余 莉，董文斌

（1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院新生兒科，四川瀘州 646000；2.重慶市永川區(qū)人民醫(yī)院兒科 402160）

高氧肺損傷是搶救危重新生兒的主要并發(fā)癥之一，存活早產(chǎn)兒甚至出現(xiàn)肺發(fā)育障礙［1］，如病死率很高的支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia BPD）是造成早產(chǎn)兒致殘和死亡的重要原因之一（30%～40%）。高氧是BPD形成的主要因素，高氧肺損傷時調(diào)控細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)因子可能改善早產(chǎn)兒高氧肺損傷。大量研究證實(shí)，動力相關(guān)蛋白（dynamin related protein 1，DRP1）和視神經(jīng)萎縮癥蛋白（optic atrophy 1，OPA1）在肺損傷中具有重要的意義，DRP1是介導(dǎo)線粒體分裂的因子，DRP1表達(dá)增強(qiáng)致線粒體持續(xù)分裂引起細(xì)胞凋亡［2］。OPA1是介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜融合及穩(wěn)定線粒體的分子。本研究在前期建立早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷模型的基礎(chǔ)上，研究DRP1／OPA1在早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 早產(chǎn)Wistar大鼠48只隨機(jī)分為對照組（吸入氧體積分?jǐn)?shù)為21%）和高氧組（吸入氧體積分?jǐn)?shù)為95%）。

1.2 模型制備 參照本課題前期建立高氧肺損傷動物模型的方法［3］。高氧組置于95%氧箱中，對照組置于同一室內(nèi)21%氧的空氣中。兩組相同喂養(yǎng)1、3、7d時分批斷頸放血處死后取肺組織，固定包埋，切片作蘇木精－伊紅（HE）染色觀察肺組織的病理變化，免疫組織化學(xué)觀察DRP1／OPA1在肺組織的表達(dá)與分布，末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）法檢測細(xì)胞凋亡。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 實(shí)驗(yàn)材料：DRPl多克隆抗體（兔抗鼠）購自abcam公司；OPAl多克隆抗體（兔抗鼠）購自R＆D公司；原位凋亡檢測試劑盒：瑞士羅氏公司；SP法免疫組化試劑盒：中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。主要實(shí)驗(yàn)儀器：微量加樣槍、超低溫冰箱、倒置相差顯微鏡、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、壓力蒸氣滅菌器、低溫高速離心機(jī)、激光共聚焦顯微鏡、數(shù)字智能測氧儀。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 肺組織切片HE染色觀察比較肺組織病理變化。

1.4.2 免疫組化SP法檢測DrP1／OPA1在肺組織的表達(dá)SP法嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，陽性反應(yīng)為胞質(zhì)染成棕黃色或黃褐色。結(jié)果判定：Image－pro 6.0圖像分析軟件分析圖像，每張切片在400倍視野下隨機(jī)選取6個非重疊視野，測定其平均光密度值（Average optical density，AOD），算出平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.3 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，陽性反應(yīng)為細(xì)胞核染成黃色或棕黃色。結(jié)果判定：每張切片在400倍視野下隨機(jī)選6個非重疊視野，計(jì)數(shù)的方式得出每個視野凋亡細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，算出凋亡指數(shù)，最后求平均值。凋亡指數(shù)（Apoptotic index，AI）＝凋亡細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 在光鏡下觀察，對照組大鼠肺組織細(xì)胞緊密排列，呈鋪鵝卵石樣改變，透明度好，分裂相明顯，囊泡壁厚，胞質(zhì)中顆粒稀少有粗大的嵴突。高氧組大鼠肺組織細(xì)胞數(shù)量隨時間（1、3、7 d）較對照組顯著減少，細(xì)胞形態(tài)改變不規(guī)則，肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，胞質(zhì)中出現(xiàn)較多空泡、炎性細(xì)胞、顆粒物聚集，細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞碎片大量填充其間，上皮細(xì)胞腫脹間隔增粗肺泡腔變小，見圖1。

2.2 DRP1和OPA1在肺組織的表達(dá)與分布 免疫組化SP檢測，各實(shí)驗(yàn)組肺組織細(xì)胞胞質(zhì)均有表達(dá)。與對照組相比，高氧暴露時間越長，高氧組DRPl的表達(dá)（OD值）明顯增加，OPAl的表達(dá)（OD值）明顯降低，DRP1／OPA1比值明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1～3。

