石少鳳，田德明，黃文斌，懷建國(guó)，王勁松

(1.蕪湖市第一人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科,安徽 蕪湖 241000；2.蕪湖市第一人民醫(yī)院 病理科,安徽 蕪湖 241000；3.南京市第一醫(yī)院 病理科，江蘇 南京 210006)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率雖然低于子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，但病死率卻居?jì)D科惡性腫瘤的首位[1]。大多數(shù)卵巢癌患者出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)已處于進(jìn)展期，而早期卻沒(méi)有特異性臨床診斷標(biāo)記物，因而開(kāi)發(fā)新的卵巢癌診斷標(biāo)記物是早期發(fā)現(xiàn)和診斷卵巢癌的重要措施。人附睪分泌蛋白4(human epididymis protein 4,HE4)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的卵巢癌早期診斷的標(biāo)志物，與CA125聯(lián)合檢測(cè)是提高卵巢癌的診斷率，監(jiān)測(cè)術(shù)后治療效果以及預(yù)測(cè)是否復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)[2-4]。然而，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于HE4與卵巢癌的研究，大多集中于血清學(xué)檢測(cè)，而在卵巢癌組織中的研究相對(duì)較少。本文應(yīng)用免疫組化EnVision法檢測(cè)卵巢上皮性良惡性腫瘤中HE4表達(dá)，探討HE4在卵巢癌中的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 收集蕪湖市第一人民醫(yī)院病理科和南京市第一醫(yī)院病理科2009年1月～2013年9月間經(jīng)病理確診的卵巢良性、交界性和惡性上皮性腫瘤存檔蠟塊共90例。其中卵巢上皮性良性腫瘤20例(漿液性囊腺瘤和黏液性囊腺瘤各10例)、交界性腫瘤15例(漿液性交界性腫瘤10例、黏液性交界性腫瘤5例)和惡性上皮性腫瘤55例(漿液性癌25例、子宮內(nèi)膜樣腺癌15例、透明細(xì)胞癌10例和黏液性腺癌5例)。55例卵巢癌根據(jù)FIGO進(jìn)行臨床分期，其中Ⅰ期28例、Ⅱ期20例、Ⅲ期7例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例。所有病例術(shù)前均未行放療和化療。

1.2 試劑 兔抗人HE4多克隆抗體為英國(guó)Abcam公司產(chǎn)品，抗體稀釋度為1∶40，購(gòu)自廈門(mén)泉輝生物有限公司。EnVision檢測(cè)試劑盒為美國(guó)Dako公司產(chǎn)品，購(gòu)自南京大鳥(niǎo)科技有限公司。DAB顯色液購(gòu)自福建邁新生物公司。

1.3 免疫組織化學(xué)方法 所有標(biāo)本均采用10%中性福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚切片后行免疫組化染色。免疫組化采用EnVision法，切片脫蠟、梯度酒精脫水后，3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性生物素酶，高壓鍋高溫高壓抗原修復(fù)，抗原修復(fù)液為枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)，滴加一抗，4 ℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜；滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封固，鏡下觀察。以附睪組織作為HE4陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷 HE4免疫組化陽(yáng)性表達(dá)為腫瘤上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒狀信號(hào)。HE4陽(yáng)性結(jié)果的評(píng)價(jià)根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比采用二次計(jì)分法進(jìn)行評(píng)分。先根據(jù)HE4陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行打分，即陰性為0分、淡黃色為1分、黃色為2分、棕黃色為3分；然后觀察整個(gè)切片，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行打分，0分為陰性、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分、11%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。上述二者評(píng)分的乘積作為最終積分，積分≤2分為陰性，>2分為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，HE4表達(dá)與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。

2 結(jié)果

2.1 HE4在良性、交界性和惡性卵巢上皮性腫瘤中的表達(dá) HE4陽(yáng)性信號(hào)位于腫瘤性上皮的細(xì)胞質(zhì)(圖1)。由表1可知，HE4在卵巢癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為83.6%(46/55)，明顯高于交界性腫瘤(53.3%，8/15)和良性腫瘤(15.0%，3/20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032；χ2=30.507，P<0.01)。卵巢交界性腫瘤中HE4表達(dá)高于良性腫瘤，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027)。

