吳希珠， 鄭曉春， 陳小琳， 陳江湖， 李榮鋼， 鄭官林， 盧 歡

(1福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床學(xué)院, 2福建省婦幼保健院麻醉科, 3福建省立醫(yī)院麻醉科，福建 福州 350001)

胎兒宮內(nèi)窘迫常需要盡快結(jié)束妊娠來改善新生兒氧合，其缺氧/復(fù)氧過程存在缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)損傷，這也是新生兒缺氧缺血性腦病的主要病因。肢體缺血預(yù)處理(limb ischemia preconditioning，LIP)可通過機(jī)體內(nèi)源性機(jī)制減輕遠(yuǎn)隔臟器如心、腦、肺等的缺氧/復(fù)氧損傷[1-2]。本研究在胎兒宮內(nèi)窘迫后，對孕鼠(母體)行LIP預(yù)處理，以胎鼠(子體)為研究目標(biāo)，觀察母體LIP能否減輕宮內(nèi)窘迫胎鼠娩出復(fù)氧后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。因凋亡相關(guān)Bcl-2家族成員通過線粒體途徑參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控，本實驗定性并定量研究了海馬CA1區(qū)促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，以期為臨床缺氧缺血性腦病的防治提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 動物

清潔級成年SD大鼠16只，其中雌性12只，雄性4只，體重250～280 g，由福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[實驗動物許可證號：SYXK(閩)2012-0002]。按雌3/雄1于前1 d晚合籠，次日晨8點陰道涂片檢查法確定交配后即可確定為孕 1 d，孕19 d時進(jìn)行實驗。

2 模型構(gòu)建

2.1胎鼠宮內(nèi)窘迫(fetal distress，F(xiàn)D)模型構(gòu)建 取孕19 d大鼠麻醉后下腹正中切開，暴露宮角，以無損傷小動脈夾于近子宮處鉗夾雙側(cè)子宮動靜脈和卵巢動靜脈，阻斷子宮胎盤血供致胎鼠宮內(nèi)窘迫，15 min后松開動脈夾，將子宮還納入腹腔, 逐層縫合。

2.2LIP模型構(gòu)建 以止血帶法在母體右側(cè)腹股溝處同側(cè)阻斷下肢血流(脈搏氧飽和度監(jiān)測)，阻斷/開放各5 min，循環(huán)3次進(jìn)行母體LIP。

3 實驗分組

孕鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組?？瞻讓φ?sham,S)組：僅暴露通向子宮和卵巢的動靜脈但不阻斷；LIP組：于母鼠右下肢實施LIP，余同S組；FD組：阻斷子宮和卵巢的動靜脈15 min后松開；LIP +FD組：阻斷通向子宮和卵巢的動靜脈的同時，行母鼠右下肢LIP。

4 取材及標(biāo)本處理

取材對象為胎鼠。孕鼠(母體)均多胎妊娠，實驗后48 h剖宮產(chǎn)，每只孕鼠隨機(jī)取活胎鼠4只，每組12只，均斷頭取全腦。每組取6只胎鼠視交叉后1 mm和4 mm處冠狀面切開，取中間塊固定、脫水、浸蠟、包埋后連續(xù)切片，片厚3 μm，取相鄰切片分別進(jìn)行HE染色、TUNEL法凋亡細(xì)胞原位染色以及Bcl-2、Bax的免疫組化原位染色。每組另取6只胎鼠新鮮的海馬組織，Western blotting法檢測Bcl-2和Bax蛋白水平。

5 主要方法

5.1CA1區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察 HE染色，光鏡(×400)下觀察。

5.2CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元的檢測(TUNEL法) TUNEL凋亡試劑盒購自羅氏公司，參照試劑盒說明操作。光鏡(×400)下觀察胎鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元，選取5個不同視野，分辨TUNEL陽性細(xì)胞, 分別計算凋亡指數(shù)：陽性細(xì)胞數(shù)/(陽性細(xì)胞數(shù)+陰性細(xì)胞數(shù))×100%，取平均值。

5.3Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的免疫組化法檢測 試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。按試劑盒說明操作。在光鏡(×400)下觀察胎鼠海馬CA1神經(jīng)元。

5.4Western blotting 檢測Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá) Ⅰ抗、Ⅱ抗購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。在12%SDS-PAGE凝膠吸取待測樣品30 μg電泳，60 V積層膠30 min再100 V電泳分離蛋白。采用Trans-Blot轉(zhuǎn)印儀常規(guī)將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，10%脫脂奶粉封閉后加入抗體(1∶300抗鼠Bcl-2或Bax)孵育1 h，過氧化物酶標(biāo)記檢測抗原抗體復(fù)合物。自動電泳凝膠成像分析儀上分析結(jié)果。

6 統(tǒng)計學(xué)處理

各組凋亡細(xì)胞、凋亡指數(shù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析，方差齊采用LSD-t檢驗，方差不齊采用Dunnett’s檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理。

結(jié) 果

1 HE染色結(jié)果

各組均可見海馬完整的橫切面結(jié)構(gòu)，S組和LIP組細(xì)胞排列緊密，胞核大而圓，可見核仁；FD組和LIP+FD組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列較稀疏，部分細(xì)胞胞體縮小,見圖1。

Figure 1. Effects of maternal limb ischemic preconditioning (LIP) on CA1 hippocampal neurons in fetal rats (HE staining, ×400).S：sham; FD: fetal distress.

