李裕昌，張 雨，吳曉燕，李佳明，鄭 旸，張曉松，張雪松，康曉平

VereFlu芯片檢測(cè) H 7 N 9亞型流感病毒的效果評(píng)價(jià)

李裕昌，張 雨，吳曉燕，李佳明，鄭 旸，張曉松，張雪松，康曉平

目的：驗(yàn)證VereFlu芯片檢測(cè)H7N9亞型流感病毒的特異性和準(zhǔn)確性，為應(yīng)對(duì)流感疫情提供新的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。方法：對(duì)流感病毒H7N9亞型、H5N1亞型、H1N1亞型的病毒培養(yǎng)物及10份H7N9感染疫區(qū)的雞肛拭子標(biāo)本，提取樣本的RNA，采用VereFlu芯片法和Realtime RT-PCR兩種檢測(cè)方法。評(píng)估VereFlu芯片的檢測(cè)效果。結(jié)果：對(duì)于3種病毒培養(yǎng)物的檢測(cè)，VereFlu芯片均檢測(cè)到不同亞型的特定陽(yáng)性信號(hào)，每種亞型病毒均未出現(xiàn)交叉反應(yīng)信號(hào)，表明VereFlu芯片具有較好的檢測(cè)特異性；10份未知標(biāo)本中有8份檢測(cè)流感病毒陰性，2份檢測(cè)流感病毒陽(yáng)性，編號(hào)為106號(hào)及503號(hào)，其中106號(hào)檢測(cè)到H7及H9亞型的陽(yáng)性信號(hào)，503號(hào)僅檢測(cè)到H9亞型的陽(yáng)性信號(hào)。Realtime RT-PCR對(duì)10份未知標(biāo)本進(jìn)行H7亞型核酸檢測(cè)，從兩份流感陽(yáng)性標(biāo)本中均檢測(cè)到H7亞型核酸，高通量測(cè)序證實(shí)106號(hào)和503號(hào)標(biāo)本中均存在H7及H9亞型核酸。結(jié)論：VereFlu芯片可用于不同型別流感病毒的檢測(cè)和分型，包括新爆發(fā)的H7N9亞型病毒同樣適用，但檢測(cè)H7N9亞型的靈敏度低于Realtime RT-PCR法。

H7N9亞型流感病毒；檢測(cè)；基因芯片

流感病毒（Influenza virus），是一種分節(jié)段的單負(fù)鏈RNA病毒，屬于正黏病毒科，包括人流感病毒和動(dòng)物流感病毒，是流行性感冒的最主要的病原體。根據(jù)核蛋白（Nucleoprotein，NP）和基質(zhì)蛋白（Matrix protein，MP）的抗原性不同，流感病毒被分為甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒抗原性易發(fā)生變異，多次引起世界性大流行。甲型流感病毒根據(jù)其表面病毒血凝素（Hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）抗原性的不同，又分為若干亞型。迄今發(fā)現(xiàn)HA有16種亞型，NA有9種亞型。目前可引起人類(lèi)感染的甲型流感病毒亞型主要有H1、H3、H5、H7、H9等亞型，1918～1919年的西班牙流感的世界性大流行導(dǎo)致2000萬(wàn)～4000萬(wàn)人死亡，2009年的新型H1N1流感在全球范圍內(nèi)共導(dǎo)致至少18 500人感染，今年我國(guó)禽流感病毒H7N9亞型流行已導(dǎo)致135例感染，其中44例死亡[1-2]。由于禽流感病毒H7N9亞型為新發(fā)病原體，目前僅有WHO推薦的熒光定量PCR可供使用，技術(shù)方法單一，開(kāi)發(fā)H7N9的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于H7N9亞型病毒的快速準(zhǔn)確診斷具有重要意義。

基因芯片技術(shù)是一種大規(guī)模集成的固相雜交技術(shù)，與傳統(tǒng)基因診斷技術(shù)相比，DNA芯片技術(shù)具有微型化、高通量、高度平行性和高速性的顯著特點(diǎn)[3]。新加坡Veredus laboratories所開(kāi)發(fā)的VereFlu芯片，可靶向H1、H3、H5、H7、H9亞型及B型流感病毒，本研究利用H1N1、H5N1、H7N9亞型病毒培養(yǎng)物核酸，對(duì)VereFlu芯片檢測(cè)系統(tǒng)的特異性及分型效果進(jìn)行了初步驗(yàn)證；采集了H7N9感染疫區(qū)的禽標(biāo)本，與熒光定量PCR方法相比較，并對(duì)我國(guó)2013年新出現(xiàn)的H7N9亞型病毒的檢測(cè)效果進(jìn)行了評(píng)估，擬為VereFlu芯片的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 病毒培養(yǎng)物及標(biāo)本來(lái)源H5N1亞型及新甲型H1N1亞型流感病毒培養(yǎng)物為本實(shí)驗(yàn)室保存；H7N9亞型病毒培養(yǎng)物是從我國(guó)2013年流行的甲型流感H7N9確診患者咽拭子分離到的；10份未知標(biāo)本為同時(shí)期安徽疫區(qū)附近養(yǎng)雞場(chǎng)采取的禽類(lèi)肛拭子。

