趙莎+龐曉慧+宋經(jīng)元+陳士林

[摘要]為準(zhǔn)確鑒別中藥材合歡皮、合歡花及其混偽品，該研究應(yīng)用ITS2條形碼對(duì)46份藥材及其混偽品進(jìn)行鑒定研究。通過對(duì)樣本進(jìn)行基因組DNA提取，PCR擴(kuò)增和雙向測(cè)序獲得ITS2序列。所得序列經(jīng)CodonCode Aligner 拼接后，基于隱馬爾可夫模型的HMMer 注釋方法去除兩端5.8S 和28S 區(qū)段，用軟件MEGA5.0對(duì)序列進(jìn)行分析比對(duì)，并基于K2P模型進(jìn)行遺傳距離分析。采用相似性搜索法、最近距離法、構(gòu)建NJ樹對(duì)序列鑒定能力進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明，藥材基原物種合歡的ITS2序列種內(nèi)最大K2P遺傳距離均遠(yuǎn)小于其與混偽品的種間最小K2P遺傳距離；應(yīng)用相似性搜索法分析結(jié)果表明ITS2 序列可準(zhǔn)確鑒定合歡藥材及其混偽品；NJ樹顯示合歡藥材與其混偽品可明顯區(qū)分開，表現(xiàn)出良好的單系性。因此，應(yīng)用ITS2條形碼可穩(wěn)定、準(zhǔn)確地鑒別合歡藥材及其混偽品。

[關(guān)鍵詞]合歡皮；合歡花；ITS2；DNA條形碼

合歡皮和合歡花為常用的解郁安神藥，其基原植物均為豆科合歡屬Albizia Durazz.植物合歡Albizia julibrissin Durazz.，分別以皮和花入藥，樹皮入藥為“合歡皮”，花序或花蕾入藥為“合歡花”或“合歡米”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明合歡皮有鎮(zhèn)靜安神、抗生育、抗腫瘤等活性^[1-3]。合歡花有鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁、抑菌、抗氧化等作用^[4-6]。合歡藥材市場(chǎng)需求量較大，在商品藥材中發(fā)現(xiàn)合歡皮、合歡花均存在一定的混偽現(xiàn)象。合歡皮主要的混偽品是山合歡A. kalkora （Roxb.） Prain皮，從各地藥材市場(chǎng)及部分省市藥店中收集的樣品中存在以山合歡皮代替合歡皮的現(xiàn)象。二者親緣關(guān)系較近，藥材性狀極為相似，但2010年版《中國藥典》只把合歡皮作為正品收載，山合歡皮屬于混偽品，古代本草中也沒有山合歡代替合歡藥用的記載^[7]。同時(shí)，秦皮、海桐皮與合歡皮藥材性狀相似^[8-9]，也容易混淆。合歡花的主要混偽品為山合歡花，據(jù)記載，山合歡花在四川地區(qū)作合歡花用^[10]。部分藥材市場(chǎng)存在以北合歡花（南蛇藤果Celastrus orbiculatus Thunb.）作合歡花出售的現(xiàn)象，在廣東等地區(qū)以廣東合歡花[夜香木蘭Magnolia coco （Lour.） DC.]作合歡花藥用，北合歡花、廣東合歡花與合歡花藥材性狀差異大，因藥材名混亂，而造成誤用，需加以糾正。因此，為規(guī)范合歡藥材的使用，保證臨床用藥安全，迫切需要準(zhǔn)確有效的鑒定方法。

DNA條形碼是近年來生物分類和鑒定的研究熱點(diǎn)。陳士林等^[11]首次提出將ITS2 序列作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列。隨后，DNA 條形碼分子鑒定方法在中藥材鑒定方面得到迅速發(fā)展及應(yīng)用。羌活^[12]、秦艽^[13]、人參^[14]、枸杞^[15]、山茱萸^[16]、金銀花^[17]等研究驗(yàn)證了ITS2序列作為DNA 條形碼鑒定中藥材的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。目前，國家藥典委員會(huì)已討論通過在《中國藥典》（2010年版）增補(bǔ)本中納入中藥材DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則。DNA 條形碼具有鑒定簡(jiǎn)單、精確的特點(diǎn)，有明確的判斷標(biāo)準(zhǔn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)中藥材及其基原物種的準(zhǔn)確鑒定^[18]。目前，合歡藥材的鑒定大多采用性狀、顯微、理化等傳統(tǒng)鑒定方法^[19-21]，本研究首次應(yīng)用ITS2 條形碼對(duì)合歡皮、合歡花藥材進(jìn)行鑒定研究，為保障合歡藥材用藥安全有效提供新的技術(shù)手段。

