楊 洋，于 爽，徐曉陽(yáng)，曹雪峰，羅永久，任志華，鐘志軍，彭廣能

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 動(dòng)物疫病與人類(lèi)健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 雅安 625014)

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)為豬上呼吸道中的一種共棲菌，只在特定條件下侵入機(jī)體引起嚴(yán)重的全身性疾病[1]。區(qū)分臨床中分離的HPS是“常駐菌”還是“致病菌”對(duì)HPS 病的診斷和控制尤為重要。“常駐菌”或“致病菌”特性的分析需要利用血清學(xué)以及基因分型技術(shù)。分型技術(shù)的優(yōu)劣取決于方法的鑒定能力、重復(fù)性、花費(fèi)時(shí)間以及成本等。對(duì)細(xì)菌菌型的鑒定有著不同的應(yīng)用，地方流行病學(xué)中用判定一次疫情暴發(fā)涉及的菌株數(shù)量，而全球流行病學(xué)則關(guān)注特定菌株與其他地區(qū)以及不同時(shí)間分離株間的關(guān)系。因此，地方流行病學(xué)需要確定疾病暴發(fā)的病原菌為一株還是多株引起，或者在持續(xù)感染情況下確定是否由一種強(qiáng)毒株引起感染。全球流行病學(xué)則通過(guò)研究不同地區(qū)菌株間關(guān)系，分析菌株的全球分布以及導(dǎo)致分布差異的原因[1]。

HPS分離株在毒力、表型以及基因型特征等均表現(xiàn)出高度的異質(zhì)性[1-2]。各地區(qū)分離株的血清型不同，毒力差異也較大。除血清型差異，同一種血清型不同地區(qū)分離株也存在毒力差異。而至今沒(méi)有一種分型技術(shù)能夠區(qū)分HPS分離株毒力以及對(duì)其準(zhǔn)確的分型。本文就近年來(lái)血清學(xué)以及基因分型技術(shù)在HPS 病的流行病學(xué)以及毒力鑒定中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，為HPS分型、毒力鑒定以及流行病學(xué)研究等提供參考。

1 血清分型在HPS流行病學(xué)以及毒力鑒定中的應(yīng)用

目前HPS 分為15 個(gè)血清型，各血清型之間的毒力存在很大差異，另有20 % 以上的分離株血清型未知。研究表明，血清型1、2、4、5、12、13 和14 以及不能分型的非典型菌株常分離于全身組織器官，而血清型3 和一些非典型株常分離于上呼吸道[3]。雖然血清型與毒力間存在一定的相關(guān)性，但也不盡然，因?yàn)榧幢闶峭谎逍偷牟煌暌部杀憩F(xiàn)出不同毒力。此外，不同血清型甚至同一血清型間的交叉保護(hù)力也存在差異或難以預(yù)料。

不同國(guó)家和地區(qū)流行的HPS血清型存在差異。采用免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)血清型4、5、12 和13 型在我國(guó)部分地區(qū)流行[4]。儲(chǔ)岳峰等研究表明，菌株分離地區(qū)流行多血清型，4、5、12 型和不能分型菌株(含交叉反應(yīng)菌株)為主要血清型，血清型13、10 和14 次之[5]。國(guó)外研究表明，美國(guó)、日本和西班牙等以血清4、5 型為主，德國(guó)以血清2、4 型最為流行，丹麥和澳大利亞以血清5、13 型為主。最近一項(xiàng)研究表明，北美地區(qū)流行的HPS血清型正在發(fā)生變化。血清4 型和一些不能分型菌株正逐漸流行，而血清5 型逐漸減少，并且血清學(xué)不能分型的菌株數(shù)量大量增加[2]。表明HPS在各地的流行株正在發(fā)生改變。

