吳艷清，張 映，王 穎

(保定學(xué)院生化系，河北 保定 071000)

致病疫霉是鞭毛菌亞門卵菌綱霜霉目卵菌，生理分化明顯，可引起番茄和馬鈴薯的晚疫病，是嚴(yán)重危害農(nóng)作物生長(zhǎng)的重要植物病原微生物［1］。目前在生產(chǎn)中除利用有限的抗病品種外，主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥來(lái)防治晚疫病，但化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用已導(dǎo)致致病疫霉抗藥性逐漸增強(qiáng)、環(huán)境污染日益嚴(yán)重。而利用拮抗微生物控制該病具有無(wú)污染、不易使有害生物產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，使許多學(xué)者對(duì)拮抗微生物的研究有更多的注意。

放線菌是一類主要呈菌絲狀生長(zhǎng)和以孢子繁殖的陸生性較強(qiáng)的原核生物。放線菌廣泛地分布在含水量較低、有機(jī)物較豐富和呈微堿性的土壤中。已有研究表明放線菌能夠生產(chǎn)出許多重要的活性物質(zhì)，已經(jīng)從放線菌的次生代謝產(chǎn)物中篩選出許多新的生化藥物［2］，從土壤中篩選出對(duì)致病疫霉抑制作用明顯的放線菌是研究的一大方向。

研究表明，有些學(xué)者已經(jīng)篩選出一些對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有顯著抑制作用的拮抗真菌、放線菌和細(xì)菌［4］。本實(shí)驗(yàn)從土壤中分離純化出拮抗致病疫霉的放線菌，并研究其發(fā)酵液對(duì)致病疫霉的抑制作用。為今后開(kāi)發(fā)田間有效控制馬鈴薯晚疫病的高效、穩(wěn)定的生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)，對(duì)馬鈴薯晚疫病的有效控制也具有重要的指導(dǎo)意義和參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 使用儀器

JA2002電子天平(上海精天電子儀器有限公司);SW－CJ－2F凈化工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);BXW－30R立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);LRH－250G光照培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠);LRH－250A生化培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠);HH－S數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠);電熱鼓風(fēng)干燥器(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);IS－RDD3恒溫振蕩器(泰山市鑫達(dá)氣彈簧有限公司)

1.1.2 試劑

試劑:黑麥、可溶性淀粉、75%酒精、蔗糖、瓊脂、無(wú)菌水、KNO3、NaCl、K2HPO4、MgSO4、FeSO4。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 供試材料

試驗(yàn)采用ST－1菌株從土壤中篩選，致病疫霉由河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物病理研究室惠贈(zèng)。

1.2.2 供試培養(yǎng)基配方

本實(shí)驗(yàn)用到了三種培養(yǎng)基:

高氏 I號(hào)培養(yǎng)基:可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，F(xiàn)eSO40.01g，瓊脂 20g，水1000mL，pH7.2 －7.4。

高氏 I號(hào)液體培養(yǎng)基:可溶性淀粉 20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，F(xiàn)e-SO40.01g，水 1000mL，pH7.2 －7.4。

黑麥培養(yǎng)基:黑麥65g，瓊脂16g，蔗糖20g，水1000mL。

1.3 方法步驟

1.3.1 放線菌ST－1的分離純化

從石家莊深澤縣采集土樣，自然風(fēng)干后稱取10g土樣放入盛有90ml無(wú)菌水三角瓶中，振蕩20min，用移液管吸取1ml加入盛有9ml無(wú)菌水的試管中制成10－1土壤稀釋液，以此類推制成 10－2、10－3、10－4、10－5、10－6幾個(gè)梯度的土壤懸浮液。利用稀釋涂布平板法涂布在高氏I號(hào)培養(yǎng)基上對(duì)放線菌進(jìn)行分離純化，將分離純化的放線菌在28℃光照培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)5－7天，利用顯微鏡觀察菌落的形態(tài)、色澤、有無(wú)氣生菌絲、色素產(chǎn)生情況等初步鑒定為放線菌［1－3］，并對(duì)分離出的一株放線菌編號(hào)為ST－1。在高氏I號(hào)培養(yǎng)基上對(duì)ST－1菌株進(jìn)行純化，將純化的ST－1菌株放在4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ST－1菌株對(duì)致病疫霉抑制作用測(cè)定

