]；ATP生物發(fā)光測定法是快速檢測微生物的方法之一[16-17]，在Mg2+存在下，熒光素酶 (Luciferase) 以D-熒光素、ATP、O2為底物，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，發(fā)出熒光，根據(jù)ATP與熒光素反應(yīng)產(chǎn)生熒光的原理, 可對微生物細(xì)胞內(nèi)的ATP進(jìn)行測定，從而定量檢測細(xì)菌數(shù)[18-20]。所以，本實驗室首先利用重組溶葡球菌酶裂解金葡菌釋放ATP，然后結(jié)合ATP生物發(fā)光法，實現(xiàn)對金葡菌的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒和菌株

pQE30質(zhì)粒由本實驗室保存。克隆菌株E. coli Trans1-T1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；表達(dá)菌株E. coli M15購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司；金黃色葡萄球菌ATCC 25923購自美國模式培養(yǎng)物集存庫 (ATCC)，其他菌株來源于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院臨床檢驗科，本實驗室保存。

1.1.2主要試劑和設(shè)備

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH 7.0，制作平板時加入1.5%瓊脂粉，制作半固體時加入0.75%瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌20 min。

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ-HF、Hind Ⅲ-HF和T4 DNA連接酶購自NEB公司。DNA Marker、Protein Marker和質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司；鎳柱預(yù)裝柱購自上海生工生物工程有限公司；Profile-1 3560 (10X) ATP微生物快速檢測系統(tǒng)購自北京浩正智信科技有限公司；752紫外-可見分光光度計購自上海菁華科技儀器有限公司。

化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純，由本實驗室保存制備。

1.2 方法

1.2.1目的基因的合成及重組表達(dá)載體的構(gòu)建

在NCBI上得到Lysostaphin (Staphylococcus simulans by stashylolyticus) 的基因序列 (GenBank Accession No. 8864975)，對其進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，使其更易于在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行可溶性表達(dá)，分別設(shè)計上下游酶切位點BamHⅠ (GGATCC)和Hind Ⅲ (AAGCTT)，片段大小753 bp，由金唯智生物科技 (北京) 有限公司合成。

BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切目的基因和表達(dá)載體pQE30，連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans1-T1。挑取陽性克隆經(jīng)酶切初步鑒定正確的進(jìn)行測序，將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pQE30-Lys。

1.2.2重組溶葡球菌酶的誘導(dǎo)表達(dá)、純化

將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pQE30-Lys轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株E. coli M15中，涂于含有氨芐抗生素(終濃度100 μg/mL) 的固體LB培養(yǎng)基平板中，倒置平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1∶100比例轉(zhuǎn)接至500 mL新鮮氨芐抗性培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600值約0.6?0.8，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，37 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6–8 h后收集菌液。誘導(dǎo)后的菌液10 000×g離心10 min，棄掉上清，PBS重懸菌體，超聲波破碎處理后10 000×g離心10 min，收集上清經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后采用鎳柱純化的方式回收目的蛋白，表達(dá)及純化結(jié)果以SDS-PAGE方法檢測。

1.2.3重組溶葡球菌酶活性檢測

將金葡菌 (金葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25923和173株臨床分離的金葡菌) 和其他7株受試菌(108大腸桿菌、095沙門氏菌、012嗜麥芽窄食單胞菌、002糞腸球菌、071鮑曼不動桿菌、084大腸埃希菌、003肺炎克雷伯菌) 培養(yǎng)至對數(shù)期，取500 μL鋪雙層LB平板，室溫靜置10 min，吸取1 μL酶液滴于平板上，同時以緩沖液PBS作陰性對照，37 ℃倒置培養(yǎng)3–4 h后觀察結(jié)果。

1.2.4平板計數(shù)金葡菌ATCC 25923和其他7株受試菌

將培養(yǎng)好的菌液離心 (10 000 r /min, 1 min)倒去上清液，沉淀用等體積PBS洗滌1次，用等體積PBS懸浮，此即菌液原液。稀釋：(假定菌液濃度約為1 ×106CFU/mL) 用PBS將菌液做10倍遞增稀釋。分別吸取各稀釋度的菌液50 μL涂布于固體LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，每個梯度做3個重復(fù)，同時作空白對照。次日選取菌落數(shù)在30–300范圍內(nèi)的稀釋度作平板計數(shù)并取其平均值[21]。

1.2.5 ATP發(fā)光法特異定量檢測金黃色葡菌球菌

按照Profile-1 3560 (10X) ATP微生物快速檢測系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行：分別取50 μL待測菌液加入到專用的過濾比色杯中，比色杯下鋪一層濾紙；滴加4滴SRA試劑 (非細(xì)菌細(xì)胞釋放液)，