HPS的血清型已被普遍作為毒力標(biāo)志。SPF 豬腹腔內(nèi)接種血清型1、5、10、12、13 和14 后，在4 d 內(nèi)豬發(fā)病或死亡，這些菌株歸為高毒力菌株；血清型2、4 和15 接種后引起多發(fā)性漿膜炎但不致死，這些菌株歸為中等毒力株；其它血清型(3、6、7、8、9 和11)接種SPF 豬后不引起臨床癥狀，被認(rèn)為無(wú)毒力[6]。對(duì)HPS分離株研究表明，分離于呼吸道和體內(nèi)組織的HPS，血清型2、4、5、12、13 和14 在數(shù)量上大致相等[1-2]。最近北美的流行病學(xué)調(diào)查表明，體內(nèi)分離的可疑致病性HPS為血清型1、2、4、5、12、13 和14 或者無(wú)法分型[3]。從健康豬上呼吸道分離的菌株在遺傳上為同源(不同于分離自體內(nèi)組織的細(xì)菌)，并且以血清型3 和無(wú)法分型菌株為主[3]。全國(guó)8 個(gè)省份主要流行菌株均為高毒力或中等毒力菌株，結(jié)合臨床資料分析，全身性組織器官中HPS 分離率(45/62)明顯高于呼吸系統(tǒng)組織中HPS 分離率(17/62)[5]。從全身性感染部位分離的菌株具致病性，而從呼吸道分離的菌株致病性有待確定。所以臨床分離HPS 時(shí)應(yīng)選擇全身性組織器官而非呼吸系統(tǒng)組織。Zhang 等研究表明，血清型5 和4 是流行菌株，分別占23 %和17 %，不可分型菌株占20 %[7]。有研究采用豚鼠試驗(yàn)對(duì)分離株進(jìn)行毒力株和非毒力株篩選，然后研究毒力菌株以及非毒力菌株對(duì)斷奶仔豬的毒力和致病性。結(jié)果表明，臨床發(fā)病豬場(chǎng)分離的HPS接種6 周齡HPS 抗體陰性商品斷奶仔豬，可以使豬在4 d 內(nèi)發(fā)病和死亡，但各血清型間以及同一血清型不同菌株間毒力存在差異。血清5 型毒力強(qiáng)于4 型和12 型，仔豬感染4 型、12型強(qiáng)毒株死亡數(shù)高于其弱毒株，但豚鼠試驗(yàn)篩選出的血清5 型強(qiáng)毒株和弱毒株對(duì)仔豬毒力無(wú)明顯差異。3 個(gè)血清型強(qiáng)毒株均造成仔豬24 h 內(nèi)急性死亡，急性死亡豬無(wú)明顯病理變化，但超過(guò)24 h 死亡豬，均可見(jiàn)典型臨床癥狀和病理變化[8]。

HPS的15 種血清型標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)表明，血清型1、2、5、10、12、13 和14 接種BALB/c 小鼠死亡數(shù)最多，證明這7 個(gè)血清型毒力強(qiáng)；血清型4、15 接種BALB/c 小鼠死亡較少，顯示這兩個(gè)血清型毒力次之；血清型3、6、7、8、9 和11 接種BALB/c 小鼠均未死亡，表明這幾個(gè)血清型毒力弱[9]。該結(jié)果與國(guó)外研究基本相符。Kielstein 等證明，血清型2 為中等毒力菌株，而在賀云霞的研究中顯示血清型2 為強(qiáng)毒株，分析結(jié)果不一致的原因可能與菌株活力以及使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)[6]。

以上的研究均表明，血清型與毒力間雖然存在一定相關(guān)性，但二者并非簡(jiǎn)單的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。因?yàn)榧幢阃谎逍偷牟煌暌部杀憩F(xiàn)出不同毒力。同時(shí)臨床中還存在部分毒力較強(qiáng)菌株采用血清學(xué)不能分型。在流行病學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)血清學(xué)分型不能提供足夠的分辨力，大概15 %～41 %分離株不能用血清學(xué)分型。巴西國(guó)內(nèi)分離菌株分析表明，以高毒力血清型5、13 和14 以及血清4 型為主，其中血清型4 占到26 %，39 %的菌株不能分型[10]。這些都表明血清分型在流行病學(xué)中對(duì)細(xì)菌分型存有局限性。

