馬曉沖+姚輝+鄔蘭+向麗+陳曉辰+宋經(jīng)元

[摘要]通過分析木香、川木香、土木香、青木香、紅木香藥材的ITS2 （internal transcribed spacer 2）條形碼序列，探討木香類藥材鑒定新方法。對60份樣品提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增ITS2序列并進(jìn)行雙向測序，所得序列經(jīng)CodonCode Aligner拼接后，采用 MEGA5.0 軟件進(jìn)行序列比對，計(jì)算種內(nèi)和種間遺傳距離（K2P），構(gòu)建鄰接樹（neighbor-joing tree，NJ Tree）。結(jié)果表明，無論是菊科的木香、川木香、土木香，還是馬兜鈴科的青木香和五味子科的紅木香，ITS2序列種內(nèi)變異均小于種間變異，ITS2序列所有單倍型比對后長度為272 bp，變異位點(diǎn)達(dá)到162個；遺傳距離顯示物種種內(nèi)平均K2P遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于種間平均K2P；NJ樹結(jié)果顯示木香、川木香、土木香、青木香和紅木香藥材可明顯區(qū)分，且能鑒別川木香的2個基原物種。因此，ITS2序列可用于鑒定木香、川木香、土木香、青木香、紅木香藥材，為臨床安全用藥提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]DNA條形碼；物種鑒定；ITS2 序列；菊科；馬兜鈴科；五味子科

木香、川木香、土木香、青木香、紅木香5種木香類藥材由于藥材外形、氣味、功效相似或者存在同名異物或同物異名等原因容易混淆，造成鑒定困難，但是這5種木香藥材來源于不同的基原植物，木香Aucklandiae Radix為菊科Asteraceae植物木香Aucklandia lappa Decne.的干燥根，又稱為廣木香或云木香；川木香Vladimiriae Radix為菊科植物川木香Vladimiria souliei （Franch.） Ling、灰毛川木香V. souliei （Franch.） Ling var. cinerea Ling的干燥根；土木香Inulae Radix為菊科植物土木香Inula helenium Ling.的干燥根，又稱為青木香或祁木香；青木香Aristolochiae Radix為馬兜鈴科Aristolochiaceae植物馬兜鈴Aristolochia debilis Sieb.et Zucc.的干燥根；紅木香Kadsurae Radix為五味子科Schisandraceae植物南五味子Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep.的干燥根，又稱土木香^[1-3]。

木香類藥材用藥歷史悠久，但5種木香類藥材出現(xiàn)混用、替代，造成市場上木香類藥材混亂。木香是常用藥材，從梁代開始經(jīng)廣州進(jìn)口的舶來品，稱廣木香，因其質(zhì)量較優(yōu)，逐漸成為主流品種。后在云南引種成功，稱云木香，是現(xiàn)存木香藥材的主流品種^[4]，具有行氣止痛、健脾消食的功效 [1]?，F(xiàn)代藥理研究表明木香對消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)以及多種腫瘤細(xì)胞有確切的療效^[5-9]。川木香是原產(chǎn)我國的道地藥材，主產(chǎn)于四川西部，曾是木香的代用品和地方習(xí)用品^[3-4]。川木香藥材的功效與木香相似但側(cè)重不同，藥典中單獨(dú)收載，應(yīng)區(qū)別應(yīng)用。但是川木香、灰毛川木香與木香主要有效成分均為去氫木香內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯，研究表明三者的指紋圖譜，氣相色譜相似度很高^[10-13]，不易區(qū)分。Shum等^[14]也通過GS-MS分析木香、川木香和灰毛川木香等物種揮發(fā)油成分，聚類分析表明可以區(qū)分木香與混偽品，但檢測方法復(fù)雜，且無法區(qū)分川木香和灰毛川木香。土木香也曾作為木香的代用品^[3-4]，土木香與木香的化學(xué)成分差異較大，其主要藥效成分為土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯，具有健脾和胃、行氣止痛、安胎的功效^[1]，現(xiàn)已取代馬兜鈴科青木香。2010年版《中國藥典》僅收載木香、川木香、土木香3種木香類藥材，其他的木香類藥材已不予收載。青木香起始作為木香代用品種出現(xiàn)^[4]，但現(xiàn)代研究表明馬兜鈴科植物中含有馬兜鈴酸，能引起腎毒性不良反應(yīng)^[15-16]，已于2004年取消青木香藥品標(biāo)準(zhǔn)，凡中成藥處方中含有青木香的藥材將用土木香I. helenium L.干燥根代替。紅木香是木香的混淆品，性味功能與木香差異大，性溫、味辛，有行氣、活血、止痛的功效^[3]。總的來說，木香類藥材原始品種、地方習(xí)用品、代用品和混淆品種類繁多，情況復(fù)雜，通過傳統(tǒng)方法鑒定或化學(xué)成分檢測不能很好的進(jìn)行區(qū)分，不利于木香類藥材規(guī)范化安全用藥，需要尋找一種快速、準(zhǔn)確的分子鑒定方法，以確保臨床安全用藥。

