任雅君+屈會(huì)化+成金俊+賀娜娜+馮盛嵐+趙靈靈+趙琰+王慶國

[摘要] 基于高特異性，高靈敏度的小分子單克隆抗體的免疫分析方法的建立，對中藥小分子化合物的的研究具有重要的意義，其中，小分子人工抗原的合成是中藥小分子抗體制備的關(guān)鍵步驟。采用高碘酸鈉氧化法分別合成連翹苷免疫抗原（FRn-BSA）和包被抗原（FRn-OVA），通過紫外光譜和薄層色譜法檢測到連翹苷成功與BSA/OVA偶聯(lián)，小鼠經(jīng)FRn-BSA免疫后，體內(nèi)可產(chǎn)生抗連翹苷抗體，效價(jià)在1∶8 000左右，線性范圍為1～100 mg·L^-1。成功合成的連翹苷人工抗原，可為下一步的單克隆抗體制備以及相應(yīng)免疫方法的建立奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 連翹苷；人工抗原；高碘酸鈉氧化法；免疫分析方法；抗連翹苷抗體

連翹苷是一種屬于雙環(huán)氧木脂素類化合物的葡萄糖苷，是連翹藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)之一，具有抗炎解熱^[1]，抗氧化^[2-4]，降血脂^[5]，保肝^[6]及神經(jīng)保護(hù)^[7]等多種藥理活性。目前連翹苷的檢測方法主要為HPLC，RP-HPLC^[8]，近紅外光譜法^[9]等，其中以HPLC為主。這些方法存在樣品前處理復(fù)雜等問題，當(dāng)待測樣品含量很低，或者樣本量很大時(shí)具有局限性，特別是進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究時(shí)難以滿足需要。而基于小分子單克隆抗體的中藥活性成分免疫學(xué)分析方法，靈敏度高，特異性強(qiáng)，前處理簡單，高通量，且不依賴貴重儀器，操作也較為簡便^[10-11]。因此得到越來越多的關(guān)注。為建立連翹苷免疫學(xué)分析方法，本研究首先對連翹苷的人工完全抗原進(jìn)行了合成與鑒定，并分析其免疫原性。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級健康雄性BALB/c小鼠5只，6～8周齡，維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證SCXK-（京） 2007-004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)（No. 0029729）。

1.2 試劑

連翹苷（FRn，批號(hào)943110753）購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，95%（HPLC）；牛血清白蛋白（BSA，批號(hào)29180102100），美國Roche公司；卵清蛋白（OVA，批號(hào)115K0730）購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；NaIO4（批號(hào)F20080314）分析純，國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司；弗式完全佐劑（F5881，批號(hào)SL11432），Sigma公司；弗式不完全佐劑（F5506，批號(hào)SL12282），Sigma公司；酶標(biāo)二抗（HRP-標(biāo)記羊抗鼠IgG），Gene-Script公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）；碳酸鹽緩沖液（CBS，pH 9.6，0.05 mmol·L^-1）；洗滌緩沖液（PBST，pH 7.4）；終止液（2 mmol·L^-1H2SO4 ）；底物緩沖液（pH 5.0 磷酸檸檬酸）。

1.3 儀器

96孔酶標(biāo)板，Corning；紫外-可見分光光度計(jì)，Beckman coulter DU 800；酶標(biāo)儀，Tecan Safire2全波長多功能酶標(biāo)儀；84-1A磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司。

2 方法

2.1 連翹苷人工抗原的合成

參照本實(shí)驗(yàn)室以往經(jīng)驗(yàn)^[12-14]，采用高碘酸鈉法，將連翹苷分別與BSA偶聯(lián)成人工免疫原，與OVA偶聯(lián)成包被原。具體方法如下：準(zhǔn)確稱取連翹苷5.0 mg充分溶于1 mL 20%甲醇中，NaIO4 8.0 mg充分溶于1 mL蒸餾水中，將二者混合，密封并用錫箔紙包裹避光，室溫下攪拌反應(yīng)1.5 h，得到連翹苷的氧化產(chǎn)物，成為A液。用0.1 mol·L^-1Na2CO3（pH 9.6）調(diào)pH至9.0以上。準(zhǔn)確稱取BSA/OVA各10.0 mg分別充分溶于1 mL CBS中，成為B液。然后將A液逐滴加入B液中，用0.1 mol·L^-1Na2CO3（pH 9.6）再次調(diào)pH至9.0以上，封閉并避光，室溫下攪拌6 h或過夜。待上述反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至用蒸餾水預(yù)處理的透析袋中，攪拌下用蒸餾水透析72 h，中間多次換液。透析后的產(chǎn)物分裝，于-20 ℃保存待用。

2.2 連翹苷人工抗原的鑒定

2.2.1 紫外掃描法 用蒸餾水精確配制適宜濃度的FRn與BSA，OVA標(biāo)準(zhǔn)溶液，將待測樣品用蒸餾水稀釋到適宜濃度，用紫外分光光度計(jì)測出FRn，BSA，F(xiàn)Rn-BSA，F(xiàn)Rn-OVA，OVA的全波長圖譜。

2.2.2 薄層色譜法 按2010年版《中國藥典》方法進(jìn)行。用蒸餾水配制適宜濃度的FRn，BSA，OVA標(biāo)準(zhǔn)溶液，將待測樣品FRn-BSA和FRn-OVA用蒸餾水稀釋到適宜濃度。將標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測樣品分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（8∶1）為展開劑，展開后晾干，噴以10%硫酸-乙醇溶液，加熱到108 ℃顯色。

2.2.3 動(dòng)物免疫 用FRn-BSA免疫原以背部皮下多點(diǎn)注射免疫的方法免疫5只雄性BALB/c小鼠。初次免疫用等量的弗式完全佐劑充分乳化，免疫劑量為100 μg/只，以后每14 d左右加強(qiáng)免疫1次，改用弗式不完全佐劑乳化抗原，免疫劑量不變。從第3次加強(qiáng)免疫開始后每7 d斷尾取血，之后5 000 r·min-1，離心10 min分離血清，分別編號(hào)為1～5。

2.2.4 ELISA法測定血清中的抗體效價(jià) 以FRn-OVA作為包被原，用CBS稀釋至1∶1 000，每孔加100 μL，37 ℃孵育2 h。以PBST洗板，每次5 min，共3次，然后拍干。以10 g·L^-1明膠為封閉液，每孔加200 μL，37 ℃孵育1 h。洗板?？寡逑♂尡稊?shù)為1 000，2 000，4 000，8 000，16 000，32 000，64 000，128 000倍。以未免疫空白小鼠的血清作為陰性對照，37 ℃孵育1h，洗板。每孔加入100 μL HRP-羊抗鼠二抗（1∶10 000），37 ℃孵育0.5 h，洗板。每孔加入TMB使用液100 μL，37 ℃孵育顯色15 min后每孔加2 mmol·L^-1硫酸50 μL終止反應(yīng)，測定吸光度A450 nm。以同一稀釋倍數(shù)下抗血清（P）與陰性血清（N）A450 nm比值（P/N）大于2.1時(shí)血清的最大稀釋度定為抗體效價(jià)。endprint