2 基因分型技術(shù)在HPS流行病學(xué)以及毒力鑒定中的應(yīng)用

大量研究表明，血清分型法不能很好的對(duì)HPS 臨床分離株進(jìn)行分型。目前，HPS 中毒力有關(guān)基因分型技術(shù)主要包括腸桿菌基因間重復(fù)序列PCR(ERIC-PCR)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR(RFLP-PCR)、多位點(diǎn)序列分型(MLST)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)、單基因座序列分型等。但這些技術(shù)都必須通過(guò)大量臨床分離株驗(yàn)證其在毒力鑒定中的分辨能力。

2.1 ERIC-PCR ERIC-PCR 技術(shù)根據(jù)非編碼區(qū)重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增細(xì)菌基因組中未知序列并產(chǎn)生具有菌株特異性的指紋圖譜而區(qū)分不同型細(xì)菌。該技術(shù)的特點(diǎn)是細(xì)菌基因組進(jìn)化中由于缺失以及插入一些移動(dòng)元件而形成。由于ERIC-PCR 技術(shù)具有及時(shí)、價(jià)廉、能追溯感染源頭和對(duì)引起疫情涉及的不同型菌株數(shù)量進(jìn)行確認(rèn)等特點(diǎn)，非常適合對(duì)HPS 病疫情暴發(fā)的診斷。

研究表明，從全身性組織分離的Hps 指紋圖譜表明均來(lái)源于同一型菌株，而與分離于其它非全身性組織或標(biāo)準(zhǔn)株的指紋圖譜不一致。并且只有少部分菌株與疾病暴發(fā)有關(guān)，并且與暴發(fā)疾病有關(guān)的菌株圖譜與上呼吸道分離的菌株圖譜不一致。同樣，關(guān)于全身性組織分離的HPS 與分離自肺部的菌株指紋之間存在相關(guān)性也頗受爭(zhēng)議。該研究還利用限制性?xún)?nèi)切核酸酶分析法(REP)、全菌細(xì)胞分析、外膜蛋白表型分析、多位點(diǎn)酶切電泳分型技術(shù)等證明Hps菌株的高度異質(zhì)性結(jié)論。研究表明，在同型菌株間和非典型菌株中存在高比例的基因多樣性。盡管基因分型目前在學(xué)術(shù)界還未取得一致同意，但基因分型在預(yù)測(cè)HPS亞型中得到認(rèn)可。由于ERIC-PCR 圖譜具有高變異性，因此有些結(jié)果不同實(shí)驗(yàn)室不能共享。盡管如此，相對(duì)于REP 技術(shù)，ERIC-PCR 技術(shù)更方便。REP 技術(shù)要求較高并且比較復(fù)雜，有時(shí)需要對(duì)100 多條帶型進(jìn)行分析[11]。

Rafiee 等對(duì)HPS進(jìn)行鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，15 株參考菌株都形成了獨(dú)特、可重復(fù)的ERIC-PCR 圖譜。從3 個(gè)相關(guān)疫點(diǎn)獲得12 株分離株顯示相同的指紋圖譜，與15 株參考株及兩株澳大利亞分離株的圖譜不同。12 株分離株同為一種指紋圖譜，表明不同的農(nóng)場(chǎng)存在共同傳染源[11]。該研究第一次證實(shí)，ERIC-PCR 是一種適合研究HPS 病流行病學(xué)暴發(fā)的圖譜分型技術(shù)。Turni 等研究澳大利亞昆士蘭一個(gè)農(nóng)場(chǎng)是否感染HPS時(shí)采用ERIC-PCR 分型、間接血凝和凝膠擴(kuò)散血清分型等分析HPS分離株。獲得的42 株中共有3 種基因型，而4 株分離株具有相同的典型圖譜，但不能采用Kielstein/Rapp-Gabrielson 分型法進(jìn)行區(qū)分[12]。提示實(shí)驗(yàn)室診斷應(yīng)考慮這種情況，或者使用表型特征進(jìn)行可疑HPS的鑒定。Macedo 等進(jìn)一步應(yīng)用ERIC-PCR 對(duì)巴西豬場(chǎng)中分離的63 株HPS 進(jìn)行鑒定，共發(fā)現(xiàn)了33 種基因型，其中鑒定出8 種血清型，血清4 型最常見(jiàn)(15.9 %)，60.3 %的分離株為未分型菌株[13]。研究還表明，分離部位與基因型以及血清型間不存在明顯關(guān)聯(lián)性。