1 材料

本實(shí)驗(yàn)共收集46份合歡藥材樣品及其混偽品，分別為合歡皮藥材樣本11份，合歡花藥材樣本13份，合歡原植物樣本4份，合歡皮復(fù)核樣本1份，山合歡皮樣本9份，山合歡花樣本1份，秦皮樣本3份，海桐皮樣本1份，北合歡花樣本1份，廣東合歡花樣本2份（表1）。樣品經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，憑證樣本保存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所標(biāo)本館。

2 方法

2.1 合歡皮、合歡花藥材DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序 合歡皮刮去外表皮，合歡花剪碎，去除雜質(zhì)，用DNA提取研磨儀（Retsch MM400，德國）研磨2 min（30次/s）后，稱取30～60 mg備用。采用植物基因組 DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取總DNA。擴(kuò)增ITS2序列，正向引物ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；反向引物ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR反應(yīng)體積為25 μL，體系內(nèi)含2×Taq PCR MasterMix（Aidlab Biotechnologies Co.，Ltd）12.5 μL，2.5 μmol·L-1引物各1 μL，模板DNA約20～100 ng，并用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積。 ITS2序列擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，使用ABI 3730XL 測(cè)序儀（Applied Biosystems Co.，USA）進(jìn)行雙向測(cè)序。

2.2 數(shù)據(jù)處理 測(cè)序峰圖利用CodonCode Aligner V 3.7.1（CodonCode Co.，USA）校對(duì)拼接。所得序列基于隱馬爾可夫模型的HMMer 注釋方法去除兩端5.8S 和28S 區(qū)段。將所有序列用軟件MEGA5.0分析比對(duì)，并基于K2P模型進(jìn)行遺傳距離等分析。所得序列采用相似性搜索法（BLAST1）、最近距離法（nearest distance）、構(gòu)建鄰接樹（neighbor-joining tree，NJ Tree）對(duì)序列鑒定能力進(jìn)行評(píng)估。endprint

3 結(jié)果

3.1 合歡皮、合歡花藥材種內(nèi)變異分析 合歡皮和合歡花基原植物均為合歡A. julibrissin，本研究中29份合歡樣本，ITS2 序列只有1個(gè)單倍型，種內(nèi)未發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)，長(zhǎng)度為207 bp，GC含量為 73.4%。

3.2 合歡藥材及其混偽品的種間變異分析 山合歡A. kalkora ITS2 序列只有1個(gè)單倍型，種內(nèi)未發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)，長(zhǎng)度為207 bp，GC含量為73.0%。合歡與山合歡ITS2 序列種間存在4個(gè)變異位點(diǎn)，分別為19位點(diǎn)處G-C變異；26位點(diǎn)處A-C變異；156位點(diǎn)處C-T變異；206位點(diǎn)處C-A變異，兩者種間平均K2P距離為0.020。合歡皮與其混偽品（山合歡皮、秦皮、海桐皮）ITS2序列種間平均K2P距離為0.497。合歡花與其混偽品（山合歡花、北合歡花、廣東合歡花）ITS2序列種間平均K2P距離為0.405（表2）。

3.3 合歡藥材及其混偽品的鑒定 應(yīng)用相似性搜索法進(jìn)行鑒定分析，表明ITS2 序列可準(zhǔn)確鑒定合歡藥材及其混偽品。應(yīng)用最近距離法，合歡皮、合歡花藥材ITS2序列種內(nèi)最大K2P遺傳距離均遠(yuǎn)小于其與混偽品的種間最小K2P遺傳距離，說明應(yīng)用ITS2 序列可準(zhǔn)確鑒定合歡藥材及其混偽品?；贗TS2序列分別構(gòu)建合歡皮、合歡花及其混偽品NJ樹，結(jié)果表明合歡皮、合歡花均各自聚為一支，呈現(xiàn)出明顯的單系性（圖1，2）。因此，基于相似性搜索法、最近距離法、構(gòu)建NJ樹法均可成功鑒別合歡藥材及其混偽品。

4 討論

4.1 合歡藥材DNA提取與PCR擴(kuò)增 中藥材DNA提取是開展中藥材DNA 條形碼研究的首要環(huán)節(jié)^[22]。合歡皮等皮類藥材取樣時(shí)應(yīng)注意刮去表皮，避免污染。另因組織中富含薄壁組織和纖維等，需適當(dāng)增加取樣量，同時(shí)應(yīng)增加β-巰基乙醇和 PVP的使用量^[18]。合歡花藥材采用試劑盒一般都能成功提取其DNA。另外，本研究發(fā)現(xiàn)從合歡藥材中提取的基因組DNA呈彌散狀態(tài)，少數(shù)不可見，但其PCR產(chǎn)物電泳后均可出現(xiàn)條帶，經(jīng)純化后測(cè)序成功，表明ITS2條形碼序列較短，易擴(kuò)增，盡管有些藥材DNA

