李秋玲 李 青 劉 燕 葉香娟

(北京林業(yè)大學(xué),北京,100083)

春石斛繼代培養(yǎng)主要影響因素1)

李秋玲 李 青 劉 燕 葉香娟

(北京林業(yè)大學(xué),北京,100083)

以春石斛品種‘火鳥’(Dendrobiumnobile‘Huoniao’)莖段誘導(dǎo)出的側(cè)芽為試驗(yàn)材料，研究了基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、不同氮素的比例與水平、有機(jī)添加物對(duì)春石斛叢生芽增殖的影響。結(jié)合生長情況，選出最適宜的增殖培養(yǎng)基。結(jié)果表明，叢生芽增殖培養(yǎng)適宜的基本培養(yǎng)基為1/2MS；添加0.10 mg·L-1的TDZ和0.10 mg·L-1的NAA可得到較高的增殖系數(shù)；以1/2MS基本培養(yǎng)基中的氮素為對(duì)照，改變氮素的比例與水平，均對(duì)春石斛的增殖有一定的抑制作用；有機(jī)添加物以添加100 g·L-1的馬鈴薯泥促進(jìn)效果較好。

春石斛；繼代培養(yǎng)；叢生芽；增殖系數(shù)；組織培養(yǎng)

We used mixed buds by inducing stem section ofDendrobiumnobile‘Huoniao’ as the materials to study the effects of basic media, plant growth regulators, different levels of N and different organic additives on the plantlets multiplication. Combined with the status of growth, we chose the best multiplication media. The best basic media for multiplication is 1/2MS. Adding 0.10 mg·L-1TDZ and 0.10 mg·L-1NAA, we can obtain a higher proliferation rate. Compared to N of 1/2MS basic media, changing the proportion and levels of N has certain inhibitory effects on the plantlets multiplication. Adding mashed potato 100 g·L-1has a better effect on promoting multiplication.

KeywordsDendrobiumnobile; Subculture; Cluster buds; Multiplication ratio; Tissue culture

春石斛(Dendrobiumnobile)是石斛屬植物中早春開花的一類，因此得名。春石斛的園藝栽培品種具有較高的觀賞價(jià)值，花色艷麗、觀賞期長，花期又與我國的傳統(tǒng)節(jié)日春節(jié)基本相吻。因此，春石斛逐漸成為年宵花卉的新寵，呈現(xiàn)供不應(yīng)求的態(tài)勢(shì)[1-2]。我國的春石斛品種基本上從日本進(jìn)口，使我國春石斛的發(fā)展受到極大的限制[3]，而且常規(guī)繁殖方法遠(yuǎn)不能滿足商品化生產(chǎn)的需求。組織培養(yǎng)作為一種快速繁殖技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)來解決這一供求現(xiàn)狀。近年來有關(guān)春石斛組織培養(yǎng)的研究也有不少報(bào)道，研究方向主要集中在離體培養(yǎng)的快速繁殖上和對(duì)各培養(yǎng)階段的優(yōu)化上[4-7]，春石斛的離體多倍體誘導(dǎo)[8]和試管開花[9]也有少量報(bào)道。根據(jù)現(xiàn)在市場(chǎng)對(duì)春石斛的需求量，如何提高春石斛組織培養(yǎng)過程中的增殖系數(shù)顯得尤為重要[10]。本試驗(yàn)對(duì)春石斛叢生芽途徑的增殖階段進(jìn)行了關(guān)鍵影響因素的研究，以期找到更加有效的增殖配方。

1 材料與方法

春石斛盆栽苗(圖1)來自浙江森禾種業(yè)股份有限公司。

圖1 盆栽苗

以春石斛優(yōu)良品種‘火鳥’的1年生帶節(jié)莖段(圖2)為外植體，誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)，以1.50 cm左右的側(cè)芽(圖3)為試驗(yàn)材料進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

基本培養(yǎng)基對(duì)春石斛叢生芽增殖的影響：分別以1/2MS、MS、B5、Miller為基本培養(yǎng)基，添加1.00 mg·L-1的6-BA和0.50 mg·L-1的NAA[11]，接種45 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)、株高以及繼代苗的生長情況。

