吳繼周， 王 燕, 韓海霞

(1新疆博爾塔拉蒙古自治州藥品檢驗(yàn)所， 新疆 博樂 833400； 2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院藥學(xué)部， 烏魯木齊 830001；3新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院， 烏魯木齊 830052)

四季三黃片是由大黃、黃芩、黃柏、梔子經(jīng)加工制成的復(fù)方制劑,具有消炎退熱、通便利水的功效，用于口鼻生瘡、咽痛齒痛、口干舌燥、目眩頭暈、大便秘結(jié)、小便赤黃等，本品收載于《國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)》標(biāo)準(zhǔn)編號為YBZ05432006[1]。方中黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血活血、安胎的功效。近年來發(fā)現(xiàn)黃芩根提取物具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛、抗氧化以及清除氧自由基、治療心血管疾病等作用[2]；黃芩苷為黃芩中的活性物質(zhì)，現(xiàn)行藥品標(biāo)準(zhǔn)中僅對方中大黃的有效成分大黃酸和大黃酚進(jìn)行定量分析，沒有黃芩苷的含量控制指標(biāo)，難以保證藥品的內(nèi)在質(zhì)量。本研究參照《中國藥典》(2010年版)測定黃芩藥材中黃芩苷含量的方法和文獻(xiàn)[3-10]，應(yīng)用高效液相色譜法測定四季三黃片中黃芩苷的含量。

1 儀器與試藥

1.1儀器日本島津高效液相色譜儀(LC-20AT一元泵，SPD-20A紫外檢測器)，AS20500A超聲波清洗器，METTLER AE240型電子分析天平。

1.2試藥四季三黃片 (江西華太藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號070202、070545、070705)，黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢驗(yàn)所，批號110715-200514)，梔子(新疆博州藥品檢驗(yàn)所)，大黃(新疆博州藥材公司)，黃柏(新疆博州藥材公司)。乙腈：色譜純(美國Fair Lawn.New Jersey)，水為純化水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：0.2%磷酸溶液-乙腈(78∶22)；檢測波長為276 nm，柱溫22℃，流速為1.0 mL/min。

2.2溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對照品適量，加甲醇制成1 L含0.030 3 mg的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 本品研勻后，取0.25 g精密稱定，置于100 mL量瓶中，加70%乙醇適量，經(jīng)超聲處理20 min后加70%乙醇至刻度定容，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 大黃粉碎成細(xì)粉；取梔子5 g，加水煎煮，煎液濃縮成稠膏；黃柏用60%乙醇滲漉，收集滲漉液，濃縮成稠膏；將梔子稠膏、黃柏稠膏與大黃粉末混勻至粘稠狀，精密稱定0.243 3 g，放入100 mL量瓶中，加70%乙醇適量，經(jīng)超聲處理20 min后加70%乙醇至刻度定容，即得。

2.3線性關(guān)系的考察精密吸取對照品溶液1、5、10、15、20、30 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=4×106X-5 279.7，r=0.999 9，結(jié)果表明黃芩苷進(jìn)樣量與峰面積在0.030 3～0.909 0 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4陰性對照試驗(yàn)精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各5 μL進(jìn)樣測定，結(jié)果陰性對照溶液在與黃芩苷對照品相對應(yīng)的保留時間位置上未見有吸收峰，說明本品中除黃芩苷以外的藥物大黃、黃柏、梔子對含量測定無干擾,見圖1～3。

圖1 陰性對照溶液HPLC色譜圖

圖2 供試品溶液HPLC色譜圖(22號峰為黃芩苷)

圖3 對照品溶液HPLC色譜圖(C 5號峰為黃芩苷)

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣5μL測定黃芩苷峰面積，結(jié)果RSD=0.44%(n=6)，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6精密度試驗(yàn)精密吸取黃芩苷對照品溶液5μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定黃芩苷的峰面積，結(jié)果峰面積分別為527 146、531 648、527 163、526 076、529 921，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.44%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)取供試品溶液6份，進(jìn)樣量為5μL，同法測定,其RSD為0.52%，表明重現(xiàn)性良好。

2.8回收率試驗(yàn)取本品適量，研細(xì)，精密稱取9份，每份約0.104g，分3組分別加入適量對照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備并測定，結(jié)果平均回收率為99.08%，RSD=0.99%,見表1。

表1 黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.9樣品測定取3個批號的供試品溶液各3份，分別進(jìn)樣3次，測定色譜峰面積，結(jié)果3批三黃四季片中黃芩苷的平均含量分別為15.8、23.5、14.9 mg/g。

3 結(jié)論

黃芩苷為淡黃色細(xì)針晶，相關(guān)提取方法有水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等。通過反復(fù)變換提取溶劑的實(shí)驗(yàn)，得出用70%乙醇提取黃芩苷的效果比較好，故用70%乙醇做提取溶劑。

關(guān)于黃芩苷的色譜條件，文獻(xiàn)報道較多，運(yùn)用較多的是2%磷酸∶乙腈(72∶8)，但對于四季三黃片中黃芩苷的分離不太好，有雜峰，所以沒有選用此比例。研究曾選用磷酸-水-乙腈多種不同梯度濃度做流動相，得到2%磷酸-乙腈(78∶22)組成的流動相在波長為276 nm波長處得到的峰分離度好,分離時間適宜，而且該系統(tǒng)溶劑也適合黃芩苷藥材及其各種炮制品的質(zhì)量分析。

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