1.2 儀器及試劑VereFlu芯片反應(yīng)控制儀和掃描儀均購(gòu)自Veredus laboratories，離心機(jī)為Beckman公司的GS-15R，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為L(zhǎng)oche LightCycler 2.0，RNA提取試劑盒為ambion的PureLinkTMRNA Mini Kit，實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒為T(mén)aKaRa的One Step primeScript RT-PCR kit， PCR擴(kuò)增試劑盒為QIAGEN的Quantitect Virus+ ROX Viral Kit，VereFlu芯片試劑盒購(gòu)自Veredus laboratories，該芯片包括34組甲型流感病毒種特異性的探針（人H1N1探針4組，新型H1N1探針7組，H3N2探針4組，H5N1探針8組，H7探針3組，H9N2探針5組，乙型流感探針3組，每組探針重復(fù)2個(gè)位點(diǎn)），2組RT-PCR質(zhì)控探針（GAPDH、AT730），6個(gè)雜交陽(yáng)性質(zhì)控探針（AT683），8個(gè)雜交陰性質(zhì)控探針（AT809）以及4個(gè)方位探針（psbA_4、psbA_6），其陣列設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3 RNA提取 按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 RealtimeRT-PCR檢測(cè)樣本RNA按試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，引物和探針使用國(guó)家流感中心下發(fā)的CNIC H7F、CNIC H7R、CNIC H7P和CNIC N9F、CNIC N9R、CNIC N9P，反應(yīng)條件：RT：42℃，10 min；95℃，10 s；PCR：95℃，10 s；55℃，30 s，采集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)。

1.4.1 RT-PCR反應(yīng)條件：RT：50℃，20 min；95℃，5 min；PCR：95℃，15 s；50℃，30 s；72℃，45 s，45個(gè)循環(huán)。見(jiàn)表2。

1.4.2 雜交 按表3配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95℃，2 min；55℃，30 min。

表1 VereFlu芯片探針陣列

表2 RT-PCR配制反應(yīng)體系

表3 雜交反應(yīng)體系

1.4.3 洗滌 用去離子水將Wash Buffer Concentrate稀釋10倍，倒入50 ml離心管中，每管50 ml，將芯片置于上述裝滿洗滌液的離心管中，3000RPM離心2 min，然后倒出離心管中洗滌液，3000RPM離心2 min，甩干芯片。

1.4.4 掃描 將芯片置于掃描儀中掃描，讀取結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 VereFlu芯片檢測(cè)甲型流感病毒H5N1、H1N1和H7N9亞型病毒培養(yǎng)物核酸，基因芯片檢測(cè)結(jié)果表明，H5N1的8條檢測(cè)探針（圖1，A）。H1N1的7條檢測(cè)探針均為強(qiáng)陽(yáng)性（圖1，B）。熒光信號(hào)均大于10 000，并與其他型別探針無(wú)交叉反應(yīng)。見(jiàn)表4、表5。而對(duì)于2013年新發(fā)的H7N9亞型病毒檢測(cè)，3組探針也均檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)（圖1，C）。雖然僅有一組的陽(yáng)性信號(hào)值大于10 000。見(jiàn)表6。同樣表明該芯片能夠檢測(cè)到H7N9亞型病毒。由于該檢測(cè)芯片研制時(shí)間早于H7N9亞型新發(fā)病毒的出現(xiàn)，而該芯片上的檢測(cè)探針可特異檢測(cè)到新發(fā)H7N9亞型病毒的核酸，表明該芯片對(duì)于新發(fā)流感病毒的分型檢測(cè)具有重要意義。