不同質(zhì)量濃度TDZ、NAA對(duì)春石斛叢生芽增殖的影響：激素質(zhì)量濃度是影響植物生長的關(guān)鍵因素。根據(jù)前期試驗(yàn)，選擇TDZ、NAA兩種激素，各設(shè)置4個(gè)質(zhì)量濃度水平。采用完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，研究TDZ、NAA的不同質(zhì)量濃度及配比對(duì)叢生芽增殖和生長情況的影響。接種45 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)、株高以及繼代苗的生長情況。

圖2 帶腋芽莖段

圖3 側(cè)芽誘導(dǎo)成功

TDZ的4個(gè)質(zhì)量濃度水平：0.05、0.10、0.20、0.50 mg·L-1。

NAA的4個(gè)質(zhì)量濃度水平：0.05、0.10、0.20、0.50 mg·L-1。

有機(jī)添加物對(duì)春石斛叢生芽增殖的影響：以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加TDZ0.10 mg·L-1和NAA0.10 mg·L-1，在此基礎(chǔ)上分別添加蘋果泥50、100 g·L-1，香蕉泥50、100 g·L-1，馬鈴薯泥50、100 g·L-1，水解乳蛋白1、2 g·L-1，以不添加有機(jī)物的培養(yǎng)基作為對(duì)照，接種45 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)、株高以及繼代苗的生長情況。

培養(yǎng)條件：接種后置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(23±2)℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間14 h·d-1。培養(yǎng)基中其他成分：3.0%蔗糖、0.6%瓊脂。pH值為5.4。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：增殖系數(shù)=增殖后芽的個(gè)數(shù)/接種芽的個(gè)數(shù)；每個(gè)處理30株，重復(fù)3次。文中表格使用Microsoft Excel軟件繪制。使用SPSS18.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，運(yùn)用最小顯著差數(shù)法(LSD法)比較分析數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基對(duì)春石斛叢生芽增殖的影響

分別以1/2MS、MS、B5、Miller為基本培養(yǎng)基，添加1.00 mg·L-1的6-BA和0.50 mg·L-1的NAA，側(cè)芽接種45 d后統(tǒng)計(jì)‘火鳥’增殖系數(shù)、株高以及生長情況(表1)。

表1 基本培養(yǎng)基對(duì)‘火鳥’增殖的影響

注：“+++”表示繼代苗生長較好，“++++”表示繼代苗生長健壯；表中平均增殖系數(shù)與平均株高為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列不同字母表示差異顯著，相同字母表示差異不顯著。

對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行方差分析與多重比較，結(jié)果表明，不同的基本培養(yǎng)基對(duì)增殖系數(shù)和株高的影響均達(dá)到了顯著的差異。增值系數(shù)方面，以1/2MS基本培養(yǎng)基的增殖效果最好，達(dá)到了2.86，B5培養(yǎng)基的增殖效果最差，僅有2.32，與1/2MS培養(yǎng)基增殖系數(shù)相差了0.54。這些差異是由于不同的基本培養(yǎng)基含有的營養(yǎng)成分及濃度有所不同，對(duì)植物生長的作用不同。1/2MS、MS與Miller、B5增殖系數(shù)之間達(dá)到了顯著差異。1/2MS、MS培養(yǎng)基的生長情況也優(yōu)于Miller、B5培養(yǎng)基。而1/2MS與MS培養(yǎng)基之間、Miller與B5培養(yǎng)基之間均無顯著差異，這說明MS基本培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分更適合‘火鳥’的增殖與生長，1/2MS、MS培養(yǎng)基的成分及濃度均能夠滿足‘火鳥’增殖與生長的需求。1/2MS與MS增殖系數(shù)之間雖無顯著差異，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，1/2MS培養(yǎng)基的增殖效果略優(yōu)于MS基本培養(yǎng)基。從成本方面考慮，1/2MS比MS培養(yǎng)基濃度低，更加節(jié)約成本。1/2MS、MS、Miller對(duì)‘火鳥’株高的影響要優(yōu)于B5，且達(dá)到了顯著差異，而前3種基本培養(yǎng)基對(duì)株高的影響并無顯著差異。綜合考慮，應(yīng)選擇1/2MS作為‘火鳥’叢生芽途徑增殖的基本培養(yǎng)基(圖4、圖5)。