DNA條形碼技術(shù)具有較強(qiáng)通用性，作為物種鑒定新手段，倍受國內(nèi)外研究者關(guān)注^[17-23]，目前，DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則已經(jīng)獲準(zhǔn)納入《中國藥典》2010年增補(bǔ)本^[24]。Chen等^[25]提出ITS2 序列可以作為標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼鑒別藥用植物及其近緣物種。ITS2片段具有適合擴(kuò)增和測序的長度，在物種水平的變異較快，有更多的突變位點(diǎn)以區(qū)分不同的物種，因此，在DNA條形碼鑒定物種方面具有潛在的研究價值。Yao等^[26]基于大樣本量分析證實(shí)ITS2 序列可以作為植物物種鑒別的通用條形碼。本文應(yīng)用ITS2序列對5種木香藥材進(jìn)行鑒定，為臨床安全用藥提供依據(jù)。

1 材料

木香藥材樣品（根）來源于云南、四川、西藏，包括藥材市場購買、藥店購買、野生采挖共20份；葉片樣品1份，來源于云南。川木香藥材樣品（根）6份，灰毛川木香藥材樣品（根）16份，來源于主產(chǎn)區(qū)四川，包括野生采挖、藥材市場購買；川木香葉片樣品1份，來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所1961年標(biāo)本，灰毛川木香葉片樣品1份，來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所1974年標(biāo)本；土木香藥材樣品（根）11份，來源于西藏，包括藥材市場購買、野生采挖；葉片樣品1份，來源于河南南陽。馬兜鈴藥材樣品（根）2份，來源于江西；葉片樣品1份，來源于四川成都；木香3條ITS2序列，南五味子3條ITS2序列均由GenBank 下載的ITS 序列剪切而來。研究樣本經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員和成都中醫(yī)藥大學(xué)國錦林教授鑒定，憑證標(biāo)本保存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所。實(shí)驗(yàn)材料詳見表1。endprint

2 方法

木香、川木香、土木香和馬兜鈴的干燥根均用75%乙醇擦拭藥材表面后，刮去外表皮，取根的內(nèi)部約45 mg，用DNA 提取研磨儀 （Retsch MM400，Germany） 研磨2 min（30 次/s） 后，水浴56 ℃8～12 h。利用植物基因組DNA提取試劑盒 （Tiangen Biotech Co.，China） 提取總DNA。提取過程中，氯仿-異戊醇（24∶1）抽提2次，沉淀DNA步驟時，用-20 ℃預(yù)冷的異丙醇沉淀DNA ，搖勻，放入-20 ℃冰箱冷凍30 min，用50 μL水洗脫。葉片的DNA提取方法完全按照Chen等^[25]研究的方法。PCR 擴(kuò)增、測序引物正向ITS2F為5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向ITS3R為5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′^[25]。 PCR 反應(yīng)體積為25 μL，體系內(nèi)包含PCRmix 12.5 μL，2.5 μmol·L-1引物各1 μL，模板DNA 約 20～100 ng。擴(kuò)增程序： 94 ℃變性5 min；再進(jìn)行40個循環(huán) （94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s）；最后72 ℃延伸10 min^[25]。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，使用ABI3730XL 測序儀進(jìn)行雙向測序。測序峰圖利用CodonCode Aligner V 3.7.1（CodonCode Co.，USA） 校對拼接，去除引物區(qū)。對拼接后得到的序列采用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段即可獲得ITS2間隔區(qū)序列^[27]。然后，將所有序列用軟件MEGA5.0分析比對^[28]，并基于K2P 模型進(jìn)行遺傳距離等分析，用鄰接 （NJ） 法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，利用bootstrap（1 000次重復(fù)）檢驗(yàn)各分支的支持率。