進(jìn)一步篩選不同DPPC與甘露醇質(zhì)量比（1∶1、1∶2、1∶3）的白藜蘆醇DPPC脂質(zhì)粉霧劑處方，通過(guò)對(duì)外觀、流動(dòng)性和載藥量綜合比較，選擇甘露醇與DPPC質(zhì)量比為2∶1，作為粉霧劑最優(yōu)處方（圖2）。

利用對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定。將活化好的致病疫霉用滅菌后的打孔器打取直徑13mm的菌餅并接種于黑麥培養(yǎng)基中央，將活化好的ST－1菌株用滅菌后的打孔器打取直徑9mm的菌餅并接種于致病疫霉菌餅兩側(cè)，使兩個(gè)ST－1菌株分別與致病疫霉菌株相距15mm。重復(fù)三次。以空白的致病疫霉菌餅為對(duì)照，做三組對(duì)照。20℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)6－8天，觀察致病疫霉的生長(zhǎng)情況，并計(jì)算抑菌率。

圖1:ST－1菌株對(duì)致病疫霉抑制效果

抑菌率(%)=(對(duì)照菌落半徑－處理菌落半徑)/對(duì)照菌落半徑*100

1.3.3 ST－1菌株發(fā)酵液對(duì)致病疫霉抑制作用的測(cè)定

制備ST－1菌株發(fā)酵液。將ST－1菌株單一菌落放入高氏I號(hào)液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)6－8天，用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾得到ST－1菌株發(fā)酵液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用濾紙片法測(cè)定ST－1菌株發(fā)酵液對(duì)致病疫霉抑制作用。用滅菌后的打孔器在活化的致病疫霉上打孔并接種于黑麥培養(yǎng)基平板中央，在致病疫霉菌餅左右各相距15mm對(duì)稱放置1片無(wú)菌濾紙片，并滴加20微升ST－1菌株發(fā)酵液，重復(fù)三次，再做三組空白試驗(yàn)作為對(duì)照試驗(yàn)，20℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察抑菌效果，根據(jù)抑菌結(jié)果計(jì)算抑菌率。

1.3.4 處理后的ST－1菌株發(fā)酵液對(duì)致病疫霉抑制作用的測(cè)定

處理后的ST－1菌株發(fā)酵液的制備。將ST－1菌株單一菌落放入高氏I號(hào)液體培養(yǎng)基中，再向其液體培養(yǎng)基中挑入少量致病疫霉菌絲，振蕩培養(yǎng)6－8天，用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾得到處理后的ST－1菌株發(fā)酵液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用濾紙片法測(cè)定。用滅菌后的打孔器在活化的致病疫霉上打孔并接種于黑麥培養(yǎng)基平板中央，在致病疫霉菌試驗(yàn)，20℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察抑菌效果，根據(jù)抑菌結(jié)果計(jì)算抑菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 ST－1菌株對(duì)致病疫霉抑制作用的測(cè)定結(jié)果

表1:ST－1菌株對(duì)致病疫霉抑制作用結(jié)果

2.2 ST－1菌株發(fā)酵液對(duì)致病疫霉抑制作用的測(cè)定結(jié)果

將ST－1菌株發(fā)酵液與致病疫霉對(duì)峙培養(yǎng)8－10天，結(jié)果如圖2所示，ST－1菌株的發(fā)酵液對(duì)致病疫霉沒(méi)有明顯的抑制作用。

圖2:ST－1菌株發(fā)酵液對(duì)致病疫霉的抑制效果

2.3 處理后的ST－1菌株發(fā)酵液對(duì)致病疫霉抑制作用的測(cè)定結(jié)果

將加有少量致病疫霉菌絲的放線菌菌液過(guò)濾得到的發(fā)酵液與致病疫霉對(duì)峙培養(yǎng)8－10天后，結(jié)果如圖3、表2所示，處理后的發(fā)酵液對(duì)致病疫霉有明顯的抑制作用，抑菌率達(dá)到了30.08%。發(fā)酵液的抑菌率明顯小于菌株的抑菌率。

圖3:ST－1菌株被刺激后對(duì)致病疫霉的抑制效果(第10天)

