韓 琳，呂 超，李 敏，黃慧梅，暢婉琳，彭成成，柳潤輝 (.第二軍醫(yī)大學藥學院，上海 004；.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 5008；.上海交通大學藥學院，上海 0040)

麝香保心丸是在宋代著名方書《太平惠民和劑局方》收載的蘇合香丸的基礎上創(chuàng)新開發(fā)研制成功的現(xiàn)代中藥，具有芳香溫通、益氣通心之功效，主要用于治療心肌缺血引起的心絞痛、胸悶及心肌梗死，是目前國內(nèi)臨床上廣泛應用于治療冠心病的特效復方藥物[1]。麝香保心丸由人參提取物、麝香、蟾酥、蘇合香酯、冰片、牛黃和肉桂等7味藥材組成[2]。現(xiàn)代藥理學研究表明麝香保心丸具有抑制血清Tc及LDL-C的濃度升高，保護血管內(nèi)皮細胞和基底膜完整，抑制血管壁炎癥和內(nèi)膜增生，抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展，同時能改善心肌代謝，增強心肌能量儲備，促進DNA、RNA的合成，提高機體耐缺氧能力，增強心肌收縮力，提高血漿環(huán)腺苷酸(cAMP)水平，抑制血小板的聚集、穩(wěn)定心肌細胞膜等藥理作用[3]。

Xiang等[4]采用代謝組學方法研究了麝香保心丸對大鼠急性心肌梗死的整體藥效及作用機制，表明麝香保心丸對大鼠急性心肌梗死有治療作用，且主要通過改善心肌梗死引起的能量代謝異常、氧化損傷和炎癥等途徑對心肌梗死大鼠起到治療作用。本課題組采用血清藥物化學理論與HPLC-ESI-MS/MS和GC-MS方法相結合，分析了麝香保心丸的血中活性成分變化，共鑒定了20種血中活性成分[5,6]。本實驗采用原代心肌細胞缺氧-復氧模型，在細胞水平上對麝香保心丸及其20種血中活性成分進行抗缺氧-復氧損傷的活性篩選，進一步明確其保護心肌的藥效物質(zhì)。

1 材料

1.1 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(MCD-18M，日本)；恒溫混勻儀(Eppendorf，德國)；臺式高速離心機(Eppendorf，Centrifuge 5810，德國)；十萬分之一電子天平(Sartorious，BP 211D，德國)；氮氣罐(上海天翼氣體有限公司)；酶標儀(BioTek，ELx800，美國)。

1.2 動物 新生1～3 d的SPF級Sprague Dawley(SD)乳鼠[上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號SCXK(滬)2007-0005]。

1.3 試藥 麝香保心丸(上海和黃藥業(yè)有限公司，批號：120716)。肉桂酸、肉桂醛、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、豬去氧膽酸、去氧膽酸和膽酸7種對照品均購自中國藥品生物制品檢定所。人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1和麝香酮8種對照品均購自上海鼎瑞化工生物科技有限公司。冰片、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基和日蟾毒他靈5種對照品均購自江西南昌貝塔生物科技有限公司。

1.4 試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基、低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶(GIBCO, 美國)；雙抗(博光生物醫(yī)藥技術有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)、MTT試劑(Sigma，美國)。

2 方法與結果

2.1 原代心肌細胞的培養(yǎng) 本實驗參考了Grynberg等[7]的細胞培養(yǎng)方案：用75%乙醇給乳鼠消毒后放進超凈臺，用剪刀在乳鼠胸腔下方2根肋骨之間剪開，輕輕擠壓心臟自動蹦出，再剪取心尖并用4℃ 預冷的PBS將心尖上的殘血洗凈并將心尖均勻剪碎。加入0.08%的胰蛋白酶置于混勻儀中以37℃、450 r/min震蕩消化心臟組織7 min。第1次消化的上清液棄去，從第2次開始到心臟組織消化完全后，將每次收集到的上清液加入到含有20% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中以終止消化。最終收集總的上清液在離心機中以1 500 r/min離心10 min，并收集心肌細胞將其轉移到培養(yǎng)皿中，然后放于二氧化碳培養(yǎng)箱中差速貼壁90 min后再將細胞懸液取出，混勻后計數(shù)。在第2～4天換液時在培養(yǎng)基中加入0.1 mmol/L的5-溴尿嘧啶以抑制成纖維細胞的生長，通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)(圖1)。