3 結(jié)果

3.1 木香、川木香、土木香、青木香、紅木香種內(nèi)種間序列特征分析

3.1.1 種內(nèi)變異分析 木香、川木香、灰毛川木香、土木香、馬兜鈴、南五味子ITS2序列比對后的長度，GC含量平均值和變異位點(diǎn)個數(shù)等信息見表2。木香種內(nèi)不同來源樣品21條ITS2序列長度均為223 bp，分為2個單倍型（表1），單倍型A1包含18條ITS2序列，與3條GenBank序列相同，單倍型A2序列包含2條，在195位點(diǎn)有C-G變異。川木香種內(nèi)7條ITS2序列長度為223 bp，分為2個單倍型（表1），其中單倍型B1序列包含2條，在8位點(diǎn)有C-T變異，162位點(diǎn)有A-G變異。灰毛川木香17條ITS2序列比對后長度為223 bp，僅有1個單倍型，無變異位點(diǎn)。土木香12條序列比對后長度為228 bp，無變異位點(diǎn)，GC含量在6個物種中最低。馬兜鈴3條ITS2序列比對后長度為264 bp，分為2個單倍型（表1），單倍型E1包含1條，單倍型E2序列2條，在47位點(diǎn)有T-A變異，GC含量最高達(dá)到78%。南五味子JF976709和JF976710序列相同，JF976712在109位點(diǎn)有G-A變異。

3.1.2 種間變異分析 木香、川木香、灰毛川木香、土木香、馬兜鈴、南五味子種間ITS2序列兩兩比對后的長度和變異位點(diǎn)個數(shù)見表3。木香與其他木香ITS2序列比對長度范圍為223～264 bp，變異位點(diǎn)范圍為13～104個，與川木香和灰毛川木香差異小，與馬兜鈴差異最大。川木香和灰毛川木香序列比對后，變異位點(diǎn)為2個，種間差異最小。土木香與馬兜鈴種間差異最大，變異位點(diǎn)達(dá)到115個。木香、川木香、土木香、青木香、紅木香ITS2序列比對長度272 bp，變異位點(diǎn)162個，見圖1。

3.2 木香、川木香、土木香、青木香、紅木香種內(nèi)種間遺傳距離分析

3.2.1 種內(nèi)遺傳距離分析 基于K2P模型計(jì)算遺傳距離，ITS2序列種內(nèi)種間平均K2P距離見表4。木香ITS2序列種內(nèi)平均K2P距離為0.001，種內(nèi)最大K2P距離為0.004；川木香ITS2序列種內(nèi)平均K2P距離為0.004，種內(nèi)最大K2P距離為0.009；灰毛川木香和土木香種內(nèi)K2P距離為0；馬兜鈴3條ITS2序列種內(nèi)平均K2P距離為0.003，種內(nèi)最大K2P距離為0.004；南五味子種內(nèi)平均K2P距離為0.003，種內(nèi)最大K2P距離為0.004。

3.2.2 種間遺傳距離分析 木香與其他木香藥材ITS2序列種間平均K2P距離為0.176，種間最小K2P距離為0.047，大于種內(nèi)最大K2P距離；土木香與其他木香藥材ITS2序列種間平均K2P距離為0.298，種間最小K2P距離為0.247，大于種內(nèi)最大K2P距離；馬兜鈴和南五味子與其他木香藥材ITS2序列種間平均K2P距離分別為0.748，0.705；川木香和灰毛川木香與其他木香藥材ITS2序列種間平均K2P距離分別為0.134，0.158，而川木香和灰毛川木香種間K2P距離為0.005，小于種內(nèi)最大距離。

