石林春+姚輝+謝麗芳+朱英杰+宋經(jīng)元+張輝+陳士林

[摘要]課題組聯(lián)合相關(guān)研究者開展動物藥材DNA條形碼分子鑒定研究，并結(jié)合分析GenBank序列，采用BLAST分析防錯、系統(tǒng)樹分析防錯和Barcoding Gap檢驗(yàn)防錯等方法核驗(yàn)序列的可靠性，構(gòu)建了中國動物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。該庫由樣品數(shù)據(jù)庫、序列數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫組成，包含800余種動物藥材和大量動物藥材混偽品及密切相關(guān)物種。中國動物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫可以通過中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（www.tcmbarcode.cn）進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)訪問并實(shí)現(xiàn)未知動物樣本的DNA條形碼鑒定。該研究首次構(gòu)建統(tǒng)一的中國動物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，對動物藥材鑒定、資源可持續(xù)利用和瀕危物種保護(hù)均有重要意義。

[關(guān)鍵詞]動物藥材；數(shù)據(jù)庫；COI；鑒定

DNA條形碼技術(shù)是動物藥材鑒定的新工具^[1]，國家藥典委員會已討論通過在《中國藥典》增補(bǔ)本中列入中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則^[2]。本課題組聯(lián)合相關(guān)研究者開展了大量的動物藥材DNA條形碼分子鑒定研究工作。鄢丹等對包含羚羊角、鹿角的傳統(tǒng)角類藥材進(jìn)行DNA條形碼研究^[3]，并以此為基礎(chǔ)提出了瀕危動物藥材的貿(mào)易監(jiān)控和替代品尋找策略^[4]。張輝等對《中國藥典》45種動物藥材及其混偽品進(jìn)行DNA條形碼研究，結(jié)果表明45種動物藥材的正品來源與其混偽品均可相互區(qū)分^[5]。崔麗娜等利用COI序列對金錢白花蛇及其常見混偽品進(jìn)行DNA條形碼鑒別研究，結(jié)果表明，金錢白花蛇COI序列可以明確地與混偽品區(qū)分開^[6]。胡嶸等對海馬、海龍及其混偽品共14個(gè)種20份樣品的COI條形碼序列進(jìn)行研究，結(jié)果表明運(yùn)用COI序列能夠準(zhǔn)確鑒定海馬、海龍的基原動物及其混偽品^[7]。此外，還開展了龜甲、鱉甲、鹿茸以及蛤殼等的DNA條形碼研究工作^[8-11]。動物DNA條形碼分子鑒定研究工作的大量開展，為構(gòu)建中國動物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫奠定了基礎(chǔ)。

DNA條形碼數(shù)據(jù)庫不僅是存儲樣品信息和DNA條形碼序列的工具，而且是DNA條形碼研究和物種鑒定分析的生物信息學(xué)平臺，對推動DNA條形碼研究發(fā)展具有重要意義^[12]。第一個(gè)國際DNA條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)（BOLD）由國際生命條形碼聯(lián)盟（CBOL）于2007年建立^[13]。此外，國際上還有多個(gè)針對特定動物類群的條形碼數(shù)據(jù)庫，如：Fish Barcode of Life Campaign （FISH-BOL，http：//www.fishbol.org/），Lepidoptera Barcode of Life（http：//lepbarcoding.org/），Mammalia Barcode of Life Campaign（http：//www.mammaliabol.org/）。此外，邵鵬柱等初步構(gòu)建了傳統(tǒng)藥物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫（http：//137.189.42.34/mherbsdb/），包含1 661個(gè)物種，36 679條序列^[14]。當(dāng)前，我國尚未構(gòu)建統(tǒng)一的動物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，制約了DNA條形碼技術(shù)在動物藥材鑒定、資源可持續(xù)利用和瀕危物種保護(hù)中的進(jìn)一步應(yīng)用。