圖4 叢生芽誘導(dǎo)與增殖成功

圖5 試驗(yàn)整體情況

2.2 不同質(zhì)量濃度TDZ、NAA對(duì)春石斛叢生芽增殖的影響

將生長一致的芽體接種到含有不同質(zhì)量濃度生長調(diào)節(jié)劑的叢生芽增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計(jì)‘火鳥’在不同增殖培養(yǎng)基中的增殖系數(shù)、株高以及生長情況(表2)。

表2 不同TDZ、NAA質(zhì)量濃度對(duì)春石斛增殖的影響

注：“++”表示繼代苗生長一般；“+++”表示繼代苗生長較好；“++++”表示繼代苗生長健壯；表中平均增殖系數(shù)與平均株高為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

對(duì)表2進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，區(qū)組間無顯著差異，說明組織培養(yǎng)的培養(yǎng)環(huán)境具有較高的一致性，是工廠化生產(chǎn)得到生長一致的組培苗的前提條件。經(jīng)不同質(zhì)量濃度TDZ處理的‘火鳥’增殖系數(shù)、株高之間分別達(dá)到顯著差異；而經(jīng)不同質(zhì)量濃度NAA處理的‘火鳥’增殖系數(shù)之間存在顯著差異，但株高之間差異不顯著。針對(duì)不同質(zhì)量濃度TDZ、NAA對(duì)春石斛增殖的影響作單因子多重比較(表3)。

表3 不同質(zhì)量濃度TDZ、NAA對(duì)春石斛增殖影響的單因子多重比較

激素質(zhì)量濃度/mg·L-1平均增殖系數(shù)平均株高/cmTDZ0.05(2.31±0.04)c(1.18±0.02)c0.10(2.62±0.05)a(1.57±0.02)a0.20(2.44±0.03)b(1.34±0.05)b0.50(2.26±0.03)c(1.15±0.03)cNAA0.05(2.25±0.02)b(1.32±0.05)a0.10(2.57±0.02)a(1.31±0.02)a0.20(2.59±0.04)a(1.33±0.01)a0.50(2.22±0.01)b(1.29±0.05)a

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同字母表示差異顯著，相同字母表示差異不顯著。

多重比較結(jié)果表明，隨著TDZ質(zhì)量濃度的升高，增殖系數(shù)與株高均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，說明過低或過高的TDZ質(zhì)量濃度均不利于叢生芽的增殖。當(dāng)TDZ的質(zhì)量濃度為0.10 mg·L-1時(shí)，‘火鳥’的增殖系數(shù)最大達(dá)到了2.62，株高最高為1.57 cm。與其他質(zhì)量濃度水平的增殖系數(shù)與株高達(dá)到了顯著差異，所以添加0.10 mg·L-1的TDZ比較適合‘火鳥’的增殖培養(yǎng)。

隨著NAA質(zhì)量濃度的升高，增殖系數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，說明適宜的NAA質(zhì)量濃度是提高叢生芽增殖率的關(guān)鍵因素之一。當(dāng)NAA的質(zhì)量濃度為0.20 mg·L-1時(shí)，‘火鳥’的增殖系數(shù)最高，但與0.10 mg·L-1水平的平均增殖系數(shù)非常接近，并無顯著差異，而NAA的這兩水平與其他水平間都達(dá)到了顯著差異，所以添加0.10～0.20 mg·L-1的NAA比較適合‘火鳥’的增殖培養(yǎng)，但從節(jié)約成本方面考慮，在有相同誘導(dǎo)效果的前提下，應(yīng)選擇添加低質(zhì)量濃度的外源激素。降低成本的同時(shí)也減少了外源激素在植物體內(nèi)的積累，減緩了激素積累對(duì)植物生長的不利影響，從而增加有效的繼代次數(shù)，也間接降低了生產(chǎn)成本。

