王世霞 朱余兵

高效液相色譜-熒光檢測法測定人血漿中洛美沙星的濃度

王世霞 朱余兵

目的建立用高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLU)測定人血漿中洛美沙星的濃度。方法血漿樣品經(jīng)甲醇沉淀后, 以甲醇-磷酸二氫鉀緩沖液(pH：2.8, 35：65, v/v)為流動相, 流速為1.0 ml/min, 色譜柱為BaiAn-C18(4.6×150 mm, 5 μm), 柱溫為25℃, 熒光檢測波長λex=280 nm, λem =455 nm。結果血漿內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾待測物測定, 洛美沙星在0.10~10.04 μg/ml有良好線性關系(r=0.9995), 定量下限為0.10 μg/ml, 日內(nèi)、日間精密度(RSD)均小于10 %, 樣品穩(wěn)定性良好。結論該法靈敏、快速、簡便, 適合用于洛美沙星的藥動學研究。

洛美沙星；血藥濃度；高效液相色譜-熒光檢測法

洛美沙星(lomefloxacin, LM)是喹諾酮類第三代二氟喹諾酮類抗菌藥, 作用于細菌的DNA回旋酶, 使DNA不能形成超螺旋, 造成染色體的不可逆損害, 而使細菌細胞不再分裂。臨床應用廣泛, 用于泌尿系統(tǒng)感染、性病的治療、外科感染、呼吸道感染、風濕病并發(fā)感染及眼科感染性疾病的治療等［1］。目前, 文獻［2, 3］報道中可以測定人體膽汁、尿液、血漿中洛美沙星的含量, 作者在文獻［3-5］的基礎上, 建立了用HPLC法測定血漿中洛美沙星濃度的方法。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 美國Agilent 1100系列高效液相色譜儀(配備二元高壓泵, 在線真空脫氣機, 自動進樣器及其溫控系統(tǒng), 半微量池可變紫外檢測器和熒光檢測器, Agilent高級化學色譜數(shù)據(jù)工作站), METTLER電子天平。洛美沙星標準品(批號：0452-200001, 購自中國藥品生物制品檢定所, 含量90.0%)。甲醇(色譜純, TEDIA)；超純水為自制；空白人血漿(南京市中心血站提供)；其他試劑為分析純。

1.2色譜條件 色譜柱：BaiAn-C18, 5 μm, 4.6×150 mm , 流動相： 甲醇：磷酸二氫鉀緩沖液(pH：2.8, 35：65, v/v), 流速：1.0 ml/min , 柱溫：25℃, 熒光檢測器檢測(λex=280 nm, λem=455 nm)。

1.3標準溶液的配置 精密稱取洛美沙星標準品5.57 mg (相當于洛美沙星5.01 mg), 置于10 ml量瓶中, 加入流動相溶解并稀釋至刻度, 搖勻, 即501.00 μg/ml 洛美沙星的儲備液。精密吸取儲備液1 ml置于10 ml量瓶中, 加入流動相稀釋至刻度, 搖勻, 即得 50.10 μg/ml洛美沙星甲醇溶液；依次稀釋,配成5.01 μg/ml洛美沙星標準溶液。

1.4含藥標準血樣的制備 取離心管數(shù)支, 分別精密加入不同量的洛美沙星標準液后以氮氣流吹干, 加入空白血漿0.20 ml, 渦旋1 min, 配成血漿中含洛美沙星分別為0, 0.10, 0.20, 0.50, 1.00, 2.01, 5.01, 10.04 μg/ml的標準系列濃度, 同法依次配成血漿中含洛美沙星分別為0.20, 1.00, 8.02 μg/ml的低、中、高質(zhì)控血樣。

1.5血漿樣品的處理 精密加入含藥血漿樣品0.20 ml于離心管中, 加入0.60 ml甲醇, 渦旋3 min, 于16000 rpm離心3 min。吸取上清液置于自動進樣分析小瓶中, 精密取10 μl進樣分析。

2 方法與結果

2.1專屬性及線性范圍 洛美沙星出峰時間在6.5 min左右,洛美沙星峰形良好, 無干擾, 基線平穩(wěn), 見圖1。將系列濃度標準含藥血漿樣品, 按“血漿樣品的處理”項操作, 每種濃度5份樣品, 記錄色譜圖及洛美沙星峰面積。以洛美沙星峰面積f對血藥濃度(c)作回歸計算, 得回歸方程：f=0.0229×c+0.0031, (r=0.9995, 權重系數(shù)r=1/c×c), 定量下限濃度為0.10 μg/ml。

圖1 血漿中洛美沙星色譜圖

2.2回收率及精密度 取離心管數(shù)支, 分別取洛美沙星標準液適量于離心管中, 用流動相配成濃度分別為0.20, 1.00, 8.02 μg/ml的洛美沙星溶液, 每份0.20 ml, 以氮氣流吹干后,精密加入0.60 ml甲醇溶解殘渣, 精密吸取10 μl進樣分析,記錄色譜圖, 計峰面積As；另取離心管數(shù)支, 精密加入適量的洛美沙星溶液, 以氮氣流吹干后, 精密加入0.20 ml空白血漿, 渦旋15 s, 配成含洛美沙星0.20, 1.00, 8.02 μg/ml的含藥血漿, 混勻, 加入0.60 ml甲醇, 渦旋3 min, 于16000 rpm離心3 min, 吸取10 μl上清液進樣分析。記錄色譜圖, 計峰面積Ax, 上述Ax和As的比值即為洛美沙星的絕對回收率。將前述標準曲線質(zhì)控樣品系列濃度的洛美沙星峰面積代入相應標準曲線方程, 計算測得濃度和加入濃度的比值即為相對回收率, 同法可算出日內(nèi)、日間RSD, 結果見表1。