用壓力器對準(zhǔn)比色杯頂端，按下壓力器把液體壓出至濾紙，重復(fù)該步驟一次；將比色杯放入

3560 (10X) 微光度計的抽屜中，加入100 μL (約

4.5 μg) 稀釋的重組溶葡球菌酶液，等待2 min，

使細(xì)菌充分被裂解；吸取50 μL已制備好的熒光酶溶液加入到比色杯中，吹打混勻3次，推回抽屜，記錄儀器讀數(shù)。每個濃度梯度的樣品做3

組重復(fù)，計算平均值為最終結(jié)果[22-23]。

2 結(jié)果

2.1 基因合成和重組質(zhì)粒pQE30-Lys轉(zhuǎn)化結(jié)果鑒定

密碼子優(yōu)化設(shè)計合成序列如下，加粗部分為酶切位點：

GGATCCGCCGCCACCCACGAGCACAGCGCA CAGTGGCTGAACAACTACAAGAAAGGTTAT GGCTACGGCCCTTACCCGCTGGGCATCAATG GTGGCATGCACTACGGCGTGGACTTCTTCAT GAACATCGGCACCCCTGTGAAGGCCATCAG CAGCGGCAAAATCGTGGAGGCCGGCTGGAG CAATTACGGCGGTGGCAACCAGATCGGCCT GATCGAGAACGACGGCGTGCACCGCCAGTG GTACATGCACCTGAGCAAGTACAACGTGAA GGTGGGTGACTACGTGAAGGCCGGCCAGAT TATCGGCTGGAGTGGTAGCACCGGCTATAG CACCGCCCCTCACCTGCACTTCCAGCGCATG GTTAACAGCTTCAGCAACAGCACCGCCCAA GATCCGATGCCGTTCCTGAAGAGCGCCGGTT ATGGCAAGGCAGGCGGTACCGTTACCCCGA CCCCGAACACAGGCTGGAAGACCAACAAGT ACGGCACCCTGTATAAGAGCGAGAGTGCCA GCTTCACCCCGAACACCGACATCATTACCCG CACAACCGGTCCGTTCCGTAGCATGCCTCAG AGCGGCGTGCTGAAGGCAGGCCAGACCATC CACTACGACGAGGTGATGAAGCAGGACGGC CATGTGTGGGTTGGCTATACCGGCAATAGCG GCCAACGCATCTACCTGCCGGTGCGCACCTG GAATAAGAGCACCAACACCCTGGGCGTGCT GTGGGGCACAATCAAATAAAAGCTT

重組質(zhì)粒pQE30-Lys經(jīng)雙酶切后，可見大小約753 bp的目的片段，經(jīng)測序證實結(jié)果正確，表明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功 (圖1)。

2.2 重組溶葡球菌酶的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定,可見一相對分子質(zhì)量約為27 kDa的蛋白條帶，大小與理論預(yù)測的蛋白大小相一致 (圖2)。經(jīng)鎳柱純化后蛋白條帶比較單一，得到較純的蛋白 (圖3)，測定純化后的蛋白濃度約為1 mg/mL。

2.3 重組溶葡球菌酶活性檢測

圖1 酶切鑒定重組質(zhì)粒pQE30-LysFig. 1 Recombinant plasmid pQE30-Lys digested with restriction endonuclease BamH I and Hind III. 1: recombinant plasmid pQE30-Lys; 2: recombinant plasmid pQE30-Lys digested with restriction endonuclease BamH I and Hind III; M: 1 kb ladder DNA marker.

圖2 SDS-PAGE分析重組溶葡球菌酶的表達(dá)Fig. 2 SDS-PAGE analysis of expression of recombinant lysostaphin. M: broad molecular weight protein marker; 1, 2: negative control pQE30/M15; 3: pQE30-Lys/M15.

圖3 SDS-PAGE分析重組溶葡球菌酶的純化Fig. 3 SDS-PAGE analysis of purification results of the recombinant lysostaphin. M: low molecular weight protein marker; 1: the ultrasonic supernatant of pQE30-Lys/M15 with IPTG induction; 2–9: purified recombinant lysostaphin.