賈愛(ài)卿等對(duì)47 株HPS 進(jìn)行分析，獲得28 種不同的指紋圖譜，分離自同一豬場(chǎng)和相同血清型菌株表現(xiàn)出不同指紋圖譜，不能進(jìn)行血清分型的HPS也可得到分型。另外發(fā)現(xiàn)血清5 型和12 型所有菌株DNA 指紋比血清4 型多出1 條約500 bp 片段。血清5 和12 型均為強(qiáng)毒力菌株，而血清4 型為中等毒力血清型，推測(cè)該500 bp 片段可能與毒力有關(guān)[14]。對(duì)分離自廣西地區(qū)不同豬場(chǎng)的22 株HPS進(jìn)行ERIC-PCR 指紋圖譜分型，22 株分離株顯示出12 種指紋圖譜，可區(qū)分無(wú)法進(jìn)行血清分型的菌株，表明ERICPCR 適用于對(duì)HPS進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查及基因分型快速診斷[15]。

2.2 RFLP-PCR 近年，已建立了多種RFLP-PCR。通過(guò)擴(kuò)增某一基因，然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行酶切后分析不同電泳圖譜。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是直接對(duì)臨床樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，不需分離細(xì)菌后再進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。相對(duì)ERIC-PCR 而言，RFLP-PCR 重復(fù)性高，因?yàn)镽FLP-PCR 要求的條件較嚴(yán)格。但由于RFLP-PCR 是對(duì)單個(gè)基因進(jìn)行擴(kuò)增，所以易受橫向基因轉(zhuǎn)移影響。

目前，利用了解較少的基因序列開(kāi)展了3 種檢測(cè)HPS菌型的RFLP-PCR 技術(shù)。擴(kuò)增的基因包括轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白(tbpA)，16S rRNA 以及5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(aroA)等[16-17]。采用tbpA 和16S rRNA 基因的RFLP-PCR技術(shù)證實(shí)HPS間的高度異質(zhì)性，并且還證實(shí)基因型與血清型間缺乏明確的關(guān)聯(lián)。此外，還有部分血清型采用RFLP-PCR 技術(shù)難以區(qū)分。

RFLP-PCR 技術(shù)采用非種特異性PCR 擴(kuò)增HPS和一些放線(xiàn)桿菌屬成員的aroA 基因，因此在使用該基因分型技術(shù)時(shí)，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離和鑒定極其重要。有些HPS株具有與胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌一樣的RFLP 圖譜，盡管導(dǎo)致這一結(jié)果的原因不清楚，但橫向基因轉(zhuǎn)移不能忽視。Redondo 等在特異性PCR 試驗(yàn)基礎(chǔ)上，優(yōu)化了HPS的RFLP 技術(shù)[16]。擴(kuò)增tbpA 后采用Taq I,Ava I 和Rsa I 等限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)tbpA 基因進(jìn)行酶切，15 種HPS 參考株得到12 種圖譜，而101 株分離株顯示出較高的異質(zhì)性(33 個(gè)RFLP 組)。Río 等首次報(bào)道了豬鏈球菌、HPS、李氏放線(xiàn)桿菌、馬放線(xiàn)桿菌、豚放線(xiàn)桿菌、羅氏放線(xiàn)桿菌、豬放線(xiàn)桿菌、脲放線(xiàn)桿菌、小放線(xiàn)桿菌和吲哚放線(xiàn)桿菌中aroA 基因的存在，并且建立的基于aroA 基因的PCR-RFLP 方法表明HPS和放線(xiàn)種屬aroA 的遺傳多樣性基本一致[17]。

