董博翰，戴廣麗，凌烈鋒，呂 俊，孟 宇

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室,安徽 蕪湖 241002;2.蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院 婦產(chǎn)科,安徽 蕪湖 241000)

樹突狀細(xì)胞疫苗是目前腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域研究較多，并且應(yīng)用前景較好的一類抗腫瘤疫苗。這類疫苗發(fā)揮作用的基本原理是：用腫瘤抗原沖擊活化腫瘤患者自體樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)，然后再將活化后的DC回輸患者體內(nèi)，活化后的DC將腫瘤抗原遞呈給T、NK等免疫細(xì)胞，免疫細(xì)胞被激活后清除腫瘤細(xì)胞[1]。

在DC疫苗制備過(guò)程中，最常用的沖擊活化劑是腫瘤細(xì)胞裂解物(tumor cell lyaste,TCL)。這是因?yàn)門CL中，含有腫瘤細(xì)胞表達(dá)的全部腫瘤特異性抗原(tumoe specific antigen,TSA)和腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen,TAA)，有利于樹突狀細(xì)胞最大限度地呈遞腫瘤抗原[2]。但是，利用TCL活化DC的過(guò)程中，也會(huì)誘導(dǎo)免疫抑制性DC生成，這會(huì)損害樹突狀細(xì)胞疫苗的抗腫瘤作用[3]。常規(guī)DC腫瘤疫苗中既含有具有刺激作用的DC亞群，又含有具有誘導(dǎo)免疫耐受作用的DC 亞群，而后者有可能減弱效應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)TAA 的特異性免疫應(yīng)答的作用[4]。Yang DH等的研究發(fā)現(xiàn)，在骨髓瘤病人使用自體DC疫苗進(jìn)行治療時(shí)，先要在體外使骨髓瘤TCL同DC共孵育。在這一過(guò)程中，TCL會(huì)誘生免疫耐受性DC(Tolergenic DC)。而這種DC亞群回輸?shù)交颊唧w內(nèi)后，會(huì)導(dǎo)致較低的腫瘤緩解率和較短的生存期[5]。

TCL誘生抑制性樹突狀細(xì)胞，同其成分特性有關(guān)。TCL是腫瘤細(xì)胞被人為破裂后形成的混合物，其成分中必然含有一些腫瘤細(xì)胞表達(dá)的免疫抑制物質(zhì)，因此會(huì)對(duì)DC產(chǎn)生抑制作用[6]。而在腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的免疫抑制物中，透明質(zhì)酸(Hyaluronan,HA)具有明確的誘導(dǎo)抑制性DC生成作用。Kung DM等的研究發(fā)現(xiàn)，人白血病Hela細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中含有HA，將其作用于人DC后，DC會(huì)轉(zhuǎn)化成耐受性DC。這種抑制性免疫細(xì)胞可以顯著下調(diào)CD4+ T淋巴細(xì)胞的活性，產(chǎn)生免疫抑制作用[7]。由于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的物質(zhì)，都是腫瘤細(xì)胞合成后分泌的，因此用腫瘤細(xì)胞制備的TCL中，應(yīng)該含有透明質(zhì)酸。

在本研究中我們將檢測(cè)Lewis肺癌細(xì)胞 TCL中HA的存在情況及含量，并在體外提取、培養(yǎng)C57/BL6小鼠DC，然后研究TCL中的HA誘導(dǎo)抑制性小鼠DC生成的作用。以此，為TCL沖擊活化DC過(guò)程的改良打下理論方面的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 TCL利用反復(fù)凍融的方法制備。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。FITC標(biāo)記的抗鼠CD86單克隆抗體、anti-CD44單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)BD公司。HA、IL-10、IL-12檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。LPS購(gòu)于江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)所用的其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用C57/BL6小鼠，雌性，6～8周齡，購(gòu)于南京青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 C57/BL6小鼠來(lái)源的Lewis肺癌細(xì)胞株購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 酶標(biāo)檢測(cè)儀購(gòu)于芬蘭Thermo公司。流式細(xì)胞檢測(cè)儀購(gòu)于美國(guó)密理博公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Lewis肺癌細(xì)胞來(lái)源的TCL的制備 在本研究中我們采用反復(fù)凍融的方法制備Lewis肺癌細(xì)胞來(lái)源的TCL。過(guò)程如下：取Lewis肺癌細(xì)胞溶于生理鹽水中，分別在-80℃和37℃條件下反復(fù)凍融細(xì)胞溶液5次，其中-80℃凍15 min、37℃融5 min，然后用臺(tái)盼藍(lán)染色的方法檢測(cè)細(xì)胞凍融破裂情況。接下來(lái)，用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白釋放，并同細(xì)胞裂解液裂解后的TCL進(jìn)行對(duì)比，以評(píng)估反復(fù)凍融法制備TCL的優(yōu)劣。

