司曉光，郭 剛，王小霞，鄭春陽，高 強，*

（1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津強微特生物科技有限公司，天津 300384）

丙酮酸是一種重要的有機酸，廣泛應(yīng)用于化工、制藥、農(nóng)用化學(xué)品和營養(yǎng)保健品等領(lǐng)域，近年來全球市場需求量不斷增長[1-2]。丙酮酸的工業(yè)生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法。化學(xué)合成法是利用化學(xué)方法在液相或氣相反應(yīng)條件下中將酒石酸或乳酸氧化為丙酮酸脂[3]，進(jìn)一步水解為丙酮酸，但該方法成本較高且污染嚴(yán)重。酶轉(zhuǎn)化法利用微生物細(xì)胞中的酶系將乳酸脫氫氧化成丙酮酸[4]，但該方法成本高，無法形成工業(yè)性生產(chǎn)。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸具有效率高、污染小、原料葡萄糖成本低等優(yōu)點，是一條極具發(fā)展前景的工業(yè)化生產(chǎn)丙酮酸的方法。但微生物產(chǎn)能低、可利用碳源種類有限等問題成為微生物發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的瓶頸。為此篩選增殖速度快、丙酮酸產(chǎn)量高和可利用碳源廣泛的菌株成為了迫在眉睫的問題，國內(nèi)外研究人員不斷從自然界中篩選優(yōu)良菌株、優(yōu)化培養(yǎng)基來提高產(chǎn)量，或者嘗試?yán)米贤饩€、化學(xué)誘變劑等方法誘變獲取高產(chǎn)菌株，雖然取得一些成效但還無法滿足市場的需求，因此需要尋找更有效的丙酮酸高產(chǎn)菌株選育方法顯得尤為重要[5]。

目前，我國在丙酮酸的發(fā)酵生產(chǎn)方面的研究處于國際先進(jìn)水平。李寅等篩選到一株以葡萄糖為底物生產(chǎn)丙酮酸的光滑球擬酵母WSH-IP12，發(fā)酵55h，丙酮酸含量達(dá)到57.3g/L[6]；張澎湃通過誘變篩選得到一株高產(chǎn)丙酮酸的突變株TK418，經(jīng)條件優(yōu)化后丙酮酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了35.60%[7]；胡曉冰等研究了磷對丙酮酸發(fā)酵的影響[8]；趙博、王欽宏等對產(chǎn)丙酮酸的光滑球擬酵母菌3672進(jìn)行高溫定向優(yōu)化，丙酮酸含量達(dá)到28g/L，發(fā)酵時間有36h變?yōu)?4h，發(fā)酵溫度由30℃提高到40℃[9]。

常壓室溫等離子（ARTP）誘變系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的微生物基因組快速誘變方法。ARTP誘變系統(tǒng)是利用等離子體中的活性粒子作用于微生物，使微生物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及通透性改變，并引起基因損傷，進(jìn)而使微生物基因序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)顯著變化，最終導(dǎo)致微生物產(chǎn)生突變[10-11]。ARTP具有射流溫度低、產(chǎn)生的等離子體均勻、無需真空裝置、操作簡單、成本低、與生物大分子和細(xì)胞作用明顯等優(yōu)點[12]，已成為快速突變微生物基因組的有效方法。研究表明，ARTP誘變育種技術(shù)可以快速地誘變細(xì)菌、微藻、真菌、酵母等微生物[13]，突變率高，并易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的突變株[14]。本研究利用新型常壓室溫等離子體（ARTP）誘變產(chǎn)丙酮酸的光滑球擬酵母（Torulopsis glabrata）Tp19，建立了應(yīng)用CaCO3篩選平板透明圈與菌落直徑比與100孔板法快速簡便篩選突變株的方法，并通過搖瓶發(fā)酵確定了突變菌株的遺傳穩(wěn)定性，以期獲得遺傳穩(wěn)定性良好的丙酮酸高產(chǎn)突變菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

光滑球擬酵母（Torulopsis glabrata）Tp19（NA-+Bio-+TPP-+Pdx-） 天津科技大學(xué)生化工程研究室保藏；葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、（NH4）2SO4、MgSO4、煙酸、鹽酸硫胺素、生物素、鹽酸吡哆醇 分析純；丙酮酸 色譜純。

ARTP-II誘變系統(tǒng) 北京思清源生物科技有限公司；高效液相色譜儀Agilent 1200 美國安捷倫科技公司；紫外可見分光光度計TU-1810 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Bioscreener全自動生長曲線分析儀FP-1100-C Oy Growth Curves Ab Ltd.；恒溫?fù)u床HYG 上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；SBA-40E生物傳感儀 山東省科學(xué)院生物研究所。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

1.2.1 培養(yǎng)基

1.2.1.1 CaCO3篩選培養(yǎng)基 葡萄糖40g，蛋白胨10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，煙酸8mg，鹽酸硫銨素20μg，鹽酸吡哆醇0.5mg，生物素10μg，瓊脂20g，CaCO35g，蒸餾水定容至1L。