Li 等利用相同的3 種酶對(duì)15 株HPS標(biāo)準(zhǔn)株tbpA 基因進(jìn)行酶切，獲得9 種圖譜。同時(shí)，對(duì)50 株臨床分離株分析后得到13 種圖譜。DBN(38 %)，ABN(18 %)和DBP(12 %)等3 種RFLP 圖譜為中國(guó)流行類(lèi)型。研究還表明，主要基因型菌株分離于多發(fā)性漿膜炎或關(guān)節(jié)炎病豬中，但基因型與毒力間的關(guān)系不明確[18]。在HPS的診斷以及控制中，區(qū)分分離的HPS是常駐菌還是致病菌非常重要。此外，由于動(dòng)物體內(nèi)往往不止一種HPS定植，因此臨床病例中分離的HPS可能并不是導(dǎo)致發(fā)病的致病菌。他們的研究還發(fā)現(xiàn)，有些僅表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎或無(wú)明顯肉眼病變的病豬肺臟中也能分離出HPS。因此，臨床中很難確定有明顯癥狀和肉眼觀察有病變的病豬，是由于HPS感染所致還是感染其他病原菌而發(fā)病。要證實(shí)分離的HPS是否為病原菌，只有通過(guò)本身不攜帶HPS的健康豬，接種HPS觀察能否引起與HPS感染后相同的臨床病變進(jìn)行判定。

基于ompA 基因建立的PCR-RFLP 技術(shù)對(duì)15 株參考株和49 株分離株進(jìn)行分型，64 株被分為8 種不同基因型，其中7 種基因型(包括AA、BB、BA、CA、BC、BD和CD)同時(shí)存在于參考株和分離株中，而基因型CB 僅存在于分離株。此外，BA、CD 和CA 僅存在于病豬中，健康豬中分離的菌株為AA、BB、BC 和CB 型[19]。研究表明，相同血清型分離株RFLP 圖譜不一致，同時(shí)具相同RFLP 圖譜分離株卻屬于不同血清型菌株，表明基因型和血清型沒(méi)有必然的聯(lián)系。該研究還表明該方法適合對(duì)流行病學(xué)中菌株類(lèi)型的研究。

Jabloński 等發(fā)現(xiàn)PCR-RFLP 和ERIC-PCR 在HPS分型中均具有較高分辨能力。在結(jié)果相近情況下，考慮到方法的復(fù)雜性，ERIC-PCR 優(yōu)于PCR-RFLP[20]。巴西40 株從豬體內(nèi)分離的HPS進(jìn)行RFLP 分析表明，40 株有34 種圖譜型，相似性在0.2 到1.0 之間，分辨率為0.97[10]。表明對(duì)不同血清型采用RFLP 分析具有較高的分辨能力。

彭昊等探索了PCR 方法及PCR-RFLP 技術(shù)對(duì)aroA 基因在HPS 病原檢測(cè)及基因分型中的作用[21]。雖然菌型與血清型分類(lèi)無(wú)直接對(duì)應(yīng)關(guān)系，但結(jié)合菌株毒力試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毒力較強(qiáng)菌株聚為一類(lèi)。并且與毒力相對(duì)較弱的菌株相對(duì)比，毒力較強(qiáng)菌株的aroA 基因編碼序列大多存在Hin d Ⅲ酶切位點(diǎn)，作者推測(cè)該酶切位點(diǎn)處堿基的變異可能導(dǎo)致毒力改變。劉輝等通過(guò)3 種限制性?xún)?nèi)切酶TaqⅠ、AvaⅠ、AfaⅠ對(duì)Hps 的tbpA 進(jìn)行PCR-RFLP 分型[22]。結(jié)果表明，5 株HPS得到4 種基因型，分別為EBC、BBJ、EBJ、EAD。在未分離細(xì)菌情況下，PCR-RFLP 基因分型用于菌株的描述和比較是可行的,但這種方法的區(qū)分能力不及ERIC-PCR 方法。