A：HE4在卵巢良性上皮性腫瘤中表達(dá)陰性；B：HE4在卵巢交界性上皮性腫瘤中表達(dá)陽(yáng)性；C：HE4在卵巢惡性上皮性腫瘤中表達(dá)陽(yáng)性

圖1 HE4在卵巢良性、交界性和惡性上皮性腫瘤中的表達(dá)(Envision×400)

表1 HE4在良性、交界性和惡性上皮性腫瘤中的表達(dá)

2.2 HE4在卵巢上皮性腫瘤中的表達(dá)分布 由表2可知，在卵巢良性和交界性上皮性腫瘤中，HE4僅見(jiàn)于漿液性腫瘤，而黏液性腫瘤均不表達(dá)。卵巢惡性上皮性腫瘤中，HE4主要表達(dá)于卵巢漿液性癌和子宮內(nèi)膜樣癌，而黏液性癌僅1例局灶陽(yáng)性表達(dá)，透明細(xì)胞癌中HE4表達(dá)介于漿液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌與黏液性癌之間。

表2 HE4在卵巢上皮性腫瘤的表達(dá)分布

2.3 卵巢癌中HE4表達(dá)與FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系 隨著卵巢癌FIGO分級(jí)提高，HE4陽(yáng)性表達(dá)率也逐漸增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.104)。HE4在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌中的表達(dá)與不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.585)。卵巢癌中HE4表達(dá)與FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系見(jiàn)表3。

表3 HE4表達(dá)與卵巢癌FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系

臨床病理指標(biāo)例數(shù)HE4表達(dá)+-陽(yáng)性率(%)FIGO分期Ⅰ2821775Ⅱ2018290Ⅲ770100淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有770100無(wú)4839981 3

3 討論

HE4首次在人遠(yuǎn)端附睪上皮中被發(fā)現(xiàn)，最初被預(yù)測(cè)為一種參與精子成熟的蛋白酶抑制因子[5-6]。該基因也稱(chēng)為WFDC2，編碼具有一個(gè)WAP型4二硫鍵核心(WFDC)結(jié)構(gòu)域的蛋白。HE4因與WFDC蛋白家族中已知的白細(xì)胞蛋白酶抑制因子具有同源性和相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄譜，而被認(rèn)為在天然免疫中也具有作用。HE4與卵巢癌的關(guān)系最近得到了較多的研究和重視，與正常卵巢組織相比，HE4在卵巢癌中呈持續(xù)的過(guò)表達(dá)。然而，目前關(guān)于HE4和卵巢癌中的相關(guān)研究大多集中于血清學(xué)方面，而關(guān)于組織中HE4表達(dá)情況的研究較少。

Drapkin等[7]最早對(duì)HE4在卵巢癌及正常卵巢組織中的表達(dá)進(jìn)行了研究，他們研究發(fā)現(xiàn)HE4不表達(dá)于卵巢表面上皮，而表達(dá)于卵巢包涵囊腫，他們同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)在卵巢外其他正常組織中，HE4可表達(dá)于呼吸道上皮，偶爾見(jiàn)于腎近曲小管和涎腺導(dǎo)管上皮，而胃腸道、肝臟、胰腺、脾臟、淋巴結(jié)和間葉組織、乳腺和腦組織中不表達(dá)。在該研究中，作者們還發(fā)現(xiàn)HE4高度表達(dá)于卵巢漿液性腺癌和子宮內(nèi)膜樣腺癌中，而在10例黏液性癌中，僅有1例表達(dá)，透明細(xì)胞癌中HE4表達(dá)介于它們之間。Galgano等[8]應(yīng)用免疫組化結(jié)合組織微陣列技術(shù)研究了HE4在人類(lèi)正常和惡性腫瘤組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示HE4在女性生殖道正常上皮表達(dá)陽(yáng)性，乳腺上皮中不同程度表達(dá)，前列腺、腎小管、支氣管、輸精管、涎腺、淚腺、汗腺、結(jié)腸和胰腺腺泡細(xì)胞可有HE4表達(dá)。在惡性腫瘤中，HE4主要表達(dá)于卵巢漿液性腺癌和子宮內(nèi)膜樣腺癌，而黏液腺癌表達(dá)陰性，在非卵巢惡性腫瘤中，HE4主要見(jiàn)于子宮內(nèi)膜樣腺癌和肺腺癌。我們的研究結(jié)果也顯示，HE4主要表達(dá)于卵巢漿液性癌和子宮內(nèi)膜樣癌，而黏液性腫瘤中僅有1例黏液性癌局灶性表達(dá)，這些研究結(jié)果提示HE4可相對(duì)特異性表達(dá)于卵巢上皮性惡性腫瘤中，可作為診斷卵巢來(lái)源的一個(gè)相對(duì)比較特異性標(biāo)記物。由于漿液性腫瘤和子宮內(nèi)膜樣腺癌均屬于苗勒上皮來(lái)源的腫瘤，我們的研究結(jié)果提示HE4表達(dá)可能是苗勒上皮來(lái)源腫瘤的一個(gè)相對(duì)特異性標(biāo)記物，對(duì)于臨床上手術(shù)無(wú)法切除的卵巢癌患者，小活檢標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞表達(dá)HE4，結(jié)合其他標(biāo)記物可有助于卵巢癌的組織學(xué)分型，從而更好地指導(dǎo)臨床治療。