3.3 木香、川木香、土木香、青木香、紅木香鄰接樹（NJ樹）鑒定

為了更直觀的顯示鑒定結(jié)果，本文基于ITS2序列構(gòu)建了木香、川木香、灰毛川木香、土木香、南五味子和馬兜鈴NJ樹，見圖2，結(jié)果表明木香與土木香，馬兜鈴和南五味子各自聚為一支。川木香和灰毛川木香形成1個獨(dú)立支，川木香聚在2個小枝上，與灰毛川木香區(qū)分開，因此ITS2作為條形碼可準(zhǔn)確區(qū)分木香、川木香、灰毛川木香、土木香、南五味子和馬兜鈴。

4 討論

ITS2條形碼序列能夠準(zhǔn)確且穩(wěn)定的鑒定木香、川木香、土木香、青木香、紅木香藥材?；贗TS2條形碼序列構(gòu)建的NJ樹和種內(nèi)種間遺傳距離分析，首次證實(shí)ITS2條形碼序列能夠準(zhǔn)確的鑒定并區(qū)分5種木香藥材，同時也能準(zhǔn)確的區(qū)分川木香的2個基原植物。Chen等^[29]利用分子技術(shù)鑒定木香與相關(guān)物種，但所使用是非通用引物，有一定局限性，不適宜推廣，而DNA條形碼是利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、相對較短的DNA片段來進(jìn)行物種鑒定，該方法易于統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)化，是中藥分子鑒定方法學(xué)上的創(chuàng)新^[23]。川木香和灰毛川木香是菊科同屬植物，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定通過葉片背部絨毛區(qū)分，對于商品藥材鑒定就更加困難，Shum等^[14]也利用GS-MS聚類分析川木香和灰毛川木香的揮發(fā)油成分，結(jié)果顯示未區(qū)分開。本文中利用ITS2條形碼序列對川木香和灰毛川木香進(jìn)行鑒定，為二者的鑒定提供新的方法和依據(jù)。endprint

另外，本研究證實(shí)ITS2序列作為鑒定木香類藥材有很好的穩(wěn)定性。對木香、川木香、灰毛川木香、土木香、馬兜鈴和南五味子6個物種種內(nèi)變異分析表明，6個物種ITS2序列種內(nèi)平均K2P距離均較小，種內(nèi)遺傳變異小。從木香、川木香、灰毛川木香和土木香基原葉片獲得ITS2條形碼序列的單倍型與藥材獲得的單倍型一致。從木香藥材獲得的單倍型與GenBank提交的木香ITS2序列比對后，發(fā)現(xiàn)本研究采集的木香藥材DNA條形碼單倍型全部涵蓋GenBank提交序列。

本研究中川木香葉片樣本為1961年標(biāo)本，灰毛川木香葉片樣本為1974年標(biāo)本，采用葉片提取方法進(jìn)行DNA提取，盡管年代久遠(yuǎn)，DNA降解嚴(yán)重，但I(xiàn)TS2條形碼具有序列長度短和鑒定效率高的特點(diǎn)，仍能穩(wěn)定獲得ITS2條形碼序列，證實(shí)ITS2序列在鑒定年代久遠(yuǎn)的標(biāo)本上具有明顯的優(yōu)勢。

木香、川木香、灰毛川木香和土木香藥材中的化學(xué)成分主要為揮發(fā)油，多糖和酚類含量少，所以在DNA提取中較為容易，主要注意以下幾點(diǎn)：①由于這4種木香的藥用部位是根部，根部的DNA含量比較少，尤其是儲存時間長的商品藥材，其DNA含量降解嚴(yán)重，所以需要適當(dāng)?shù)募哟笕恿?，以達(dá)到PCR擴(kuò)增的DNA濃度，在本研究中經(jīng)過多次篩選發(fā)現(xiàn)取樣量約45 mg的效果較好；②適當(dāng)?shù)难娱L水浴時間，有利于細(xì)胞裂解，DNA溶出，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)56 ℃水浴8～12 h效果較好；③沉淀DNA步驟時，用-20 ℃預(yù)冷的異丙醇沉淀DNA，搖勻，放入-20 ℃冰箱冷凍30 min，使DNA能夠充分的沉淀；④注意真菌污染的問題，由于ITS2 片段在植物和真菌中廣泛存在，若藥材表面被真菌污染，在PCR 時會存在將真菌的ITS2序列擴(kuò)增出來的可能性。木香類藥材是以根入藥，與土壤中的真菌接觸，需要進(jìn)行清潔并削去外皮，取內(nèi)部組織。另外，為了考察獲得序列的正確性，作者將序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對顯示序列均為正確序列，不存在真菌污染。