1.2.2 C57/BL6小鼠DC的分離、誘導(dǎo)及培養(yǎng) 頸椎脫臼處死小鼠，無(wú)菌取雙側(cè)股骨和脛骨，用自制的GKN緩沖液(NaCl 8 g，KCl 0.4 g，Na2HPO4·2H2O 1.77g，NaH2PO4·2H2O 0.69 g，葡萄糖2 g，酚紅0.01 g，溶于1 L雙蒸水中，以穩(wěn)定懸浮細(xì)胞)沖洗出骨髓，制成細(xì)胞懸液，清洗后1∶10的體積比加入37 ℃預(yù)溫的紅細(xì)胞裂解液,反復(fù)吹打混勻,室溫，2～4 min,加GKN 10 ml終止反應(yīng)，離心洗滌后，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為 2×109/L，接種于6孔培樣板，每孔2 ml，加入細(xì)胞因子mrGM-CSF,IL-4 各20 μg/L隔天半量換液。6 d后,在相差顯微鏡下觀察DC成熟情況，并收集DC，以抗CD86抗體對(duì)樹突狀細(xì)胞進(jìn)行染色，然后利用流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)DC表面CD86細(xì)胞表面分子的表達(dá)情況。

1.2.3 ELISA檢測(cè)TCL中HA含量 取1×106Lewis肺癌細(xì)胞，按上述反復(fù)凍融法制備TCL。然后，用小鼠HA 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒檢測(cè)TCL中的HA。根據(jù)試劑盒中HA標(biāo)準(zhǔn)品在450 nm的吸光值，使用Curve 1.0軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。按標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，查找求得TCL中HA的濃度。

1.2.4 TCL誘導(dǎo)免疫抑制性DC生成 取2只C57/BL6小鼠，分別在體外提取每只小鼠DC，將提取的樹突狀細(xì)胞同制備好的TCL進(jìn)行共孵育，同時(shí)設(shè)立生理鹽水對(duì)照組。每1×105DC同1×106Lewis細(xì)胞制備的TCL共孵育。培養(yǎng)第6天,于細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入LPS,終濃度為200 ng/ml。于DC培養(yǎng)后，第5、6、7、8天收集樹突狀細(xì)胞，用ELISA的方法檢測(cè)上清液中IL-12、IL-10分泌水平。根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞因子分泌量，繪制細(xì)胞因子分泌趨勢(shì)直方圖，分析TCL對(duì)DC分泌細(xì)胞因子的影響。我們用終濃度10 μg/ml的抗CD44抗體(Pep-1)作用于TCL和DC 的共培養(yǎng)孔，并設(shè)立生理鹽水對(duì)照組。然后，按上述時(shí)間點(diǎn)和方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12和IL-10的分泌水平，繪制細(xì)胞因子分泌趨勢(shì)直方圖，分析TCL中HA對(duì)DC分泌細(xì)胞因子的影響。該實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行了2次。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用單因素差異分析法來(lái)進(jìn)行分析。對(duì)于方差齊的兩樣本均數(shù)，采用雙尾t檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行比較。對(duì)于方差不齊的兩樣本均數(shù)，采用秩和檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行比較。當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 以Lewis肺癌細(xì)胞制備出TCL 將1×106Lewis肺癌細(xì)胞，經(jīng)-80℃和37℃反復(fù)凍融處理后，在顯微鏡下我們觀察到：所有的Lewis肺癌細(xì)胞都已經(jīng)失去了正常的細(xì)胞形態(tài)，并被臺(tái)盼藍(lán)溶液藍(lán)染。這說(shuō)明反復(fù)凍融后全部Lewis肺癌細(xì)胞都已經(jīng)死亡，從形態(tài)上看，細(xì)胞已經(jīng)變形、破裂(圖1A)。而SDS-PAGE電泳結(jié)果上可以觀察到彌散的蛋白條帶。這進(jìn)一步說(shuō)明，反復(fù)凍融的處理過(guò)程已經(jīng)使Lewis肺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜完全破裂，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放形成TCL(圖1B)。此外，反復(fù)凍融制備的TCL形成的條帶，明顯深于細(xì)胞裂解液處理制備的TCL形成的條帶。這說(shuō)明反復(fù)凍融法能更好地破裂細(xì)胞、制備TCL。