表2:ST－1菌株被刺激后對(duì)致病疫霉的抑制效果(第10天)

3 結(jié)論

放線菌作為一種開(kāi)發(fā)微生物藥物潛力最大的微生物資源之一，已從土壤中分離純化出許多拮抗放線菌，如放線菌NB8菌株［5］，其活體對(duì)致病疫霉抑制率為 97.33%，發(fā)酵液對(duì)致病疫霉抑制率為92.00%，而且其抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性比較強(qiáng)，受環(huán)境的影響比較小，傳代10代后抑菌性質(zhì)還基本保持穩(wěn)定?？梢?jiàn)拮抗放線菌有很大的應(yīng)用潛力。

本研究著重測(cè)定放線菌ST－1對(duì)病致病疫霉的抑制作用，結(jié)果表明ST－1菌株對(duì)致病疫霉有明顯的抑制作用，抑菌率達(dá)到了72.14%。而ST－1放線菌發(fā)酵液在與致病疫霉對(duì)峙培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)致病疫霉卻沒(méi)有明顯的抑制作用，其原因可能是受到了致病疫霉本身或其代謝產(chǎn)物的刺激，才產(chǎn)生了對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)有抑制作用的物質(zhì)，進(jìn)而本研究有測(cè)定加有少量致病疫霉菌絲的ST－1菌株的發(fā)酵液，結(jié)果表明，其發(fā)酵液對(duì)致病疫霉有一定的抑制作用，抑菌率為30.08%，由此可以看出對(duì)有致病疫霉抑制作用的抑制物質(zhì)的產(chǎn)生與致病疫霉的刺激有關(guān)系。未受到致病疫霉刺激的ST－1菌株的發(fā)酵液對(duì)致病疫霉卻沒(méi)有明顯的抑制作用，其原因也可能是放線菌發(fā)酵液的量隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行而減少，從而抑制作用不明顯。這些結(jié)果表明ST－1菌株在抑制致病疫霉菌絲生長(zhǎng)和有效控制馬鈴薯、番茄的晚疫病具有較大的應(yīng)用潛能，對(duì)其抑制物質(zhì)的穩(wěn)定性等有待進(jìn)一步去開(kāi)展研究。

［1］蔣繼志，等.幾種真菌發(fā)酵液對(duì)致病疫霉的抑制作用［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2001，02:55－59.

［2］姜云，等.一株拮抗番茄葉霉病菌的放線菌篩選、鑒定及發(fā)酵條件研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，2007，47(4):622－627.

［3］劉炳源，周晶.土壤拮抗放線菌的分離與篩選效果研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013，17:225－228.

［4］蔣繼志，等.致病疫霉拮抗菌熒光假單胞菌的篩選及離體防病作用［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36(3):72－76.

［5］王巖，梁寧，蔣繼志.放線菌NB8菌株對(duì)致病疫霉抑制作用的實(shí)驗(yàn)初報(bào)［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，15(10):54－56.

［6］劉金秀，等.黃瓜枯萎病拮抗放線菌篩選及其生防作用鑒定［J］.園藝學(xué)報(bào)，2012，39(6):1123 －1130.

［7］袁鶴，等.番茄早疫病拮抗放線菌的篩選［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(11):1223 －1225.

［8］張輝，等.拮抗放線菌的篩選以及發(fā)酵工藝的優(yōu)化［J］.河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，37(4):387 －401.

［9］田小衛(wèi)，張陳云，吳文君.一株放線菌次生代謝產(chǎn)物抗菌活性的初步研究［J］.天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，12(3):44－48.

［10］朱琳，等.拮抗菌對(duì)致病疫霉生長(zhǎng)及抗性酶活性的影響［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33(2):70 －73.

［11］趙麗坤，等.土壤放線菌K2的篩選、鑒定及其抑菌活性初試［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29(15):73 －77.

［12］郭會(huì)婧，等.致病疫霉拮抗菌篩選及復(fù)合發(fā)酵液的抑菌作用研究［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31:44－48.

［13］Lilia Fourati － Ben Dguira，Serge Fotso，Raoudha Ben Ameur－ Mchdi，et al.Purification and structure elucidation of antifungal and antibacterial activities of newly isolated Streptomyces sp.strainUS80［J］.Research in Microbiology，2005(156):341 －347.