2.3 TUNEL檢測凋亡結(jié)果 對照組在各時間點(diǎn)仍然可見少量被染成黃色或棕黃色的TUNEL陽性細(xì)胞，高氧組則隨著高氧暴露時間延長，AI呈逐漸增高趨勢，可見大量TUNEL陽性細(xì)胞出現(xiàn)在支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表4。

2.4 細(xì)胞凋亡與DRP1／OPA1蛋白表達(dá)比值的相關(guān)分析 早產(chǎn)鼠肺組織細(xì)胞凋亡分別與DRP1／OPA1蛋白表達(dá)的直線相關(guān)，細(xì)胞AI和DRP1／OPA1比較，r＝0.725，P＜0.01，提示呈顯著正相關(guān)。

圖1 肺組織病理學(xué)形態(tài)改變（×100）

表1 早產(chǎn)鼠肺組織DRP1的表達(dá)（，n＝6）

表1 早產(chǎn)鼠肺組織DRP1的表達(dá)（，n＝6）

a：P＜0.05，與同時間點(diǎn)對照組比較；b：P＜0.05，與同組1d比較；c：P＜0.05，與同組3d比較。

組別 1d 3d 7d 39 0.872高氧組 1634.57±108.85a 8008.14±530.26ab 13132.32±594.57abc 615.8260.000 t 4.324 12.152 26.444 P F P對照組 789.86±58.95 772.31±42.82 770.39±67.84 0.10.005 0.000 0.000

表2 早產(chǎn)鼠肺組織OPA1的表達(dá)（，n＝6）

表2 早產(chǎn)鼠肺組織OPA1的表達(dá)（，n＝6）

a：P＜0.05，與同時間點(diǎn)對照組比較；b：P＜0.05，與同組1d比較；c：P＜0.05，與同組3d比較。

組別 1d 3d 7d.34 0.501 0.622高氧組 3126.91±264.91a 1399.81±268.62ab 579.76±99.20abc 133.31 0.000 t 13.648 27.203 41.315 P F P對照組 3935.42±263.99 3764.15±281.53 3907.80±2310.000 0.000 0.000

表3 線粒體分裂蛋白DRP1和融合蛋白OPA1比值變化（，n＝6）

表3 線粒體分裂蛋白DRP1和融合蛋白OPA1比值變化（，n＝6）

a：P＜0.05，與同時間點(diǎn)對照組比較；b：P＜0.05，與同組1d比較；c：P＜0.05，與同組3d比較。

組別 1d 3d 7d F P對照組 0.200±0.01 0.205±0.01 0.197±0.01 3.303 0.084高氧組 0.52±0.01a 5.72±0.05ab 22.68±0.07abc 1694000.000 t 63.737 212.235 541.772 P 0.000 0.000 0.000

表4 各組早產(chǎn)鼠肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)（，n＝6）

表4 各組早產(chǎn)鼠肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)（，n＝6）

a：P＜0.05，與同時間點(diǎn)對照組比較；b：P＜0.05，與同組1d比較；c：P＜0.05，與同組3d比較。

組別 1d 3d 7d F P對照組 14.54±1.88 14.68±2.01 14.45±1.75 0.036 0.943高氧組 26.39±1.25a 43.87±1.62ab 56.34±1.56abc 517.7000.000 t 261.25 724.87 1958.56 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3 討 論

長時間吸入高氧可引起多器官功能衰竭，肺是高氧后最常受累的器官之一。細(xì)胞凋亡是高體積分?jǐn)?shù)氧導(dǎo)致肺損傷的一個十分明顯的組織學(xué)特點(diǎn)，細(xì)胞凋亡在高氧肺損傷發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色，細(xì)胞凋亡與肺損傷的程度呈正相關(guān)。線粒體分裂是細(xì)胞凋亡的早期事件，研究表明DRP1和OPA1蛋白分別是調(diào)節(jié)線粒體分裂融合的關(guān)鍵蛋白，通過持續(xù)對立的融合分離來維持動態(tài)平衡［3－4］。