A：顯微鏡下觀察TCL(200×)；B：聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定TCL。1:化學(xué)裂解法制備的TCL上清液,2:反復(fù)凍融法制備的TCL上清液,3：化學(xué)裂解法制備的TCL全溶液,4:反復(fù)凍融法制備的TCL全溶液

圖1 Lewis肺癌細(xì)胞TCL制備

Fig 1 Preparation of TCL using Lewis lung cancer cells

2.2 提取C57/BL6小鼠DC，于體外細(xì)胞因子誘導(dǎo)其成熟 沖洗C57/BL6小鼠骨髓腔獲得的DC，GM-CSF和IL-4處理6 d后，在顯微鏡下觀察：細(xì)胞呈典型DC形態(tài)，具多形性，貼壁時(shí)有細(xì)長(zhǎng)突起，呈“樹突狀”，懸浮時(shí)向四周伸展出大量毛刺狀胞質(zhì)突起，呈“刺猬狀”，部分伸展為不規(guī)則狀(圖2 A)。將具有該形態(tài)的細(xì)胞收集后進(jìn)行流式檢測(cè)，結(jié)果顯示：同沒(méi)經(jīng)GM-CSF作用的對(duì)照組細(xì)胞相比，呈“樹突狀”或“刺猬狀”的DC表面，CD86表達(dá)明顯上調(diào)，表達(dá)率為61.35%(圖2 B)。這進(jìn)一步說(shuō)明，DC已經(jīng)誘導(dǎo)成熟。

A：顯微鏡下觀察DC形態(tài)(400×)；B：成熟DC的CD86表面分子流式檢測(cè)。B上圖：未加GM-CSF、IL-4處理的DC,B下圖：GM-CSF、IL-4處理6 d后的DC

圖2 小鼠DC的體外培養(yǎng)

Fig 2 Mouse DCs culturedinvitro

2.3 Lewis肺癌細(xì)胞TCL中存在高濃度HA 經(jīng)ELISA檢測(cè)，Lewis肺癌細(xì)胞制備的TCL中確實(shí)存在HA，而制備TCL的溶劑生理鹽水中不含HA。這證明TCL中的HA來(lái)源于Lewis肺癌細(xì)胞本身。經(jīng)過(guò)同鼠源性HA標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)，我們確定TCL中HA的含量為42 mg/ml(圖3)。

A：ELISA檢測(cè)TCL中HA，其中1：NaCl溶液，2～6：不同濃度HA標(biāo)準(zhǔn)品，7：TCL。B：根據(jù)HA標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)OD值繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線及根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的HA含量

圖3 TCL中HA含量檢測(cè)

Fig 3 HA level detected in the TCL

2.4 Lewis肺癌細(xì)胞TCL中HA能誘導(dǎo)抑制性DC生成 將1×106Lewis肺癌細(xì)胞制備的TCL同細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4共同作用于小鼠DC，培養(yǎng)第6天加LPS，于第5、6、7、8天檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子含量，我們發(fā)現(xiàn)：同NaCl對(duì)照組相比，TCL作用后的第7、8天，DC在LPS刺激之下，IL-12的分泌水平顯著減弱(P<0.01)。而DC分泌IL-10的能力則從TCL作用后第5天顯著增強(qiáng)(P<0.01)，并具有時(shí)間依賴性(圖4A)。 而當(dāng)我們用抗HA受體-CD44的單克隆抗體(Pep-1)，抑制HA同CD44的結(jié)合以后，再將TCL作用于DC。此時(shí)，DC的IL-12和IL-10分泌，均在TCL作用后的第7、8天(培養(yǎng)體系中加入LPS后)才出現(xiàn)增加。在各時(shí)間點(diǎn)上，同生理鹽水組相比沒(méi)有差異(P>0.05，圖4B)。

圖4 TCL通過(guò)HA誘生耐受性DC

Fig 4 Immunocompetence of DC activated by HA in the TCL

3 討論

用TCL沖擊活化DC，是DC疫苗制備過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。但TCL成分復(fù)雜，因此在活化DC的同時(shí)也會(huì)誘導(dǎo)抑制性DC產(chǎn)生[8]。究竟是TCL中的哪些物質(zhì)可能誘導(dǎo)抑制性DC生成，目前知之甚少。在本研究中，我們對(duì)TCL中HA對(duì)DC的抑制作用進(jìn)行了探索。