在植物的ITS2條形碼序列中，種內(nèi)變異廣泛存在，不同植物ITS2序列中種內(nèi)遺傳變異的豐富程度不同，例如在蓼科植物唐古特大黃的ITS2片段中存在豐富的種內(nèi)遺傳變異^[30]，而五加科植物人參的ITS2序列中僅存在1種單倍型^[31]。Song等^[31]研究表明盡管植物ITS2序列中種內(nèi)變異頻繁，但在大多數(shù)情況下，ITS2序列的主要變異能夠準(zhǔn)確鑒定物種。為驗(yàn)證文中建立的基于ITS2 條形碼序列鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性，特從北京某藥店購買木香、川木香和土木香藥材，每種藥材隨機(jī)取2個樣本，由分類學(xué)家初步鑒定藥材正確，然后基于本研究建立的方法成功提取DNA，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)木香的2份樣本均為木香，ITS2序列類型為A1；土木香的2份樣本均為土木香，ITS2序列類型為D1；川木香的2份樣本為灰毛川木香，ITS2序列類型為C1。本研究不僅解決了不具備分類背景知識的操作人員鑒定難題，也解決了傳統(tǒng)鑒定和化學(xué)鑒定對木香類藥材鑒定中的困難，并能準(zhǔn)確鑒定到物種，使木香類藥材鑒別方法簡便易行，為臨床安全用藥提供可靠依據(jù)。

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Molecular identification of Aucklandiae Radix，Vladimiriae Radix，

Inulae Radix，Aristolochiae Radix and Kadsurae

Radix using ITS2 barcode

MA Xiao-chong1，YAO Hui1，WU Lan2，XIANG Li2，CHEN Xiao-chen1，SONG Jing-yuan1*

（1.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Unionendprint

Medical College，Beijing 100193，China；

2. Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）

[Abstract] In order to identify Aucklandiae Radix，Vladimiriae Radix，Inulae Radix，Aristolochiae Radix and Kadsurae Radix using ITS2 barcodes，genomic DNA from sixty samples was extracted and the ITS2 （internal transcribed spacer） regions were amplified and sequenced. The genetic distances were computed using MEGA 5.0 in accordance with the kimura 2-parameter （K2P） model and the neighbor-joining （NJ） phylogenetic tree was constructed. The results indicated that for Aucklandiae Radix （Aucklandia lappa），Vladimiriae Radix （Vladimiria souliei and V. souliei var. cinerea），Inulae Radix （Inula helenium），Aristolochiae Radix （Aristolochia debilis） and Kadsurae Radix （Kadsura longipedunculata），the intra-specific variation was smaller than inter-specific one. There are 162 variable sites among 272 bp after alignment of all ITS2 sequence haplotypes. For each species，the intra-specific genetic distances were also smaller than inter-specific one. Furthermore，the NJ tree strongly supported that Aucklandiae Radix，Vladimiriae Radix，Inulae Radix，Aristolochiae Radix and Kadsurae Radix can be differentiated. At the same time，V. souliei （Dolomiaea souliei） and V. souliei var. cinerea（D. souliei var. cinerea） belonging to Vladimiriae Radix were clearly identified. In conclusion，ITS2 barcode could be used to identify Aucklandiae Radix，Vladimiriae Radix，Inulae Radix，Aristolochiae Radix and Kadsurae Radix. Our study may provide a scientific foundation for clinical safe use of the traditional Chinese medicines.

[Key words] DNA barcoding； species identification； ITS2； Asteraceae； Aristolochiaceae； Schisandraceae

doi：10.4268/cjcmm20141204endprint