秦劍紅 (解放軍169醫(yī)院藥械科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

一直以來(lái)，中藥制劑摻假現(xiàn)象屢禁不止，其種類(lèi)繁多，作用機(jī)制不明，且相應(yīng)的檢測(cè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚不完善，使得不法分子有機(jī)可乘。對(duì)于中藥摻雜化學(xué)成分的檢測(cè)，常用方法有薄層色譜法(TLC)[1,2]、高效液相色譜法(HPLC)[3,4]、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)[5,6]等。傳統(tǒng)的TLC法操作簡(jiǎn)單，但存在較高的假陽(yáng)性；HPLC、LC-MS法靈敏度高且準(zhǔn)確性好，但其樣品前處理過(guò)程復(fù)雜，且需要特定規(guī)格的試劑和色譜柱，檢測(cè)成本較高，不易于基層推廣。隨著便攜式拉曼光譜儀的普及，表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)逐漸在分析檢測(cè)領(lǐng)域得到較多應(yīng)用[7,8]。表面增強(qiáng)拉曼散射光譜(surfcae enhanced Raman scattering，SERS)能夠提供分子能級(jí)的指紋圖譜，且信號(hào)強(qiáng)度好，通常為常規(guī)拉曼光譜的104～106倍。將其與TLC方法相結(jié)合，先對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行初步分離，然后采用SERS技術(shù)檢測(cè)，獲得待測(cè)物的特征指紋圖譜，從而進(jìn)行更準(zhǔn)確的定性判別。目前，SERS技術(shù)已用于水污染的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控[9]、中藥成分非法添加西藥成分的檢測(cè)[10]、生物尿樣中可卡因代謝產(chǎn)物的定量分析[11]、中草藥中結(jié)構(gòu)相似生物堿成分的鑒別[12]等。

本研究采用TLC與SERS聯(lián)用方法對(duì)降糖中成藥中添加的格列類(lèi)藥物(格列喹酮、格列本脲、格列美脲、格列吡嗪、格列齊特)進(jìn)行檢測(cè)，首次采用有機(jī)相銀溶膠獲得了5種格列類(lèi)化學(xué)降糖藥的SERS圖譜，可用于中藥中非法添加該類(lèi)化學(xué)藥成分的快速檢測(cè)。

1 材料與儀器

1.1 材料 格列齊特(批號(hào)：100296-201004)、格列本脲(批號(hào)：100135-200404)、格列美脲(批號(hào)：100674-201102)、格列吡嗪(批號(hào)：100281-200602)、格列喹酮(批號(hào)：100280-201002)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；硝酸銀、檸檬酸三鈉、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)等試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；薄層板HSGF254(煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水；實(shí)驗(yàn)中所用的降糖中藥陰性樣品(不含非法添加成分)由山東省食品藥品檢驗(yàn)所提供。

1.2 儀器 BWS415-785H型便攜式拉曼光譜儀(必達(dá)泰克)，配有BAC151視頻顯微拉曼檢測(cè)系統(tǒng)，激發(fā)光源785 nm，分辨率3.5 cm-1@912 nm，光譜范圍175～2 700 cm-1；TG16-WS型高速離心機(jī)(上海盧湘儀)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；WFH-203B型紫外分析儀(精科實(shí)業(yè))；普析通用TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

2 方法

2.1 銀膠溶液的配制 將10 ml AgNO3與PVP(摩爾比10:1)的混合溶液加入100 ml沸騰的DMF中，其中AgNO31×10-3mol/L，繼續(xù)加熱1 min，見(jiàn)溶液由無(wú)色變?yōu)辄S綠色，最終變?yōu)辄S棕色的銀膠溶液，冷卻備用。

2.2 樣品溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液 稱(chēng)取格列本脲、格列齊特、格列美脲、格列喹酮、格列吡嗪對(duì)照品適量，加甲醇-氯仿(1:1)溶解，分別制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液備用。

2.2.2 模擬陽(yáng)性樣品溶液 取降糖類(lèi)中藥陰性樣品(不含非法添加成分)適量，研細(xì)，另精密稱(chēng)取適量降糖藥對(duì)照品加入其中，使各個(gè)成分添加量均為1%(W/W)，加甲醇-氯仿(1:1)溶解，超聲10 min，離心后取上清液，作為降糖藥的模擬陽(yáng)性樣品溶液。

2.2.3 真實(shí)樣品溶液 取降糖類(lèi)中成藥樣品各1.5 mg，研細(xì)，加甲醇1 ml溶解，超聲15 min，以10 000 r/min離心5 min后取上清液，作為真實(shí)樣品溶液備用。

2.3 檢測(cè)方法 吸取對(duì)照品溶液和模擬陽(yáng)性樣品溶液各1 μl，點(diǎn)于同一硅膠板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(9:5:1)展開(kāi)后取出，晾干，置于紫外燈(254 nm)下檢視定位，于陽(yáng)性樣品色譜條帶中與對(duì)照品Rf值相同位置處，滴加納米銀溶膠5 μl，對(duì)滴加銀膠的位置進(jìn)行檢測(cè)，放大20倍，積分時(shí)間20 s，激光功率100 mW，將所得圖譜與對(duì)照品的SERS譜進(jìn)行對(duì)比分析，得出結(jié)果。

