周婕 姚羚羚 靳先萍

腸道致病菌盲樣考核鑒定分析與質量控制

周婕 姚羚羚 靳先萍

依據中華人民共和國國家標準GB4789.4-2010、GB/T4789.7-2008，采用傳統(tǒng)分離方法和血清學鑒定，聯合API20E細菌生化鑒定系統(tǒng)從混合盲樣考核樣本中分離出副溶血性弧菌，并對分離鑒定過程和微生物檢驗的質量控制進行總結分析。

腸道致病菌；沙門氏菌；副溶血性弧菌；盲樣考核；質量控制

為加強實驗室能力建設和提高在以后的工作中應對突發(fā)公共衛(wèi)生事件的能力，成都市溫江區(qū)疾病預防控制中心每年都會參加成都市疾病預防控制中心組織的微生物盲樣考核工作，以此驗證微生物實驗室的儀器性能，培養(yǎng)基試劑質量和檢驗人員的檢測能力。并從能力驗證結果中找出自身與其它實驗室間的差距，提升自身檢測能力?，F將2011年7月接受上級疾控中心盲樣考核檢測結果和檢測過程分析如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質控樣品來源 由成都市疾控中心發(fā)放的混合菌盲樣。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 本次實驗所用培養(yǎng)基由杭州微生物、北京陸橋、法國科瑪嘉試劑提供，API20E鑒定系統(tǒng)由法國梅里埃提供，沙門氏診斷血清由寧波天潤提供。檢測過程中使用的培養(yǎng)基和試劑均在有效期內，其生產廠家、批號、制備過程、驗收貯存及使用前質控等信息均可溯源。

1.2 方法[1]中華人民共和國國家標準GB4789.4-2010、GB/T4789.7-2008。

1.2.1 增菌培養(yǎng) 取25mL樣品放入225mL BPW增菌液中充分振蕩混勻，放入培養(yǎng)箱中36℃增菌8h；另再取25mL樣品放入225mL 3%堿性胨水培養(yǎng)8h，再將培養(yǎng)8h后的BPW增菌液混合后，分別移取1mL轉種于10mL TTB和10mL SC增菌液中進行培養(yǎng)。同時直接用樣品原液在選擇性平板上直接劃線分離，并在檢測過程中同步代入待檢菌標準菌株。

1.2.2 分離培養(yǎng) 挑取上述增菌液，分別接種于相應的鑒別培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)24h（BS培養(yǎng)48h）后，觀察各個平板上菌落形態(tài)。

1.2.3 生化反應及血清分型 挑取不同特征菌落涂片染色鏡檢，同時挑取各種不同可疑菌落純培養(yǎng)，再用純培養(yǎng)物作系統(tǒng)生化鑒定和血清學試驗。

2 結果

2.1 鑒別培養(yǎng)基上生長情況及菌落特點 見表1。

2.2 初步鑒定 分別挑取平板上可疑菌落于3%TSA和普通營養(yǎng)瓊脂36℃純培養(yǎng)24h，并進行革蘭氏染色，再挑取純培養(yǎng)的菌落進行氧化酶試驗，進行細菌的初步鑒定。

2.3 可疑副溶血弧菌系統(tǒng)生化鑒定

2.3.1 3%三糖鐵試驗和氧化酶試驗 可疑菌落在3%三糖鐵上表現為上紅下黃（-/+），硫化氫陰性，不產氣，氧化酶為陽性。

表1 鑒別培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及生長情況

2.3.2 嗜鹽試驗 挑取3%三糖鐵上的單個菌落，分別接種于不同濃度的氯化鈉溶液中，36℃培養(yǎng)24h后觀察結果。在3%和7%的Nacl胰胨水中混濁生長旺盛，在無鹽胨水和10%的胰胨水不生長未混濁。

2.3.3 確定實驗 取純培養(yǎng)的菌落，制成菌懸液，用API20E進行鑒定，36℃培養(yǎng)24h觀察結果。API20E試劑條生化反應編碼為4346106，結果為Vibrio parahemolyticus，即為副溶血弧菌，鑒定百分率：99.9%，T=1.0。

2.4 可疑沙門氏菌系統(tǒng)生化鑒定

2.4.1 挑取6個BS平板上的墨綠色可疑菌落，接種三糖鐵、賴氨酸、氧化酶、尿素、靛基質生化管，36℃培養(yǎng)24h觀察結果，三糖鐵反應結果只有一種，具體生化反應見表2。

表2 可疑菌株生化反應結果

2.4.2 血清學試驗 挑取三糖鐵上菌落做血清學試驗，A-F多價不凝集（陰性），鹽水對照也為陰性。

2.4.3 確定試驗 取純培養(yǎng)菌落，制成菌懸液，用API20E進行鑒定，36℃培養(yǎng)24h觀察結果[2-3]。API20E試劑條生化反應編碼為1604512，結果為Citrobacter youngae，即可排除沙門氏菌。

2.5 綜上，由生化和血清學試驗結果可得，本次質控考核檢出副溶血弧菌，未檢出沙門氏菌。

3 討論

參加室驗室間質控考核，可以增加檢驗人員實踐經驗，提高檢測能力，在平常的食品微生物檢測工作中，很少能分離出致病菌，所以對致病菌的檢測缺少經驗，而質控考核正好給了我們鍛煉的機會。對于樣品中有既目標菌，又混入了幾種干擾菌的混合菌檢測，在進行常規(guī)檢驗步驟之前，最好先直接用樣品原液在相應的選擇性平板上直接劃線分離，這樣做可以避免干擾菌生長過好而抑制了目標菌的生長，也可以提前了解樣品中的目標菌的種類，到底是一種還是兩種或是兩種菌都存在。

培養(yǎng)基的選擇也很重要，顯色培養(yǎng)基是一種新型分離培養(yǎng)基，利用它進行微生物的篩選分離，其反應的靈敏度和特異性大大優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)基，使菌落特征更容易判斷，大大提高了分離能力[3]。

平時做好實驗室的質量控制工作，如培養(yǎng)基和診斷血清的質量控制、儀器的維護保養(yǎng)和檢定校準、標準菌株的傳代和安全管理。注意實驗室生物安全，質控菌株多為致病菌，實驗結束后所有培養(yǎng)物都必須要經過高壓滅菌處理[4-6]。

[1] GB4789.4-2010、GB/T4789.7-2008 《中華人民共和國國家標準食品微生物學檢驗》[S].中華人民共和國衛(wèi)生部,2010.

[2] 慕萬志.2007年雙塔區(qū)腸道致病菌質控盲樣檢測報告[J].預防醫(yī)學情報雜志，2008,24(6):94-95.

[3] 宋鳳燕,宋艷文.食源性致病菌質控盲樣鑒定結果分析[J].職業(yè)與健康， 2010,8(23):60-61.

[4] 付冬蓮,袁國輝.一次微生物混合考核盲樣檢測分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2012,30（6）:628-630.

[5] 楊一明.微生物質控考核樣品的檢測分析與探討[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2011,8（23）:2941-2942.

[6] 張喜.商品微生物培養(yǎng)基質量狀況及其控制[J].當代醫(yī)學，2009,15 (16):37-38.

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.22.104

四川 611130 成都市溫江區(qū)疾病預防控制中心 （周婕 姚羚羚靳先萍）