10份禽未知樣本的檢測(cè)結(jié)果表明，其中有8份標(biāo)本未出現(xiàn)任何亞型流感病毒的陽(yáng)性信號(hào)，2份標(biāo)本出現(xiàn)了流感病毒的陽(yáng)性信號(hào)：編號(hào)為503號(hào)的標(biāo)本出現(xiàn)了3組H9探針的陽(yáng)性信號(hào)。見(jiàn)圖1，D和表6。編號(hào)為106號(hào)的標(biāo)本出現(xiàn)2組H9N2特異性探針的陽(yáng)性信號(hào)和1組H7特異性探針的陽(yáng)性信號(hào)。見(jiàn)圖1，E和表7。

圖1 VereFlu芯片檢測(cè)甲型流感病毒培養(yǎng)物及標(biāo)本注：A H5N1病毒培養(yǎng)物；B H1N1病毒培養(yǎng)物；C H7N9病毒培養(yǎng)物；D禽肛拭子標(biāo)本503；E禽肛拭子標(biāo)本106

2.2 Realtime RT-PCR檢測(cè)甲型流感病毒 對(duì)10份樣本，熒光定量PCR同樣檢測(cè)為8份流感病毒核酸陰性，2份流感病毒核酸陽(yáng)性，但對(duì)于流感陽(yáng)性標(biāo)本106號(hào)和503號(hào)，兩份標(biāo)本均檢測(cè)到了H7亞型核酸，僅樣本編號(hào)為106標(biāo)本檢測(cè)到N9亞型核酸，考慮到H7特異性引物靈敏度高于N9特異性引物，樣本編號(hào)為503號(hào)中可能含有N9核酸，并且106號(hào)標(biāo)本檢測(cè)CP值低于503號(hào)，表明106號(hào)中的H7及N9核酸含量高于503號(hào)。見(jiàn)表8、表9。

表4 VereFlu芯片檢測(cè) H 5 N 1陽(yáng)性樣本

表5 VereFlu芯片檢測(cè)H1N1陽(yáng)性樣本

Kappa=0.615，VereFlu芯片法和RealtimeRT-PCR檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性，通過(guò)對(duì)比檢測(cè)結(jié)果不難看出兩種方法的不一致性主要是由于檢測(cè)靈敏度不同。見(jiàn)表10。

表6 VereFlu芯片檢測(cè) H 7 N 9陽(yáng)性樣本

表7 VereFlu芯片檢測(cè)樣本編號(hào)503

表8 VereFlu芯片檢測(cè)樣本編號(hào)106

表9 Realtime RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

表10 兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較

表11 高通量測(cè)序檢測(cè)結(jié)果

2.3 高通量測(cè)序 對(duì)于樣本編號(hào)106和503，高通量測(cè)序檢測(cè)為H7N9和H9N2混合感染。見(jiàn)表11。

3 討論

基因芯片技術(shù)已問(wèn)世二十余年，其高通量的優(yōu)勢(shì)曾備受研究者的青睞，其研究應(yīng)用屢見(jiàn)報(bào)道[4-15]，但由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果分析程序相對(duì)復(fù)雜，鮮有商品化的檢測(cè)試劑。本研究所使用的VereFlu芯片檢測(cè)系統(tǒng)，集雜交系統(tǒng)與結(jié)果檢測(cè)及分析系統(tǒng)為一體，儀器設(shè)備體積小，操作簡(jiǎn)便，擴(kuò)增及雜交時(shí)間短，4 h即可完成整個(gè)檢測(cè)流程，很適合基層檢驗(yàn)單位的推廣和使用。此外，VereFlu芯片具有34種甲型流感特異性探針，3組乙型流感探針，基本上對(duì)流行的流感病毒實(shí)現(xiàn)了全部覆蓋，流感疫情爆發(fā)時(shí)，可快速對(duì)病原體進(jìn)行分型，對(duì)疫情防控具有重要意義。

本課題組主要致力于新發(fā)病毒檢測(cè)鑒定研究，引進(jìn)VereFlu芯片檢測(cè)系統(tǒng)，擬為流感病毒的檢測(cè)、分型提供技術(shù)補(bǔ)充。本文初步探討了對(duì)該檢測(cè)系統(tǒng)的驗(yàn)證情況。