綜合以上分析，添加0.10 mg·L-1的TDZ、0.10 mg·L-1的NAA適宜‘火鳥’叢生芽增殖培養(yǎng)。

2.3 不同氮素水平對(duì)春石斛叢生芽增殖的影響

表4 不同N素水平對(duì)春石斛增殖的影響

注：“++”表示繼代苗生長一般，“+++”表示繼代苗生長較好，“++++”表示繼代苗生長健壯；表中平均增殖系數(shù)與平均株高為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列不同字母表示差異顯著，相同字母表示差異不顯著。

2.4 有機(jī)添加物對(duì)春石斛叢生芽增殖的影響

以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加TDZ0.10 mg·L-1和NAA0.10 mg·L-1，在此基礎(chǔ)上分別添加不同質(zhì)量濃度的各種有機(jī)添加物，以不添加有機(jī)物的培養(yǎng)基作為對(duì)照，接入45 d后統(tǒng)計(jì)‘火鳥’增殖系數(shù)、株高以及生長情況(表5)。

表5 有機(jī)添加物對(duì)春石斛增殖的影響

注：“+”表示繼代苗生長較差，“++”表示繼代苗生長一般，“+++”表示繼代苗生長較好，“++++”表示繼代苗生長健壯；表中平均增殖系數(shù)與平均株高為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同字母表示差異顯著，相同字母表示差異不顯著。

從表5可看出，添加不同的有機(jī)添加物對(duì)‘火鳥’的增殖有不同的影響，添加香蕉泥、馬鈴薯泥、水解乳蛋白均對(duì)‘火鳥’的增殖有促進(jìn)作用，但添加蘋果泥降低了‘火鳥’的增殖系數(shù)，而且隨著蘋果泥質(zhì)量濃度的增加，抑制作用越明顯，生長情況也弱于對(duì)照。這可能是由于添加蘋果泥會(huì)降低培養(yǎng)基的pH值，不利于植物的增殖和生長。

對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行方差分析和多重比較，添加1 g·L-1水解乳蛋白、100 g·L-1的香蕉泥、100 g·L-1的馬鈴薯泥對(duì)‘火鳥’增殖系數(shù)的影響無顯著差異，但均與對(duì)照達(dá)到了顯著的差異，具有良好的促進(jìn)效果。添加100 g·L-1的香蕉泥或100 g·L-1的馬鈴薯泥均比分別添加50 g·L-1的促進(jìn)效果好，都沒有達(dá)到顯著差異，但添加50 g·L-1香蕉泥或馬鈴薯泥時(shí)，增殖系數(shù)均與對(duì)照無顯著差異，因此，應(yīng)添加100 g·L-1的香蕉泥或100 g·L-1的馬鈴薯泥。添加1 g·L-1的水解乳蛋白比添加2 g·L-1時(shí)的促進(jìn)效果好，兩者無顯著差異，但都與對(duì)照有顯著差異，這說明超過一定的質(zhì)量濃度，水解乳蛋白的促進(jìn)作用有所降低。添加水解乳蛋白雖然對(duì)增殖有較好的促進(jìn)效果，但小苗生長勢(shì)弱，不宜作為‘火鳥’的有機(jī)添加物。100 g·L-1的香蕉泥與100 g·L-1的馬鈴薯泥對(duì)增殖的促進(jìn)效果相似，但考慮到價(jià)格問題，為集約化生產(chǎn)節(jié)約成本，馬鈴薯泥為‘火鳥’增殖適宜的有機(jī)添加物，質(zhì)量濃度為100 g·L-1。

3 結(jié)論與討論

適宜的基本培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基；適宜‘火鳥’增殖的TDZ和NAA的質(zhì)量濃度配比為0.10 mg·L-1和0.10 mg·L-1；從促進(jìn)效果及成本方面考慮，添加100 g·L-1的馬鈴薯泥為宜。所以‘火鳥’適宜的增殖培養(yǎng)基為1/2MS+TDZ0.10 mg·L-1+NAA0.10 mg·L-1+馬鈴薯泥100 g·L-1。