2.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理方法 采用軟件Matlab 7.6對(duì)所得光譜進(jìn)行譜段選取( 300～1 700 cm-1)、Savitzky-Golay(Sgolay)法平滑、adaptive iteratively reweighted Penalized Least Squares(airPLS)法基線校正和歸一化等預(yù)處理；制圖軟件使用Origin 7.5。

3 結(jié)果與討論

3.1 薄層色譜條件的優(yōu)選 參照國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[13]和相關(guān)文獻(xiàn)方法[2，14]，對(duì)薄層色譜展開(kāi)條件進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)中考察了(a)氯仿-環(huán)己烷-乙醇-冰醋酸(8:13:1:1)；(b)環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(14:6:1:0.1)；(c)環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(5:5:1)的展開(kāi)情況。結(jié)果(a)、(b)體系下，分離效果均不理想，選擇較簡(jiǎn)單的(c)體系進(jìn)行調(diào)節(jié)，三者比例為9:5:1時(shí)效果較佳，格列喹酮、格列齊特、格列美脲、格列本脲、格列吡嗪的Rf值分別為0.72、0.66、0.56、0.47、0.35。

3.2 不同銀溶膠的檢測(cè)結(jié)果

3.2.1 銀溶膠的選擇與制備 采用傳統(tǒng)的檸檬酸鈉還原法制備所得銀溶膠[15,16]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，增強(qiáng)效果均較差，幾乎無(wú)增強(qiáng)信號(hào)；嘗試使用氯化鈉、硝酸鉀等凝聚劑，并換用不同濃度的銀溶膠，效果仍不理想?？赡苡捎跈z測(cè)物均為水不溶性，難以與水溶性的納米銀粒子結(jié)合形成SERS“熱點(diǎn)”，故無(wú)法產(chǎn)生較好的增強(qiáng)效應(yīng)。因此，對(duì)于這種疏水性物質(zhì)， 考慮采用有機(jī)溶劑制備的有機(jī)相的銀溶膠進(jìn)行檢測(cè)。在制備有機(jī)相納米銀溶膠時(shí)，參照文獻(xiàn)[17]、[18]，嘗試采用甲醇、乙腈、聚乙二醇、N,N-二甲基甲酰胺、四氫呋喃等溶劑制備納米銀溶膠，最終選擇以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)作為溶劑制備納米銀顆粒。DMF在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中作為溶劑與還原劑，此外，為防止納米銀粒子的團(tuán)聚，可在制備過(guò)程中加入PVP作為保護(hù)劑，達(dá)到延緩銀離子還原的效果。

3.2.2 銀溶膠的紫外表征 采用DMF作為還原劑，以PVP作為保護(hù)劑制備所得納米銀溶膠的紫外吸收光譜如圖1。其最大吸收位置只有一個(gè)，說(shuō)明所制納米銀溶膠為球型，且其最大吸收峰位于408 nm，根據(jù)文獻(xiàn)[15]推測(cè)，此處制得的納米銀直徑在50 nm左右，且半峰寬較窄，說(shuō)明納米顆粒分布較均勻。

圖1 銀溶膠的紫外表征圖譜

3.3 模擬陽(yáng)性樣品檢測(cè) 將實(shí)驗(yàn)室自行制備的模擬降糖中藥陽(yáng)性樣品按照“1.4項(xiàng)”下的方法進(jìn)行檢測(cè)，得到結(jié)果如圖2所示。以格列喹酮為例，其SERS譜中出現(xiàn)的特征峰476, 499, 527, 610, 634, 663, 679, 743, 783, 808, 821, 834, 1004, 1029, 1090, 1125, 1164, 1188, 1205, 1275, 1349, 1442, 1600, 1615 cm-1(409, 865 cm-1除外)，均可對(duì)應(yīng)于其固體樣品的拉曼光譜中的特征信號(hào)(圖3)，其中409、865 cm-1處特征信號(hào)來(lái)自于銀膠溶劑DMF(圖4)。

圖2 格列類(lèi)藥物的SERS譜(a)及其常規(guī)拉曼光譜(b)

圖3 格列喹酮的SERS譜(a)及其常規(guī)拉曼光譜(b)

圖4 空白硅膠板滴加銀溶膠的SERS譜(a)及其常規(guī)拉曼信號(hào)(b)

采用有機(jī)相銀溶膠獲得的格列類(lèi)降糖藥的SERS圖譜，含有豐富的特征信息，用于定性鑒別時(shí)準(zhǔn)確性較高，進(jìn)一步提高了本方法用于中藥摻雜該類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)的專(zhuān)屬性。

3.4 真實(shí)樣品檢測(cè) 利用建立的方法對(duì)7種真實(shí)的降糖中藥樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6號(hào)樣品中非法添加了格列美脲，與山東省食品藥品檢驗(yàn)所提供的檢測(cè)結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究所建立的檢測(cè)方法用于降糖類(lèi)中成藥中非法添加格列類(lèi)化學(xué)藥品的快速檢測(cè)時(shí)，具有靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單快速、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，在中藥摻雜快速檢測(cè)、食品安全監(jiān)控、農(nóng)藥殘留檢測(cè)等領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。

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