由于該檢測(cè)系統(tǒng)在研發(fā)過(guò)程中，已對(duì)多種不同亞型的多種病毒株進(jìn)行了檢測(cè)驗(yàn)證，探針經(jīng)過(guò)數(shù)輪優(yōu)化，已基本可以保證檢測(cè)分型結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性。因此，本研究對(duì)該檢測(cè)系統(tǒng)的驗(yàn)證過(guò)程中，重點(diǎn)關(guān)注其對(duì)新發(fā)病毒H7N9亞型的檢測(cè)效果。本研究提取了高致病性H5N1、2009年流行的H1N1病毒培養(yǎng)物、2013年新爆發(fā)的H7N9病毒培養(yǎng)物的核酸及10份未知禽樣本進(jìn)行檢測(cè)，病毒培養(yǎng)物樣本的檢測(cè)結(jié)果表明，該檢測(cè)系統(tǒng)具有較高的特異性，芯片上其他亞型的甲型流感探針未與H5N1、H1N1和H7N9樣本發(fā)生交叉反應(yīng)，可準(zhǔn)確用于病毒培養(yǎng)物核酸的分型。盡管H7N9亞型病毒的出現(xiàn)時(shí)間晚于該檢測(cè)系統(tǒng)的組裝時(shí)間，但該芯片同樣可檢測(cè)到H7亞型病毒核酸，但3條探針，僅一條出現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性，推測(cè)原因，在于新發(fā)H7N9亞型病毒核酸與芯片上的H7檢測(cè)探針序列具有一定差異，從而導(dǎo)致兩條檢測(cè)探針未出現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)，同時(shí)也將影響芯片的檢測(cè)靈敏度，探針優(yōu)化后可以適用新爆發(fā)的H7N9亞型病毒。

目前市售的試劑盒僅能區(qū)分甲型流感和乙型流感，未見(jiàn)能鑒別甲型流感病毒亞型的相關(guān)產(chǎn)品，關(guān)于甲型流感分型檢測(cè)多重PCR和基因芯片方法雖有報(bào)道，但是目前這些方法還僅限于實(shí)驗(yàn)室研究[16-17]。在對(duì)H7N9亞型流感的防控過(guò)程中，我們利用該芯片檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)從疫區(qū)采集到的10份禽肛拭子進(jìn)行了檢測(cè)。從中檢測(cè)到1份H7亞型感染標(biāo)本，而熒光定量PCR篩查到2份H7亞型病毒感染，進(jìn)而對(duì)該兩份流感陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行了高通量測(cè)序，確定該兩份標(biāo)本均為H7亞型及H9亞型的混合感染。表明對(duì)于新發(fā)病毒H7N9，VereFlu芯片的檢測(cè)靈敏度低于熒光定量PCR，但VereFlu芯片可同時(shí)快速篩查多種流感病毒亞型，可以作為實(shí)驗(yàn)室對(duì)包括H7N9在內(nèi)的多種亞型流感病毒檢測(cè)分型的技術(shù)補(bǔ)充。

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（收稿：2013-08-28修回：2013-12-20編校：齊 彤）

Evaluation of VereFlu gene microarray on detecting H 7 N 9 subtype influenza virus

LI Yu-chang，ZHANG Yu，WU Xiao-yan，LI Jia-ming，ZHENG Yang，ZHANG Xiao-song，ZHANG Xue-song，KANG Xiao-ping.Academy Fifth Institute of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China
Corresponding author：KANG Xiao-ping，E-mail：kangxiaoping@163.com

Objeccttiive：To validate the specialty and accuracy of VereFlu detecting target sample，and provide a new laboratory approach to identify the influenza subtypes during flu breaks.Metthodss：Extract RNA of H7N9 sample，H5N1sample，H1N1sample and 10 anal samples from chickens fed in H7N9 affected areas，proceed VereFlu and Realtime RT-PCR to determine the pathogens.Ressullttss：We have found specific positive signal respectively from H7N9，H5N1 and H1N1 sample through VereFlu without any cross action，indicating VereFlu performs excellent in specificity.From 2 of the 10 anal samples coded as 106 and 503，we have got influenza A positive signal.In addition，sample 503 is H7 positive while sample 106 is positive for both H7 and H9.We have found both sample 106 and sample 503 are H7 positive through Realtime RT-PCR，furthermore，we have confirmed H7 and H9 gene in both 503 and 106 through High-throughput sequencing.Conclussiion：We could utilize VereFlu to detect the target gene in nucleic acid sample specifically，however，the sensitivity of which is lower than Realtime RT-PCR.

H7N9 influenza virus；detection；gene microarray

S 854.43

A

2095-3496（2014）01-0003-05

國(guó)家傳染病重大專(zhuān)項(xiàng)課題（20112X10004-001；2013ZX10004-606；2013ZX10004-803）

100071北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院五所（李裕昌，張 雨，吳曉燕，李佳明，鄭 旸，張曉松，張雪松，康曉平）

康曉平，E-mail：kangxiaoping@163.com