2.2 缺氧-復氧模型的建立 取長勢良好的心肌細胞用于實驗，以106個/ml的密度接種到96孔板中，每孔100 μl，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后換液，換液后72 h用于實驗。建立缺氧-復氧模型時模型組的培養(yǎng)液換成不含F(xiàn)BS的低糖培養(yǎng)基，并將二氧化碳培養(yǎng)箱的環(huán)境改成95% N2和5% CO2。在此環(huán)境下缺氧數(shù)小時后，再將培養(yǎng)液換回含20% FBS的高糖培養(yǎng)基，并回到正常條件(即95% 空氣和5% CO2，37℃)下的二氧化碳培養(yǎng)箱中復氧數(shù)小時。參考文獻資料，對缺氧-復氧的時間進行了摸索，分別是缺氧3 h復氧2 h(H3/R2)[8]，缺氧5.5 h復氧12 h(H5.5/R12)[9]以及缺氧4 h復氧12 h(H4/R12)。缺氧-復氧結束后，每孔加5 mg/ml MTT 溶液10 μl，然后在碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，再將含有MTT的培養(yǎng)基棄去，每孔加入DMSO 150 μl，避光振搖10 min，使結晶充分溶解后用酶標儀測570 nm下每孔的消光度值(OD值)。數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行獨立樣本t檢驗。細胞存活率(%)=造模組OD平均值/正常組OD平均值×100%。所得結果如表1所示，最終選擇H4/R12作為造模條件。

圖1 培養(yǎng)5 d后10×20顯微鏡視野里觀察到的心肌原代細胞

表1 H3/R2、H5.5/R12和H4/R12造模對比(n=48)

2.3 麝香保心丸對缺氧-復氧心肌細胞的保護作用 將麝香保心丸研磨成細粉狀，精密稱取4 g，用甲醇32 ml 加二氯甲烷16 ml 再加去離子水4 ml配成的混合溶劑超聲提取30 min，抽濾提取液并收集濾液，在55 ℃下旋轉蒸發(fā)制得麝香保心丸浸膏并于4℃密封保存。臨用前精密稱取2 mg，用DMSO 20 μl助溶，然后加入培養(yǎng)基配制成500 μg/ml的母液。將母液分別稀釋成30、50、100 150 μg/ml的工作液。造模前1 h給藥，各組之間平行操作。給藥組和模型組缺氧4 h復氧12 h，造模結束后，每孔加5 mg/ml MTT 溶液10 μl，在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，然后將含有MTT的培養(yǎng)基棄去，并在每孔中加入DMSO 150 μl，避光振搖10 min，使結晶充分溶解后用酶標儀測570 nm下每孔的OD值。并用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，結果如圖2所示，30、50、100、150 μg/ml均為麝香保心丸的有效劑量，其中在50 μg/ml的劑量下具有較好的抗心肌細胞缺氧-復氧損傷作用。

圖2 不同濃度的麝香保心丸對缺氧復氧心肌細胞存活率的影響

2.4 麝香保心丸中入血成分抗心肌細胞缺氧-復氧損傷的活性篩選 將20個入血成分精密稱取一定量，并將每個成分配成250 μmol/L的母液，分別稀釋成1、10、50 μmol/L的工作液。造模前1 h給藥，各組之間平行操作。給藥組和模型組缺氧4 h復氧12 h，空白組在正常條件下培養(yǎng)。造模結束后每孔加5 mg/ml MTT 溶液10 μl，在碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，然后將含有MTT的培養(yǎng)基棄去，每孔加入DMSO 150 μl，避光振搖10 min，使結晶充分溶解后用酶標儀測570 nm下每孔的OD值。數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析，結果如圖3所示。20種人血活性成分中有4種成分具有顯著的保護心肌細胞缺氧-復氧損傷的作用，其中人參皂苷Rb1 在10 、50 μmol/L時具有顯著的保護作用；人參皂苷Rb2 在50 μmol/L時顯示有較強的保護作用；蟾毒靈和麝香酮在3個濃度下都具有保護心肌細胞缺氧-復氧損傷的作用，且在10、50 μmol/L時效果最佳。

3 討論

本研究采用原代心肌細胞建立缺氧-復氧模型，并對麝香保心丸及其20種人血中活性成分進行抗心肌細胞缺氧-復氧損傷保護作用的篩選。研究結果表明，麝香保心丸在50 μg/ml的劑量下具有較好的抗心肌細胞缺氧-復氧損傷的作用；20種人血中活性成分中人參皂苷Rb1、Rb2、蟾毒靈和麝香酮具有明顯的保護心肌細胞缺氧-復氧損傷作用，提示這4種成分是麝香保心丸中保護心肌細胞缺氧-復氧損傷的主要有效物質(zhì)。其中已有實驗研究表明，人參皂苷Rb1和麝香酮具有保護心肌細胞損傷的作用[10-12]，與筆者的研究結果一致。本研究初步明確了麝香保心丸在細胞水平具有保護心肌細胞損傷的作用及藥效物質(zhì)，為進一步研究其作用機制提供了依據(jù)。

圖3 不同濃度的人參皂苷Rb1、Rb2、蟾毒靈和麝香酮對缺氧復-氧心肌細胞存活率的影響

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