點滴法驗證重組溶葡球菌酶活性，可在金黃色葡萄球菌 (金葡菌ATCC 25923和173株臨床分離金葡菌) 平板上滴有重組溶葡球菌酶的區(qū)域觀察到透亮裂解斑如圖4箭頭所示，其他7株受試菌沒有裂解斑 (此處僅顯示出金葡菌ATCC 25923和大腸桿菌E. coli點滴法驗證結(jié)果，其他不一一列出) (圖4)。

圖4 重組溶葡球菌酶活性驗證Fig. 4 Spot test on a LB plate with purified recombinant lysostaphin. (A) Recombinant lysostaphin. (B) Negative control PBS.

2.4 ATP測定法與平板計數(shù)法

2.4.1 ATP測定法與平板計數(shù)法試驗結(jié)果

選取稀釋倍數(shù)為10–4細(xì)菌溶液的平板計數(shù)結(jié)果為依據(jù)，3組數(shù)據(jù)分別為：204、189和165，求得平均值是186，并由此計算其他稀釋度細(xì)菌溶液的細(xì)菌數(shù)，見表1；利用ATP生物發(fā)光法測定出相應(yīng)稀釋度的細(xì)菌溶液的發(fā)光值，每個樣品重復(fù)3次測定，記錄數(shù)據(jù)，計算其平均值，結(jié)果見表1。

2.4.2 ATP測定法與平板計數(shù)法相關(guān)性

根據(jù)表1，采用10–4及以上稀釋度各組的數(shù)據(jù)，以平板計數(shù)平均值的對數(shù)值為X軸，以光值平均值的對數(shù)值為Y軸，做X、Y散點圖描繪關(guān)系曲線，如圖5，線性回歸方程為： y=0.961 3x–0.588 1，R2=0.995 7。由表1和圖5可知，當(dāng)細(xì)菌數(shù)在186 CFU以上時，生物發(fā)光值與平板計數(shù)呈顯著相關(guān)。

2.5 基于ATP生物發(fā)光法和重組溶葡球菌酶特異性檢測金黃色葡萄球菌

將金黃色葡萄球菌與其他7株受試菌培養(yǎng)到對數(shù)期，按一定比例稀釋，使菌液濃度一致，然后利用重組溶葡球菌酶結(jié)合ATP生物發(fā)光法進(jìn)行細(xì)菌檢測，結(jié)果如圖6所示，從圖6可以看出同等濃度下的細(xì)菌，金黃色葡萄球菌的相對發(fā)光值與其他菌株存在明顯差異，重組溶葡球菌酶對于金黃色葡萄球菌顯示了強大的殺菌能力；同時點滴法的結(jié)果 (結(jié)果2.3) 表明，重組溶葡球菌酶對除金黃色葡萄球菌之外的其他7株受試菌株均無殺菌活性，均不能觀察到透亮的裂解斑，進(jìn)一步說明了結(jié)合重組溶葡球菌酶的ATP發(fā)光法檢測金黃色葡萄球菌具有特異性。

表1 ATP測定法與平板計數(shù)法數(shù)據(jù)Table 1 Data by ATP test method and plate count method

圖5 平板計數(shù)與光值對應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 5 Standard curve of plate count and luminescence value.

圖6 重組溶葡球菌酶裂解細(xì)菌后的相對發(fā)光值Fig. 6 Relative luminescence value after recombinant lysostaphin lysis. 1: Staphylococcus aureus ATCC 25923; 2: 108 E. coli; 3: 095 Salmonella; 4: 012 Stenotrophomonas maltophilia; 5: 002 E. faecalis; 6: 071 A. baumanii; 7: 084 E. coli; 8: 003 Klebsiella pneumoniae.

3 討論

近年來，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，利用ATP生物發(fā)光法對細(xì)菌進(jìn)行定量檢測的方法已應(yīng)用于食品工業(yè)、臨床檢測等眾多領(lǐng)域[18,24-25]。目前以ATP生物發(fā)光法定量檢測細(xì)菌的研究往往采用細(xì)菌裂解液來裂解細(xì)菌從而釋放ATP，大多不具有特異性和專一性。重組溶葡球菌酶能夠高效特異地裂解葡萄球菌尤其是金黃色葡萄球菌。因此，本實驗室通過重新設(shè)計溶葡球菌酶的蛋白結(jié)構(gòu)，保留其殺菌活性區(qū)，使溶葡萄球菌酶的生產(chǎn)不用從其生物學(xué)活性極低的蛋白前體開始，而是直接表達(dá)殺菌活性強的成熟溶葡萄球菌酶[26]，同時對編碼的基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中實現(xiàn)了高效可溶性表達(dá)，通過鎳柱純化獲得較純的酶液。重組溶葡球菌酶對于金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株殺菌活性的研究，證明了重組溶葡球菌酶保持了強大的殺菌活性。因此本研究利用重組溶葡球菌酶替代原始檢測系統(tǒng)中的細(xì)菌裂解液，結(jié)合ATP生物發(fā)光技術(shù)，建立了快速檢測金黃色葡萄球菌的方法。該檢測方法的檢測下限為186 CFU，可以滿足一般檢測的需求；當(dāng)樣品所含的細(xì)菌數(shù)量低于186 CFU時，可以采用簡便的濃縮富集技術(shù)或者多次加樣的方法，使?jié)饪s后的樣品菌落總數(shù)達(dá)到有效檢測范圍以內(nèi)，檢測后再通過換算得到原樣品的細(xì)菌數(shù)量。