有所降解，但并不影響該序列的獲得，很適合鑒定中藥材。

4.2 應(yīng)用ITS2條形碼鑒定合歡藥材的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性 辛天怡等^[12]提出DNA條形碼鑒定穩(wěn)定性是指不同產(chǎn)地、不同批次的樣品均能夠穩(wěn)定地獲得DNA條形碼序列。本研究從各地收集的46份樣品均可穩(wěn)定地獲得ITS2序列。29份合歡藥材，各樣品間ITS2序列無變異位點(diǎn)，與GenBank提交的序列比對(duì)未發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)，說明采用ITS2條形碼鑒定合歡藥材具有很好的穩(wěn)定性。通過相似性搜索法、最近距離法、構(gòu)建NJ樹3種方法均可將合歡藥材與其混偽品區(qū)分開，說明應(yīng)用ITS2條形碼鑒定合歡藥材及其混偽品的準(zhǔn)確性較高。

4.3 利用DNA條形碼分子鑒定方法對(duì)商品合歡藥材的監(jiān)測(cè) 利用DNA條形碼分子鑒定對(duì)從各地藥材市場(chǎng)及藥店收集的樣品進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)山合歡代替合歡的現(xiàn)象較常見。本研究應(yīng)用ITS2序列可準(zhǔn)確區(qū)分合歡與山合歡，為合歡藥材及其混偽品的準(zhǔn)確客觀鑒定提供新的技術(shù)手段，有利于藥材市場(chǎng)的監(jiān)測(cè)和管理。從河北安國藥材市場(chǎng)發(fā)現(xiàn)存在在售北合歡花的現(xiàn)象，說明北合歡花充當(dāng)合歡花入藥的現(xiàn)象基本已得到糾正，但仍然少量存在。據(jù)了解廣東省等地區(qū)部分藥店無售合歡花藥材，而是仍采用廣東合歡花入藥。北合歡花、廣東合歡花與正品合歡花的植物來源相差甚遠(yuǎn)，成分有別，故不可混稱合歡花藥用^[21]，建議規(guī)范藥材名稱，認(rèn)真鑒別，保證臨床用藥安全。

4.4 中藥材DNA 條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫 DNA條形碼是利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、相對(duì)較短的DNA片段來進(jìn)行物種鑒定的分子診斷新技術(shù)，是近年來生物分類和鑒定的研究熱點(diǎn)^[23]。陳士林等^[24]指出DNA 條形碼鑒定具有三大優(yōu)勢(shì)：鑒定結(jié)果可重復(fù)性良好；方法通用性強(qiáng)；可構(gòu)建統(tǒng)一數(shù)據(jù)庫和鑒定平臺(tái)，易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化。DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫的可靠性是中藥材DNA條形碼鑒定的關(guān)鍵。目前已有的公共數(shù)據(jù)庫，如GenBank，由世界各地的研究者進(jìn)行獨(dú)立提交，缺乏相互之間的驗(yàn)證，數(shù)據(jù)質(zhì)量參差不齊，數(shù)據(jù)的系統(tǒng)性和代表性尚顯不足，影響了中藥材鑒定的準(zhǔn)確性。因此，開發(fā)建立中藥材DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫和鑒定網(wǎng)站是非常必要的。目前，陳士林團(tuán)隊(duì)在對(duì)條形碼序列制定嚴(yán)格校對(duì)機(jī)制的基礎(chǔ)上，整合課題組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和部分GenBank數(shù)據(jù)，建立了中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（http：//www.tcmbarcode.cn），可在該數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用 BLAST1方法進(jìn)行中藥材鑒定，將大大加快中藥鑒定標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)程。

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Identification of Albiziae Cortex，Albiziae Flos and their adulterants

using ITS2 barcoding

ZHAO Sha1，PANG Xiao-hui2，SONG Jing-yuan2，CHEN Shi-lin1，3*

（1. School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China；

2.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，

Beijing 100193，China；

3. Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）

[Abstract] The ITS2 barcode was used to accurately identify Albiziae Cortex，Albiziae Flos and their adulterants in this study. A total of 46 samples from Albiziae Cortex，Albiziae Flos and their adulterants were collected. The ITS2 regions were amplified and sequenced. Sequences were assembled using the CodonCode Aligner. The genetic distances of ITS2 region were calculated using MEGA 5.0. BLAST1，nearest distance and phylogenetic tree （NJ-tree） methods were used to assess the identification efficiency of the ITS2 barcode. The results revealed that the intraspecific genetic distances of Albizia julibrissin were lower than the interspecific genetic distances between A. julibrissin and its adulterants. The identification efficiency of ITS2 barcode using BLAST1 was 100%. The NJ-tree showed that A. julibrissin and their adulterants can be easily differentiated according to their monophyly. The ITS2 barcode is suitable to be as a barcode to identify Albiziae Cortex，Albiziae Flos and their adulterants.

[Key words] Albiziae Cortex；Albiziae Flos；ITS2；DNA barcoding

doi：10.4268/cjcmm20141203endprint