我們應(yīng)用免疫組化方法研究了HE4在卵巢良性、交界性和惡性腫瘤中的表達(dá)，結(jié)果顯示HE4在卵巢癌中的表達(dá)明顯高于良性和交界性腫瘤，交界性腫瘤高于良性腫瘤，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Georgakopoulos等[9]最近研究發(fā)現(xiàn)HE4高度表達(dá)于惡性卵巢腫瘤和一些良性與交界性卵巢腫瘤中。國(guó)內(nèi)王丹丹等[10]研究結(jié)果顯示HE4在正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤中不表達(dá)或部分表達(dá)，在卵巢癌組織中表達(dá)明顯增高。根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)結(jié)合本文研究結(jié)果，提示HE4在早期卵巢癌中表達(dá)，大量表達(dá)的HE4可能通過(guò)EGFR-MAPK信號(hào)通路的活化而促進(jìn)了卵巢上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[10]。

HE4表達(dá)與卵巢癌臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系研究中，王丹丹等[11]研究發(fā)現(xiàn)早期卵巢癌中HE4表達(dá)高于中晚期，中、低分化卵巢癌高于高分化卵巢癌，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。周留林等[12]研究了卵巢漿液性腫瘤中HE4表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HE4表達(dá)與卵巢漿液性癌臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。郭冰沁等[13]研究結(jié)果也顯示HE4陽(yáng)性表達(dá)隨卵巢癌病理分級(jí)增高而增高，臨床分期越高，其陽(yáng)性表達(dá)率也越高，且有腹腔擴(kuò)散或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者卵巢癌中HE4表達(dá)明顯高于無(wú)腹腔擴(kuò)散和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者。最近周磊等[14]應(yīng)用RNA干擾技術(shù)對(duì)HE4干擾后的卵巢癌細(xì)胞系的生物學(xué)行為進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HE4干擾所致的HE4表達(dá)下調(diào)可降低卵巢癌細(xì)胞的粘附和侵襲能力，這些研究結(jié)果高度提示HE4表達(dá)是卵巢癌具有高度侵襲性行為的一個(gè)標(biāo)志。雖然我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果未能發(fā)現(xiàn)HE4表達(dá)與卵巢癌臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，但我們目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HE4表達(dá)隨著臨床分期增高而增高，一定程度上提示HE4表達(dá)可能反映卵巢癌的臨床生物學(xué)行為，需待以后擴(kuò)大病例數(shù)進(jìn)一步分析研究。

總之，我們的研究結(jié)果顯示HE4主要表達(dá)于卵巢漿液性癌和子宮內(nèi)膜樣癌，且在卵巢惡性上皮性腫瘤表達(dá)明顯高于卵巢交界性和良性上皮性腫瘤，提示HE4不僅是卵巢惡性上皮性腫瘤的一個(gè)診斷標(biāo)記物，還可能是卵巢苗勒管起源的上皮性腫瘤標(biāo)志物。

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