同時，該方法具備傳統(tǒng)ATP發(fā)光法檢測技術(shù)靈敏快速的優(yōu)點，從待測樣品的制備到細(xì)菌ATP的提取，直到ATP發(fā)光強度的檢測，整個過程可在1 h內(nèi)完成，具有快速、簡便的特點，可以滿足一般快速檢測的要求，在裂解細(xì)菌方面又具有特異性，在現(xiàn)場或臨床定性定量檢測金黃色葡萄球菌方面具有良好的前景和實用價值。REFERENCES

[1] Mann NH. The potential of phages to prevent MRSA infections. Res Microbiol, 2008, 159(5): 400–405.

[2] Watkins RR, David MZ, Salata RA. Current concepts on the virulence mechanisms of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. J Med Microbiol, 2012, 61(9): 1179–1193.

[3] Klem J, Domotor D, Schneider G, et al. Bacteriophage therapy against staphylococci. Acta Microbiol Immunol Hungar, 2013, 60(4): 411–422.

[4] Rajan S. Skin and soft-tissue infections: classifying and treating a spectrum. Cleveland Clin J Med, 2012, 79(1): 57–66.

[5] Pletz MW, Burkhardt O, Welte T. Nosocomial methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) pneumonia: linezolid or vancomycin?-comparison of pharmacology and clinical efficacy. Eur J Med Res, 2010, 15(12): 507.

[6] Vanderhaeghen W, Hermans K, Haesebrouck F, et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in food production animals. Epid Infect, 2010, 138(5): 606–625.

[7] Yoon H, Yun J, Lim JA, et al. Characterization and genomic analysis of two Staphylococcus aureus bacteriophages isolated from poultry/livestock farms. J Gener Virol, 2013, 94(11): 2569–2576.

[8] DeLeo FR, Chambers HF. Reemergence of antibiotic-resistant Staphylococcus aureus in the genomics era. J Clin Investig, 2009, 119(9): 2464.

[9] Dulon M, Haamann F, Peters C, et al. MRSA prevalence in European healthcare settings: a review. BMC Infect Dis, 2011, 11(1): 138.

[10] McDougal LK, Steward CD, Killgore GE, et al. Pulsed-field gel electrophoresis typing of oxacillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from the United States: establishing a national database. J Clin Microbiol, 2003, 41(11): 5113–5120.

[11] Tenover FC, Biddle JW, Lancaster MV. Increasing resistance to vancomycin and other glycopeptides in Staphylococcus aureus. Emerg Infect Dis, 2001, 7(2): 327.

[12] Barber M. Methicillin-resistant staphylococci. J Clin Pathol, 1961, 14(4): 385.

[13] Recsei PA, Gruss AD, Novick RP. Cloning, sequence, and expression of the lysostaphin gene from Staphylococcus simulans. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84(5): 1127–1131.

[14] Walsh S, Shah A, Mond J. Improved pharmacokinetics and reduced antibody reactivity of lysostaphin conjugated to polyethylene glycol. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(2): 554–558.

[15] Baba T, Schneewind O. Target cell specificity of a bacteriocin molecule: a C-terminal signal directs lysostaphin to the cell wall of Staphylococcus aureus. EMBO J, 1996, 15(18): 4789.

[16] Hawronskyj JM, Holah J. ATP: a universal hygiene monitor. Trends Food Sci Technol, 1997, 8(3): 79–84.

[17] Champiat D, Matas N, Monfort B, et al. Applications of biochemiluminescence to HACCP. Luminescence, 2001, 16(2): 193–198.

[18] Tang QQ, Ye ZZ, Wang JP, et al. Application of ATP bioluminescence in microbial detection. Food Sci, 2008, 29(6): 460–465 (in Chinese).

唐倩倩, 葉尊忠, 王劍平, 等. ATP生物發(fā)光法在微生物檢驗中的應(yīng)用. 食品科學(xué), 2008, 29(6): 460–465.