1.2.1.2 種子培養(yǎng)基 葡萄糖30g，蛋白胨10g，玉米漿5mL，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸餾水定容至1L。

1.2.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基[15]葡萄糖80g，硫酸銨8g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，煙酸8mg，鹽酸硫胺素20μg，生物素10μg，鹽酸吡哆醇0.5mg，CaCO330g（搖瓶12h添加），金屬離子母液5mL，蒸餾水定容至1L，pH5.6。

1.2.2 培養(yǎng)方法[15]

1.2.2.1 種子培養(yǎng) 從斜面培養(yǎng)基挑取1環(huán)活化好的菌種接種到含有50mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃、200r/min搖床振蕩培養(yǎng)20h。

1.2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 以5%接種量接入含有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃、200r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)36h。

1.2.2.3 100孔板種子/發(fā)酵培養(yǎng) 取40μL種子液加入含有360μL種子培養(yǎng)基/發(fā)酵培養(yǎng)基，置于Bioscreener全自動生長曲線分析儀中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件見表1。

表1 Bioscreener操作條件Table 1 Operating conditions using Bioscreener

1.3 誘變與突變株選育

1.3.1 菌體前培養(yǎng) 取上述活化的種子液，以5%的接種量按上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)8～9h，使細(xì)胞處于對數(shù)繁殖期。

1.3.2 菌懸液制備 取1mL上述培養(yǎng)液5000r/min室溫下離心5min，收集菌體，分別用1mL生理鹽水洗2次，然后將菌體重新懸浮于適量的無菌水中，制成細(xì)胞濃度為1×107cfu/mL的菌懸液。

1.3.3 ARTP誘變 取上述菌懸液10μL涂布于不銹鋼載片表面，晾干后移至ARTP-II誘變系統(tǒng)中誘變。誘變條件[16]見表2。

表2 ARTP誘變條件Table 2 Operating conditions using ARTP

將用ARTP處理后的載片置于含1mL生理鹽水的2mL離心管振蕩洗脫1min，涂布種子培養(yǎng)基平板（種子培養(yǎng)基加2%瓊脂）活菌計數(shù)。

1.3.4 突變株初篩 取誘變液稀釋涂布CaCO3篩選培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)36h，挑選R值（R值：透明圈直徑/菌落直徑）較大的單菌落接種到100孔板，30℃培養(yǎng)24h測定丙酮酸產(chǎn)量。

1.3.5 突變株復(fù)篩 將初篩產(chǎn)酸量較高的突變株搖瓶發(fā)酵36h，測定發(fā)酵液殘?zhí)恰⒈岷挺?酮戊二酸的含量。

1.4 分析方法

1.4.1 菌體濃度測定 稀釋發(fā)酵液，測定660nm處吸光度值。

1.4.2 致死率計算 致死率（%）=100×（對照組活菌數(shù)-誘變組活菌數(shù)）/對照組活菌數(shù)

1.4.3 葡萄糖測定 用配有葡萄糖氧化酶膜的SBA-40E生物傳感儀檢測。

1.4.4 丙酮酸與α-酮戊二酸測定 高效液相色譜（HPLC）法，色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm）；流動相0.1%H3PO4溶液；流速1.0mL/min；檢測波長210nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 ARTP誘變致死曲線的測定

常壓室溫等離子體產(chǎn)生的活性粒子能夠破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，也能夠穿過細(xì)胞壁到達(dá)細(xì)胞內(nèi)打斷基因、蛋白質(zhì)分子等，從而導(dǎo)致大部分微生物死亡[17]。但少數(shù)經(jīng)過ARTP照射過的微生物會通過本身的自動修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)存活，并在這一過程中產(chǎn)生基因突變，因此選擇合適的ARTP誘變條件能夠?qū)崿F(xiàn)微生物的快速誘變育種。

出發(fā)菌株菌懸液經(jīng)不同的常壓室溫等離子束照射時間處理后，生理鹽水洗脫并稀釋涂布，進(jìn)行平板計數(shù)。不經(jīng)過照射處理的對照組菌懸液以同樣的方法進(jìn)行平板計數(shù)，計算得到每個照射時間下的致死率（圖1）。

由圖1可知，常壓室溫等離子體與光滑球擬酵母Tp19菌株的致死率之間存在著明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。ARTP處理80s時致死率達(dá)到90%以上；處理160s時致死率達(dá)到100%。由現(xiàn)代育種理論可知，當(dāng)微生物菌種的致死率在90%～95%范圍時，正突變率最高，因此選擇80s為ARTP最佳誘變處理時間，此時致死率為91.7%。