3.1 線粒體形態(tài)和細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡的主要途徑是線粒體途徑。細(xì)胞凋亡的早期，線粒體融合和分裂失衡管網(wǎng)狀線粒體崩潰成為點(diǎn)泡狀，線粒體片段化改變，線粒體膜間隙釋放促凋亡蛋白造成線粒體數(shù)量增加，線粒體碎裂明顯。研究證實(shí)，在細(xì)胞凋亡的早期，線粒體分離，形態(tài)變化；抑制線粒體的分離，促進(jìn)線粒體融合可能抑制細(xì)胞凋亡［5－6］，說明線粒體分離和融合平衡導(dǎo)致線粒體形態(tài)變化，和細(xì)胞凋亡有關(guān)。線粒體形態(tài)改變：線粒體膜改變，線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔（mitocho－ndrial permeability transition pore mtPTP）開放，死亡促進(jìn)因子（deathepromoting factor DPF）和膜間隙蛋白 （intermembrane space IMS）經(jīng)mtPTP釋放，IMS活化Caspase，促進(jìn)凋亡；線粒體釋放多種凋亡誘導(dǎo)因子到細(xì)胞質(zhì)中，線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活凋亡的半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶Caspase（cysteingl aspartate specific protease）酶通路，黃素蛋白AIF核片段化又改變線粒體膜通透性，促凋亡因子同樣激活Caspase，凋亡誘導(dǎo)因子能促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放；機(jī)體處于高氧狀態(tài)時活性氧在線粒體中大量產(chǎn)生，活性氧族作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子誘發(fā)凋亡信號傳導(dǎo)途徑，活化核轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因?qū)е录?xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)隨著高氧暴露時間的延長，高氧組細(xì)胞形態(tài)改變不規(guī)則，肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯；高氧組可見大量黃色或棕黃色的TUNEL陽性細(xì)胞出現(xiàn)。暴露高氧時間越長，TUNEL陽性細(xì)胞越多，細(xì)胞凋亡指數(shù)增高，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示吸入高濃度氧可以誘導(dǎo)早產(chǎn)鼠肺組織發(fā)生細(xì)胞凋亡。

3.2 DRPl、OPAl與線粒體形態(tài)變化

3.2.1 DRPl與線粒體分離 DRPl在線粒體外膜潛在分裂點(diǎn)聚集使線粒體分散，產(chǎn)生片段化的線粒體，線粒體數(shù)量增加，誘導(dǎo)膜間隙釋放促凋亡蛋白。超表達(dá)DRP1分子加速線粒體分裂［7］，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［8－9］，抑制 DRP1 表達(dá)可以降低凋亡，降低線粒體分裂［10－12］。本研究顯示高氧組DRP1表達(dá)較對照組顯著增加，證實(shí)高氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中，DRP1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)線粒體分離導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

3.2.2 OPA1與線粒體融合 OPA1以寡聚體穩(wěn)定線粒體的嵴結(jié)構(gòu)，減輕細(xì)胞凋亡起到重要作用［13］。抑制OPA1表達(dá)融合能力的降低，線粒體片段化改變，線粒體嵴減少，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡［14－15］。相反，高表達(dá)OPA1，誘導(dǎo)線粒體形態(tài)發(fā)生網(wǎng)絡(luò)化［16］，縮小線粒體嵴膜連接，抑制膜間蛋白的釋放，抑制細(xì)胞色素C的釋放，抑制細(xì)胞凋亡。本研究組OPA1表達(dá)較對照組顯著減少，從而證實(shí)高氧導(dǎo)致肺損傷細(xì)胞凋亡過程中，抑制線粒體融合蛋白OPA1表達(dá)導(dǎo)致線粒體融合減少促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

3.3 DRP1／OPA1比值變化致線粒體形態(tài)改變與細(xì)胞凋亡 線粒體分裂增強(qiáng)，線粒體融合抑制或者兩者共同作用線粒體片段化改變，線粒體碎裂增強(qiáng)，形態(tài)改變導(dǎo)致線粒體功能異常促進(jìn)細(xì)胞凋亡。發(fā)現(xiàn)線粒體碎裂增強(qiáng)，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)增多，提示線粒體形態(tài)變化與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。凋亡誘導(dǎo)物在增強(qiáng)線粒體分裂蛋白DRP1表達(dá)同時抑制線粒體融合蛋白OPA1表達(dá)，導(dǎo)致線粒體融合和分裂失衡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

總之，本研究證實(shí)了高氧導(dǎo)致早產(chǎn)大鼠肺組肺損傷，發(fā)現(xiàn)高氧后涉及上調(diào)DRP1的表達(dá)水平，促進(jìn)線粒體分離；下調(diào)OPA1的表達(dá)水平，抑制線粒體融合導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。提示DRP1／OPA1在肺損傷時發(fā)揮重要作用，可以抑制DRP1，激活OPA1來改善高氧致肺損傷，降低細(xì)胞凋亡，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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