[19] Mcelroy WD. Crystalline firefly luciferase: LH2+ ATPLH2-AMP +PPLH2-AMP + O2: L-AMP + light + H2O. Methods Enzymol, 1963, 6: 445–448.

[20] Hao QL, Lü B, Zhou YK, et al. Rapid detection of ATP concentration in cells using bioluminescence method. Acta Med Univer Sci Technol Huazhong, 2005, 34(1): 61–64 (in Chinese).

郝巧玲, 呂斌, 周宜開, 等. 生物發(fā)光法快速檢測細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷. 華中科技大學(xué)學(xué)報: 醫(yī)學(xué)版, 2005, 34(1): 61–64.

[21] Ma N, Zhao H, Zhang X, et al. Rapid determination of colony in food by ATP bioluminescence method. Chin J Public Health Eng, 2008, 7(5): 296–297 (in Chinese).

馬妮, 趙虹, 張旭, 等. ATP發(fā)光技術(shù)快速檢測食品中菌落總數(shù). 中國衛(wèi)生工程學(xué), 2008, 7(5): 296–297.

[22] Stopa PJ, Tieman D, Coon PA, et al. Detection of biological aerosols by luminescence techniques. Field Anal Chem Technol, 1999, 3(4/5): 283–290. [23] Lim DV, Simpson JM, Kearns EA, et al. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare. Clin Microbiol Rev, 2005, 18(4): 583–607.

[24] Li LX, Wu JE, Chang C, et al. The establish of ATP bioluminescent detection technique and the feasibility analysis of its application. Food Sci Technol, 2012, 37(1): 275–279 (in Chinese).

李利霞, 伍金娥, 常超, 等. ATP生物發(fā)光檢測技術(shù)的建立及應(yīng)用可行性分析. 食品科技, 2012, 37(1): 275–279.

[25] de Boer E, Beumer RR. Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms. Int J Food Microbiol, 1999, 50(1): 119–130.

[26] Thumm G, G?tz F. Studies on prolysostaphin processing and characterization of the lysostaphin immunity factor (Lif) of Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus. Mol Microbiol, 1997, 23(6): 1251–1265.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Quantitative specific detection of Staphylococcus aureus based on recombinant lysostaphin and ATP bioluminescence

Yuyuan Li1,2, Zhiqiang Mi2, Xiaoping An2, Yusen Zhou1,2, and Yigang Tong2

1 Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi, China
2 State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China

Quantitative specific detection of Staphylococcus aureus is based on recombinant lysostaphin and ATP bioluminescence. To produce recombinant lysostaphin, the lysostaphin gene was chemically synthesized and inserted it into prokaryotic expression vector pQE30, and the resulting expression plasmid pQE30-Lys was transformed into E. coli M15 for expressing lysostaphin with IPTG induction. The recombinant protein was purified by Ni2+-NTA affinity chromatography. Staphylococcus aureus was detected by the recombinant lysostaphin with ATP bioluminescence, and plate count method. The results of the two methods were compared. The recombinant lysostaphin was successfully expressed, and a method of quantitative specific detection of S. aureus has been established, which showed a significant linear correlation with the colony counting. The detection method developed has good perspective to quantify S. aureus.

Staphylococcus aureus, recombinant lysostaphin, ATP bioluminescence, specific and quantitative detection

November 12, 2013; Accepted: December 17, 2013

Yusen Zhou. E-mail: yszhou@nic.bmi.ac.cn

李玉元, 米志強, 安小平, 等. 基于重組溶葡球菌酶和ATP生物發(fā)光技術(shù)特異定量檢測金黃色葡萄球菌. 生物工程學(xué)報, 2014, 30(8): 1283–1290.

Li YY, Mi ZQ, An XP, et al. Quantitative specific detection of Staphylococcus aureus based on recombinant lysostaphin andATP bioluminescence. Chin J Biotech, 2014, 30(8): 1283–1290.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81072350), China Mega-Project on Major Drug Development (No. 2011ZX09401-023), China Mega-Project on Infectious Disease Prevention (No. 2011ZX10004-001), State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity Program (No. SKLPBS1113).

Yigang Tong. Tel: +86-10-63869835; E-mail: tong.yigang@gmail.com

國家自然科學(xué)基金 (No. 81072350)，“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項“十二五”實施計劃 (No. 2011ZX09401-023)，“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項“十二五”實施計劃 (No. 2011ZX10004-001)，病原微生物生物安全國家重點實驗室開放課題 (No. SKLPBS1113) 資助。

時間：2014-03-10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.130578.html