圖1 不同ARTP照射時間下的致死率曲線Fig.1 Influence of exposure time on the fatality rate

2.2 突變株初篩及復(fù)篩

2.2.1 突變株初篩 誘變80s的處理液稀釋后涂布于CaCO3篩選平板，挑選出22株R值較大的單菌落，接種于100孔板并置于Bioscreener全自動生長曲線分析儀中培養(yǎng)20h，取40μL培養(yǎng)液接種于含有360μL發(fā)酵液的100孔板中，三組平行發(fā)酵測定24h丙酮酸和α-酮戊二酸含量，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，CaCO3平板初篩得到突變株的丙酮酸產(chǎn)量與出發(fā)菌株TP19相比，只有8株菌增加，而其余14株菌降低。這一方面表明了CaCO3平板只能作為對產(chǎn)丙酮酸菌株的初篩，并不能作為精確衡量菌株產(chǎn)丙酮酸能力大小的依據(jù)；另一方面也說明對丙酮酸產(chǎn)量進(jìn)行定量測定，即對突變株復(fù)篩是必要的。

圖2 突變株和出發(fā)菌株100孔板24h發(fā)酵時丙酮酸和α-酮戊二酸產(chǎn)量Fig.2 The pyruvate and α-ketoglutaric acid production of the mutants and the original strain in 100-well plate at 24h cultivation

2.2.2 突變株復(fù)篩 經(jīng)過以上高通量篩選獲得8株突變株進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果如圖3。從圖中可以看出有5個突變株（A109，A214，A302，A311，A605）的丙酮酸產(chǎn)量高于出發(fā)菌株Tp19，同時突變株的α-酮戊二酸產(chǎn)量低于出發(fā)菌株。這說明丙酮酸產(chǎn)量的提高是由于丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)的代謝流降低。作為糖酵解途徑的最終產(chǎn)物，丙酮酸又是三羧酸循環(huán)的代謝起點，處于代謝途徑中的關(guān)鍵代謝支點。因此，在保證細(xì)胞正常代謝的前提下盡可能減少丙酮酸的降解和轉(zhuǎn)化也是提高丙酮酸產(chǎn)量的有效方法。與此同時，在丙酮酸分離提取階段應(yīng)盡可能降低非目標(biāo)產(chǎn)物的含量以提高丙酮酸提取效率，因此較低的α-酮戊二酸可以降低提取成本，提高經(jīng)濟效益[18]。

圖3 突變株和出發(fā)菌株搖瓶發(fā)酵36h的丙酮酸和α-酮戊二酸產(chǎn)量Fig.3 The pyruvate and α-ketoglutaric acid production of the mutants and the original strain at 36h shaking flask cultivation

2.3 突變株遺傳穩(wěn)定性

誘變選育的突變體在傳代中可能會出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象，這樣就會導(dǎo)致篩選的高產(chǎn)菌株經(jīng)過傳代后很快出現(xiàn)生產(chǎn)性狀“衰退”即丙酮酸產(chǎn)量下降。因此，對篩選到得3株高產(chǎn)突變株A214，A302與A311連續(xù)轉(zhuǎn)接7代進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性傳代驗證，結(jié)果見圖4。

圖4 突變株的遺傳穩(wěn)定性檢測Fig.4 Genetic stability of mutant strains

工業(yè)生產(chǎn)中的優(yōu)良的菌株不僅要有較高的目的產(chǎn)物生成率和原料利用率，而且還應(yīng)滿足生產(chǎn)性能穩(wěn)定的要求，即相同的生產(chǎn)條件下菌株性能保持不變。由圖4可以看出，突變株A214產(chǎn)丙酮酸的遺傳性能穩(wěn)定，發(fā)酵36h的丙酮酸產(chǎn)量保持在（37.43±0.16）g/L，比出發(fā)菌株（32.92±0.34）g/L提高了13.69%。表明該突變株產(chǎn)丙酮酸性能穩(wěn)定，既可以滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求，也可以作為后續(xù)實驗的出發(fā)菌株。突變株A302雖然遺傳性能穩(wěn)定，但是丙酮酸的產(chǎn)量較A214低，而A311的丙酮酸產(chǎn)量起伏較大，不適合工業(yè)化應(yīng)用。

3 結(jié)論

本研究表明，ARTP誘變育種方法能夠有效的誘變光滑球擬酵母（T.glabrata）Tp19菌株，而100孔平板培養(yǎng)可快速篩選產(chǎn)丙酮酸的突變株。通過搖瓶復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性檢測，篩選出了一株丙酮酸的突變株A214，該突變株發(fā)酵36h的丙酮酸產(chǎn)量達(dá)到37.43g/L，比出發(fā)菌株提高了13.69%。說明ARTP誘變系統(tǒng)可以引起光滑球擬酵母Tp19的基因突變，突變株A214丙酮酸產(chǎn)量提高的原因尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。本文的實驗結(jié)果是在搖瓶條件下得到的，由于搖瓶培養(yǎng)過程中營養(yǎng)、溶氧和pH等條件不能調(diào)控，接下來需要通過發(fā)酵罐放大培養(yǎng)對突變菌株生產(chǎn)丙酮酸的過程和發(fā)酵特性進(jìn)行分析，并進(jìn)一步優(yōu)化其發(fā)酵條件，為中試和大規(guī)模生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

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