表1 血漿中洛美沙星絕對回收率和相對回收率 (%)

表1 血漿中洛美沙星絕對回收率和相對回收率 (%)

加入濃度(μg/ml)絕對回收率RSD相對回收率RSD日內(nèi)RSD日間RSD 0.2082.8±8.29.8103.4 ±4.64.56.97.2 1.0083.0±5.26.3109.7±4.74.35.25.7 8.0288.3±1.11.4103.0±4.24.15.95.9

2.3穩(wěn)定性試驗 取干凈離心管數(shù)支, 按標準曲線配制方法制備含洛美沙星0.20, 1.00, 8.02 μg/ml的標準含藥血漿, 平行制備5份, 一份配制好后按“血漿樣品的處理”項操作后,立即進樣分析；一份血樣室溫放置4 h后提取操作；一份提取后于4 ℃自動進樣器放置10 h；一份于冰箱中冷凍保存3周后取出化凍；另一份在3周內(nèi)反復凍融3次, 然后同法操作。各濃度樣本測定值的RSD均<10 %, 結果表明樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好。

3 討論

由于洛美沙星溶液具有光不穩(wěn)定性, 經(jīng)反復試驗考察光對洛美沙星溶液的影響, 證實標準液、血漿中洛美沙星見光后都顯著發(fā)生分解。故在洛美沙星血樣采集、處理、存放及測定的全過程中, 都應注意避光, 否則將導致測定結果偏低。

目前洛美沙星血藥濃度測定方法多采用HPLC法, 其檢測器包括紫外檢測器、熒光檢測器和二極管陣列檢測器［2-5］。作者采用HPLC-FLU方法測定洛美沙星血藥濃度, 其定量下限為0.10 μg/ml, 可滿足藥動學和藥效學實驗需要。同時考慮樣品穩(wěn)定性和靈敏度, 確定用甲醇-磷酸二氫鉀緩沖液(pH：2.8, 35：65, v/v)作為流動相, 在此條件下, 洛美沙星峰形良好,無雜質(zhì)干擾測定, 基線平穩(wěn)。作者建立的HPLC-FLU方法出峰時間在6.5 min, 相較于既往HPLC方法, 樣品分析時間短,適合大樣本量的測試。同時文獻［6］中采用液液萃取法處理血樣, 內(nèi)標法測定洛美沙星血藥濃度, 過程較繁瑣, 經(jīng)優(yōu)化后采用甲醇沉淀血樣, 外標法測定洛美沙星血藥濃度, 操作簡便、快速、準確度高, 且回收率及精密度結果均較好。

［1］ 董春峽, 胡鳳鑾, 林潔.洛美沙星的藥理作用、臨床應用和不良反應.齊魯藥事, 2004, 23(7):38-39.

［2］ 陳畫虹, 韓麗萍, 張延軍, 等.反相HPLC法測定膽汁中洛美沙星的濃度.廣東藥學院學報, 2002, 18(4):302-304.

［3］ 楊健, 杜繼昭, 王其南, 等.國產(chǎn)洛美沙星膠囊的人體藥物動力學.中國醫(yī)院藥學雜志, 2000, 20(3):133-135.

［4］ 郭善斌, 肇麗梅, 邱楓, 等.鹽酸洛美沙星分散片及膠囊劑的健康人體藥動學.沈陽藥科大學學報, 2003, 20(6):413-415.

［5］ 郎麗萍, 于麗均.反相高效液相色譜法測定人血清中洛美沙星濃度.溫州醫(yī)學院學報, 2005, 35(3):240-241.

［6］ 顧繼紅, 高杰.反相高效液相色譜熒光法測定人血漿中左氧氟沙星的濃度.蘇州大學學報(醫(yī)學版), 2007, 27(6):952-954.

Measure of concentration of lomefloxacin in human plasma by high performance liquid chromatographyfluorescence assay

WANG Shi-xia, ZHU Yu-bing.Liu’an Yeji District Central Hospital, Liu’an 237431, China

ObjectiveTo apply high performance liquid chromatography-fluorescence assay (HPLCFLU) in measuring concentration of lomefloxacin in human plasma.MethodsPlasma samples were precipitated by methanol.Methanol-monopotassium phosphate buffer solution (pH: 2.8, 35:65, v/v) was applied as mobile phase, and its flow velocity was 1.0 ml/min, chromatographic column was BaiAn-C18(4.6×150 mm, 5 μm), column temperature was 25℃, and Fluorescence detection wavelength was λex=280nm and λem=455nm.ResultsThe intrinsic impurity of plasma did not interfere with the measurement of determinand.Linearity of lomefloxacin was good at 0.10~10.04 μg/ml (r=0.9995), and the lower limit of quantitation was 0.10 μg/ml.The day-to-day and within-day relative standard deviation (RSD) were all less than 10%.ConclusionThis measure method is fast, sensitive, and simple, which can be applied to the pharmacokinetic study of lomefloxacin.

Lomefloxacin; Plasma concentration; High performance liquid chromatography-fluorescence assay

2014-05-28］

237431 安徽省六安市葉集區(qū)中心衛(wèi)生院(王世霞)；南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院藥學部(朱余兵)

朱余兵