繼代培養(yǎng)階段是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，找到適宜的增殖培養(yǎng)基配方，才能達(dá)到組培快速繁殖的目的。隨著近年來春石斛的銷量增加，有關(guān)春石斛組織培養(yǎng)方面的研究也有所增加，有關(guān)其叢生芽增殖階段的研究也有不少報(bào)道，但研究結(jié)果各有差異。

基本培養(yǎng)基的種類繁多，其中的營養(yǎng)成分及其濃度有所不同，對(duì)植物的生長也有較大的影響，MS基本培養(yǎng)基是應(yīng)用最廣泛的基本培養(yǎng)基之一，前人的研究大多選用MS作為基本培養(yǎng)基[12-14]。本試驗(yàn)選用1/2MS、MS、B5、Miller四種營養(yǎng)成分及濃度差異較大的基本培養(yǎng)基，以期找到更適合春石斛增殖的基本培養(yǎng)基，結(jié)果表明，1/2MS、MS兩種基本培養(yǎng)基都比較適宜春石斛的增殖，并且兩者之間無顯著差異，說明營養(yǎng)成分對(duì)春石斛增殖的影響比濃度的影響大?；诔杀究紤]，1/2MS更適合作為春石斛叢生芽增殖的基本培養(yǎng)基。

激素對(duì)春石斛的增殖及生長起關(guān)鍵的作用。激素的組合及配比不同，增殖系數(shù)也有很大的差異。前人研究大多選用BA、NAA組合[12，15-16]，但據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TDZ比BA更加有效，因此，本試驗(yàn)選用TDZ、NAA組合，各設(shè)4個(gè)質(zhì)量濃度水平做完全區(qū)組試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)因素均對(duì)增殖系數(shù)有顯著的影響，并得出適宜質(zhì)量濃度配比為TDZ0.10 mg·L-1、NAA0.10 mg·L-1。

氮元素在植物的生長發(fā)育過程中有很重要的作用，被稱為生命元素。有關(guān)氮素對(duì)春石斛增殖的影響的研究較少，但有人研究發(fā)現(xiàn)，適宜的比例和水平對(duì)增殖有明顯的促進(jìn)作用[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以1/2MS基本培養(yǎng)基中的氮素為對(duì)照，改變氮素的比例與水平，均對(duì)春石斛的增殖有一定的抑制作用。但在基本培養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)中，1/2MS、MS對(duì)春石斛增殖的影響差異并不顯著，這可能與各營養(yǎng)成分間的綜合作用有關(guān)。

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，除蘋果泥以外的其他3種有機(jī)添加物均能有效地促進(jìn)春石斛的增殖，尤其是添加1 g·L-1的水解乳蛋白可以得到最高的增殖系數(shù)，但由于它對(duì)試管苗的生長勢(shì)有明顯的不良影響，所以不得不放棄，具體的作用機(jī)理尚不明確，這一結(jié)果與時(shí)晶晶的研究結(jié)果相同[18]。添加100 g·L-1的香蕉泥和100 g·L-1的馬鈴薯泥，增殖系數(shù)無顯著差異，考慮成本之后，添加100 g·L-1的馬鈴薯泥較為適宜。與對(duì)照相比，所有添加有機(jī)添加物的培養(yǎng)基褐化現(xiàn)象更加嚴(yán)重。這可能是由于有機(jī)添加物的復(fù)雜成分里有易引起褐化的物質(zhì)。試驗(yàn)中為克服褐化問題，在褐化顯現(xiàn)之初，將芽體轉(zhuǎn)移到干凈的位置，可有效控制褐化現(xiàn)象，但此做法增加了不少工作量，不適用于工廠化生產(chǎn)，需要尋求新的解決辦法。

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Main Influence Factors ofDendrobiumnobileSubculture/

Li Qiuling, Li Qing, Liu Yan, Ye Xiangjuan(Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China)//

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(7).-69～73

李秋玲，女，1988年10月生，北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，碩士研究生。

李青，北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，副教授。E-mail：wliqing06@sina.com。

2013年6月28日。

S682.31； Q945.52

1) 國家“十二五”科技支撐計(jì)劃課題(2011BAD12B02-01)。

責(zé)任編輯:任 俐。