2.3 MLST MLST 是最近提出的一種HPS 基因分型方法。MLST 在其他細(xì)菌分型中得到廣泛應(yīng)用。MLST 具有可重復(fù)性、易于共享和具有較高分辨能力等優(yōu)點(diǎn)，但由于需要較高的測(cè)序成本，所以限制了其常規(guī)應(yīng)用。最近研究表明，以測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的分型技術(shù)很可能成為未來(lái)全球流行病學(xué)研究的技術(shù)選擇。當(dāng)應(yīng)用于鑒別不同菌株間的關(guān)系時(shí)，序列分型法可提供高水平的鑒別能力。此外，MLST還有助于尋找基因型與毒力以及交叉免疫力之間的關(guān)系。

MLST 分型法根據(jù)細(xì)菌基因組中7 個(gè)管家基因mdh、6pgd、atpD、g3pd、frdB、infB 和rpoB 在菌株之間的多態(tài)性而建立的基因分型方法。Olvera 等對(duì)11 株Hps 標(biāo)準(zhǔn)菌株和120 株臨床分離株進(jìn)行分析獲得109 種序列類(lèi)型，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析得到1、2 兩個(gè)分支。分支2 菌株高度相似，大多數(shù)為與臨床病理?yè)p害相關(guān)的假定有毒菌株，提示這可能是一個(gè)毒力增強(qiáng)的譜系；分支1 則多數(shù)為鼻腔分離株，只有少數(shù)為可能的潛在有毒力菌株[23]。MLST 證實(shí)Hps 菌株間的高度遺傳異質(zhì)性。MLST 分型法克服了傳統(tǒng)血清分型的低分辨率和ERIC-PCR 技術(shù)存在的不同實(shí)驗(yàn)室間難于進(jìn)行比較的缺陷，并能提供更多的關(guān)于DNA 方面的信息，但MLST 需進(jìn)行基因序列測(cè)定，成本昂貴。Aragon 等研究表明，菌株的毒力并不完全與血清型以及MLST 分類(lèi)結(jié)果相吻合。他們認(rèn)為，血清型不能決定菌株的毒力，可能還存在其他毒力相關(guān)因子因素造成毒力差異[24]。

HPS基因組測(cè)序?yàn)镸LST 技術(shù)優(yōu)化提供了依據(jù)。利用已發(fā)表的HPS序列(菌株29755 和SH0165)，Mullins 等對(duì)已有引物進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，建立了改良的MLST 分型方法[25]。對(duì)127 株菌株進(jìn)行研究，7 個(gè)看家基因序列中確定了278個(gè)變異位點(diǎn)，定義了116 個(gè)獨(dú)特的序列類(lèi)型。對(duì)比改良與傳統(tǒng)分型技術(shù)，表明在所有基因位點(diǎn)多態(tài)性中分辨率無(wú)差異。優(yōu)化的MLST 數(shù)據(jù)被用于充實(shí)新創(chuàng)建和公開(kāi)的HPS數(shù)據(jù)庫(kù)。MLST 數(shù)據(jù)庫(kù)為HPS的暴發(fā)調(diào)查和跟蹤演化提供了一種新的資源。同時(shí)發(fā)現(xiàn)血清型1、5 和15 與毒力間的對(duì)應(yīng)關(guān)系強(qiáng)于其他血清型。血清型5 和15 聚類(lèi)在高毒力分支2 中，而血清型1 則全部聚類(lèi)在既有毒株又有無(wú)毒力株的分支1 中，表明基因分型結(jié)果與血清型以及毒力間關(guān)系不是絕對(duì)一致。Turner 等也明確表示，MLST 技術(shù)能判斷分離株屬于何種菌型，而不能準(zhǔn)確辨別該分離株毒力，表明MLST 分型與毒力間存在不一致性[26]。

國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)86 株HPS的7 個(gè)看家基因擴(kuò)增后測(cè)序，經(jīng)MLST 分析發(fā)現(xiàn)，分離株存在高度遺傳異質(zhì)性，86 株菌株分成74 個(gè)類(lèi)型[27]。最近研究也表明，7 個(gè)看家基因均存在不同程度變異，平均變異率為52.4 %。分離于同一個(gè)豬場(chǎng)同一頭豬的分離株，基因型也存在差異[28]。