2 TUNEL染色結(jié)果

各組均見凋亡的神經(jīng)元細(xì)胞，細(xì)胞核呈深棕色，染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體,見圖2。與S組比較，F(xiàn)D組胎鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)增加(P<0.01)，LIP組胎鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)無明顯改變(P>0.05)，LIP+FD組凋亡指數(shù)增加(P<0.05)；與FD組比較，LIP+FD組細(xì)胞凋亡指數(shù)降低(P<0.05)，見表1。

Figure 2. The apoptotic hippocampal neurons in fetal rats detected by TUNEL assay (×400).S: sham;LIP:limb ischemic preconditioning;FD: fetal distress.

表1 母體LIP對胎鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

3 免疫組化法染色結(jié)果

在Bcl-2和Bax的免疫組化切片中，各組均可見胞漿陽性染色，呈棕褐色,見圖3、4。

4 Western blotting 檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)

與S組比較，F(xiàn)D組和LIP+FD組的Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-2/Bax的比值降低，而LIP組的Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax的比值無明顯改變(P>0.05)；與FD組比較，LIP+FD組Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的比值增加,見圖5。

Figure 3. The protein expression of Bcl-2 in hippocampal neurons of fetal rats detected by immunohistochemical method (DAB staining，×400).

Figure 4. The protein expression of Bax in hippocampal neurons of fetal rats detected by immunohistochemical method (DAB staining, ×400).

Figure 5. The protein expression of Bcl-2 and Bax in hippocampal neurons of fetal rats determined by Western blotting. β-actin was used as loading control. Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs S; #P<0.05 vs FD.

討 論

本研究通過阻斷孕鼠雙側(cè)子宮和卵巢的動靜脈成功復(fù)制了胎鼠宮內(nèi)窘迫模型，胎鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象；同時在宮內(nèi)窘迫模型的基礎(chǔ)上在母體實施LIP，胎鼠海馬神經(jīng)元的凋亡減輕，Bcl-2蛋白的表達(dá)上調(diào)。文獻(xiàn)報道，全身性的低氧預(yù)處理可緩解缺血再灌注后新生鼠腦皮質(zhì)和海馬組織的丟失，改善腦的微循環(huán)[3]。相對于全身性的缺氧預(yù)處理，在本實驗中，我們采用母體的LIP，但仍然觀察到了LIP的腦保護(hù)作用，且與抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)相關(guān)。

LIP通過四肢等更能耐受缺血的臟器進(jìn)行缺氧預(yù)處理可以減輕遠(yuǎn)隔臟器如腦、心臟、肝等的再灌注損傷，其對臟器保護(hù)作用的可行性和有效性，在臨床試驗中不斷得到肯定[1]。Btker等[4]將LIP應(yīng)用于臨床心梗病人經(jīng)皮冠脈支架植入術(shù)的研究，發(fā)現(xiàn)心肌存活率增加。胎兒宮內(nèi)窘迫/剖宮娩出可類比心肌梗塞后/支架植入再通，同樣存在缺血/再灌注損傷的病理過程。LIP能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，其中循環(huán)和/或神經(jīng)系統(tǒng)是器官間信號傳導(dǎo)通路。在體的胎鼠與母體通過胎盤屏障和血液系統(tǒng)存在物質(zhì)交換。孕后期胎盤屏障通透性增加，研究報道分子量為169的谷氨酸鈉不但可通過孕鼠的胎盤屏障還能透過胎鼠的血腦屏障，而一氧化氮(nitric oxide,NO)分子量僅30，還具有高脂溶性，可快速透過生物膜擴(kuò)散。在LIP遠(yuǎn)隔臟器保護(hù)效應(yīng)的研究中，較多文獻(xiàn)肯定了NO在快速保護(hù)相中的第一信使角色，據(jù)此推測在孕鼠LIP對胎鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制中可能扮演重要角色。低濃度的NO能通過促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2和熱休克蛋白70的表達(dá)以及抑制胱天蛋白酶家族的作用來抑制細(xì)胞的凋亡[5]。而外源性Bcl-2反義寡脫氧核苷酸下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)的同時，阻斷了腦缺血預(yù)處理的腦保護(hù)作用[6]。因此本實驗中，母體的LIP可能通過產(chǎn)生低濃度的NO透過胎盤屏障促進(jìn)了胎鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)，從而減輕了宮內(nèi)窘迫胎鼠復(fù)氧后海馬神經(jīng)元的凋亡。

綜上所述，本研究在胎鼠急性缺氧期間，在母體實施LIP預(yù)處理，信號分子能通過胎盤屏障激發(fā)胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，減輕了胎鼠復(fù)氧后海馬神經(jīng)元的凋亡，其中機(jī)制可能與上調(diào)了胎鼠海馬CA1區(qū)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)相關(guān)，進(jìn)一步的研究中將對新生鼠的學(xué)習(xí)記憶能力等行為學(xué)深入探討。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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