HA是一種細(xì)胞基質(zhì)成分，人肺癌細(xì)胞95D、肝癌細(xì)胞HepG2等9種腫瘤細(xì)胞都能夠表達(dá)HA，并且這些細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的HA可以在體外誘導(dǎo)免疫抑制性的單核巨噬細(xì)胞和DC生成[9]。此外，使用免疫組化的方法，人們也在乳腺癌和胃癌中發(fā)現(xiàn)HA可在癌細(xì)胞原位表達(dá)。因此，沖擊DC所用的TCL中應(yīng)該含有HA[10-11]。

對(duì)于TCL的制備，目前常用的方法有化學(xué)裂解法、紫外照射法等[12]。而本研究采用的是反復(fù)凍融法，該方法能最大限度地使腫瘤細(xì)胞破裂，以釋放細(xì)胞內(nèi)全部成分，并能使細(xì)胞釋放出的內(nèi)容物(蛋白、小分子化合物、核酸等)的分子結(jié)構(gòu)得以維持，不會(huì)受到外來(lái)化學(xué)試劑或者射線的破壞。從我們制備TCL的結(jié)果來(lái)看：反復(fù)凍融法可以使全部Lewis肺癌細(xì)胞發(fā)生死亡破裂。并且，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析可以看出：反復(fù)凍融法TCL中蛋白濃度，大于化學(xué)裂解法TCL中蛋白濃度，這說(shuō)明反復(fù)凍融法能使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)最大限度地釋放。不過(guò)，這樣的結(jié)論需要對(duì)蛋白定量檢測(cè)，才能給予明確驗(yàn)證。

對(duì)于體外培養(yǎng)的DC，在本研究中，我們選擇了C57/BL6小鼠DC。這是因?yàn)橹苽銽CL的Lewis肺癌細(xì)胞是一種來(lái)源于C57/BL6小鼠的細(xì)胞株，只有TCL來(lái)源相同，才符合自體DC疫苗的制備原則。而這種C57/BL6小鼠DC體外誘導(dǎo)培養(yǎng)成功與否，主要依賴于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和DC細(xì)胞表面分子的流式檢測(cè)。其中鏡下觀察DC成熟的依據(jù)是：成熟的DC會(huì)呈半貼壁或者懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)[13]，貼壁DC會(huì)在細(xì)胞邊緣伸出形狀不規(guī)則的“刺狀”突起，而懸浮細(xì)胞則呈圓形，細(xì)胞邊緣有模糊的“毛刺”。本研究中，我們用IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)第6天后的C57/BL6小鼠DC符合這種形態(tài)特點(diǎn)。并且流式檢測(cè)的結(jié)果證明，這些DC細(xì)胞表面的CD86分子，同未經(jīng)細(xì)胞因子處理的細(xì)胞相比，表達(dá)明顯增加。這符合成熟DC的CD86細(xì)胞表面分子會(huì)出現(xiàn)上調(diào)的特點(diǎn)。

我們用ELISA的方法檢測(cè)出，1×106Lewis 肺癌細(xì)胞制備的TCL中HA的含量為42 mg/ml。Kuang DM等人曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)50 μg/ml的HA即可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為抑制性巨噬細(xì)胞。而我們制備的TCL中HA的含量遠(yuǎn)高于這一濃度。這可能同TCL中HA的片段長(zhǎng)度多樣性有關(guān)。腫瘤細(xì)胞可以合成小片段、中等長(zhǎng)度以及高分子量等不同長(zhǎng)度的HA，其中高分子量的HA合成量較大，但只有小片段和中等長(zhǎng)度的HA能誘導(dǎo)抑制性免疫細(xì)胞生成[9]。TCL中盡管HA濃度較高，但絕大多數(shù)都是高分子量HA，小片段和中等長(zhǎng)度的HA的濃度應(yīng)該遠(yuǎn)低于42 mg/ml，但應(yīng)該高于50 μg/ml。而接下來(lái)的研究我們也證明了TCL中是存在可以誘導(dǎo)抑制性免疫細(xì)胞生成的小片段和中等長(zhǎng)度HA的。