1 材料

中國動物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫中的序列來自于課題組聯(lián)合相關(guān)研究者所開展的動物藥材DNA條形碼分子鑒定研究及GenBank，包含800余種動物藥材和大量動物藥材混偽品及密切相關(guān)物種（表1）。

2 方法

對包含測序峰圖的樣品，根據(jù)Q值進(jìn)行單堿基和序列質(zhì)量檢測。對不包含測序峰圖的樣品，使用EMBOSS Transeq將核酸序列翻譯為蛋白序列，利用隱馬爾可夫模型（hidden Markov model，HMM）進(jìn)行COI條形碼區(qū)域核驗(yàn)^[13]。采用BLAST分析防錯、系統(tǒng)樹分析防錯和Barcoding Gap檢驗(yàn)防錯等核驗(yàn)COI序列的可靠性^[2]，使用Muscle 3.8 進(jìn)行多序列比對^[15]，使用Paup 4.0進(jìn)行遺傳距離計(jì)算^[16]，使用MEGA 6.0構(gòu)建NJ（鄰接法）系統(tǒng)聚類樹^[17]。使用BLAST方法進(jìn)行物種鑒定分析，使用MySQL進(jìn)行數(shù)據(jù)庫管理，通過MySQLdb連接MySQL數(shù)據(jù)庫。

3 結(jié)果與討論

3.1 數(shù)據(jù)庫構(gòu)成 中國動物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫由樣品數(shù)據(jù)庫、序列數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫構(gòu)成。樣品數(shù)據(jù)庫包含完整的樣品采集和鑒定信息，即：樣品編號、分類信息、憑證信息、采集者、采集地、鑒定者、1張到數(shù)張樣品及生境照片等。從GenBank中下載GB格式文件，利用BioPython進(jìn)行解析。僅保留物種分類地位清晰，拉丁名不包含“sp.”，“spp.”等字符的Record。提取Record注釋中基因名稱為“COI”或“CO₁”區(qū)域的序列，如Record來自于已發(fā)表的文獻(xiàn)，收集該文獻(xiàn)的PubMed ID、題目、作者、期刊、摘要等信息構(gòu)成文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫。此外，文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫還包含本課題組聯(lián)合相關(guān)研究者所開展的動物藥材DNA條形碼分子鑒定研究文獻(xiàn)。中國動物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫包含2010年版《中國藥典》^[18]和《中國藥用動物志》（第2版）^[19]所載800余種動物藥材和大量動物藥材的混偽品和密切相關(guān)物種的COI序列。此外，中國動物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫還包含樣品采集、樣品處理、DNA提取、PCR 擴(kuò)增、測序、序列拼接及結(jié)果判定等的標(biāo)準(zhǔn)操作方法和技術(shù)流程（圖1）。

3.2 數(shù)據(jù)庫動態(tài)管理 中國動物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫每6個(gè)月更新1次。新增加樣品如包含測序峰圖，則依照中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則去除測序峰圖兩端的低質(zhì)量區(qū)域^[2]，即：以20 bp的窗口分別從序列5′端和3′端進(jìn)行滑動，如果窗口內(nèi)有多于2個(gè)堿基的Q值<20，則刪除1個(gè)堿基，窗口繼續(xù)滑動1個(gè)堿基；如果窗口內(nèi)堿基Q值小于20的數(shù)目≤2，窗口停止滑動。測序峰圖的剩余部分須≥300 bp，平均Q值≥30。拼接結(jié)果長度須大于500 bp，Q值小于20的堿基數(shù)須≤1%，平均Q值須≥40。新增加樣品如不包含測序峰圖，使用EMBOSS Transeq將新增加COI序列翻譯為蛋白序列，使用隱馬爾可夫模型進(jìn)行COI條形碼區(qū)域核驗(yàn)，序列中COI條形碼區(qū)域的長度須≥500 bp，且Ns≤1%。最后將序列與已有參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，去除可能的外源污染，例如螨蟲、人等的COI序列。endprint