當(dāng)我們將TCL同DC一起共孵育培養(yǎng)時(shí)，DC在LPS刺激下分泌IL-12的能力出現(xiàn)了顯著下降，而分泌IL-10的能力則出現(xiàn)了顯著升高。IL-12被認(rèn)為是一種免疫刺激性細(xì)胞因子，IL-10則是公認(rèn)的抑制性細(xì)胞因子。IL-12可以同IL-2一起協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答，IL-10則對(duì)單核細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞具有抑制作用。因此，DC分泌IL-12減少、分泌IL-10增加，是一種典型的DC向免疫抑制性DC轉(zhuǎn)化的表現(xiàn)。當(dāng)用特異性抗體封閉了HA在DC上的受體CD44分子后，DC又重新轉(zhuǎn)變回在LPS刺激下IL-12分泌增加而IL-10分泌減少的狀態(tài)。抑制T細(xì)胞功能的免疫耐受性DC，具有低分泌IL-12、高分泌IL-10的特點(diǎn)[9]。這種轉(zhuǎn)變的發(fā)生可能是TCL中小片段和中等長(zhǎng)度HA在發(fā)揮作用。這種轉(zhuǎn)化不利于TCL更好地沖擊活化DC，也不利于DC回輸機(jī)體后誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的發(fā)生。因此，在制備DC疫苗的過(guò)程中，應(yīng)考慮先去除TCL中的HA，再對(duì)DC進(jìn)行沖擊活化，以提高DC疫苗的抗腫瘤效力。

【參考文獻(xiàn)】

[1] STRIOGA MM1,FELZMANN T,POWELL DJ JR,etal.Therapeutic dendriticcell-based cancer vaccines:the state of the art [J].Crit Rev Immunol,2013,33(6):489-547.

[2] REYES D,SALAZAR L,ESPINOZA E,etal.Tumour cell lysate-loaded dendritic cell vaccine induces biochemical and memory immune response in castration-resistant prostate cancer patients[J].Br J Cancer,2013,109(6):1488-1497.

[3] MAMORU K,HIROSHI T.Intradermal immunization with combined baculovirus and tumor cell lysate induces effective antitumor immunity in mice[J].INTER J OF ONCO,2013,43:2023-2030.

[4] 徐榕，江虹虹，宋海峰.樹突狀細(xì)胞疫苗研究的新策略[J].中國(guó)腫瘤,2011,20(2):92-97.

[5] Yang Deok-Hwon, Park Jung-Sun, Jin Chun-Ji,etal.The dysfunction and abnormal signaling pathway of dendritic cells loaded by tumor antigen can be overcome by neutralizing VEGF in multiple myeloma [J].Leuk Res,2009,33(5):665-670.

[6] 董博翰,戴廣麗,徐蕾，等.MHSP65-TCL抗黑色素瘤疫苗對(duì)免疫細(xì)胞活性的影響 [J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,33(11)：1673-1677.

[7] KUANG Dongming,ZHAO Qiyi,XU Jing,etal.Tumor-Educated Tolerogenic Dendritic Cells Induce CD3 e Down-Regulation and Apoptosis of T Cells through Oxygen-Dependent Pathways[J].J Immunol,2008,181:3089-3098.

[8] JACKSON AM,MULCATHY LA,ZHU Xingwu,etal.Tumor-mediated disruption of dendritic cell function:inhibiting the MEK1/2-p44/42 axis restores IL-12 production and Th1-generation [J].Int J Cancer,2008,123:623-632.

[9] KUANG Dongming,WU Yan,CHEN Nini,etal.Tumor-derived hyaluronan induces formation of immunosuppressive macrophages through transient early activation of monocytes [J].Blood,2007,110:587-595.

[10] ANTTILA MA,TAMMI RH,TAMMI MI,etal.High levels of stromal hyaluronan predict poor disease outcome in epithelial ovarian cancer [J].Cancer Res,2000,60:150-155.

[11] AUVINEN P,TAMMI R,PARKKINEN J,etal.Hyaluronan in peritumoral stroma and malignant cells associates with breast cancer spreading and predicts survival [J].Am J Pathol,2000,156:529-536.

[12] 董博翰.腫瘤細(xì)胞裂解物-結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65的抗肺癌作用[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué),2009.

[13] 趙麗波,李才,周維國(guó).樹突狀細(xì)胞負(fù)載的腫瘤抗原肽疫苗抗腦膠質(zhì)瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究 [J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2009,13(1):21-23.