2.4 PFGE 將細(xì)菌包埋于瓊脂塊中，利用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶在原位對(duì)整個(gè)細(xì)菌染色體進(jìn)行酶切，酶切片段在特定電泳系統(tǒng)中通過(guò)電場(chǎng)方向不斷交替變換及合適的脈沖時(shí)間等條件下得到良好的分離。PFGE 中內(nèi)切酶的選擇至關(guān)重要，采用的內(nèi)切酶常為寡切點(diǎn)酶，酶切后片段少而大，適合于PFGE 電泳分析。

徐成剛等從52 株耐至少7 種抗菌藥物的菌株中提取DNA 進(jìn)行分析，確定了46 個(gè)不同的PFGE 模式。被檢測(cè)的耐藥HPS間的不同變化表明抗性性狀由各菌株獨(dú)立獲得。此外，利用PFGE 對(duì)攜帶四環(huán)素耐藥基因的華南分離菌株分析表明，18 株攜帶tetB 基因的HPS分為17 種基因型，大部分菌株指紋圖譜不一致，表明這些菌株間呈現(xiàn)明顯的遺傳多樣性，但有兩株菌株(SC112 和SC113)的圖譜完全一致，表明這兩株菌株具有克隆傳播關(guān)系[29]。

Zhang 等應(yīng)用CpoI 對(duì)傳統(tǒng)PFGE 方法進(jìn)行改進(jìn)，并用于47 株分離株和15 株標(biāo)準(zhǔn)株。結(jié)果表明建立的方法能夠有效的區(qū)分臨床分離株[30]。他們進(jìn)一步采用已建立的方法分析112 株HPS，結(jié)果表明，可分型的89 株顯示為63 個(gè)不同圖譜，血清型不可分型的23 株顯示出22 種不同圖譜。同時(shí)發(fā)現(xiàn)部分同血清型菌株具有相同PFGE 圖譜，表明PFGE 圖譜與血清型間存在一定的相關(guān)性[7]。2012 年，Castilla 等首次采用NotⅠ對(duì)HPS進(jìn)行酶切后進(jìn)行PFGE，獲得20 種不同圖譜類(lèi)型，分辨率達(dá)0.95，表明具有高重復(fù)性以及良好的分辨力[10]。

2.5 單基因座序列分型 由于對(duì)HPS細(xì)菌簇之間的關(guān)系知之甚少，并且各實(shí)驗(yàn)室得到的結(jié)果難于比較，使得指紋圖譜法在全球流行病學(xué)研究中的應(yīng)用受到限制。最近，Olvera 等研究hsp60 的部分序列在HPS流行病學(xué)中的應(yīng)用。91 株被檢菌中鑒定出36 個(gè)等位基因，同時(shí)多株HPS被歸入兩個(gè)主要簇內(nèi)。其中一個(gè)簇多數(shù)為臨床分離株和強(qiáng)毒參考株，但未檢測(cè)到毒力和基因型間的相關(guān)聯(lián)系[31]。這項(xiàng)研究工作還對(duì)16S rRNA 進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)該基因在亞種水平上具有高度多樣性。

Dijkman 等研究表明，血清型與ERIC-PCR 聚類(lèi)分析以及Hsp60 序列分型之間不存在相關(guān)性，但ERIC-PCR 和Hsp60 分型適合作為分子流行病學(xué)的標(biāo)記[32]。最近，Howell 等對(duì)編碼莢膜多糖序列分析，15 個(gè)血清型中除血清型5 和12 外，都有一個(gè)獨(dú)特的區(qū)域(區(qū)域2)，該區(qū)域可進(jìn)行HPS分型研究[33]。

3 小結(jié)與展望

目前基于抗血清和表面抗原將HPS分為15 個(gè)血清型。但這些方法都發(fā)現(xiàn)臨床中有很多菌株不能分型或不同方法分型差異較大。雖然多種基因分型方法被廣泛用于Hps分型以及毒力鑒定中，但由于對(duì)HPS完整基因組序列以及毒力因子的認(rèn)識(shí)不足，至今沒(méi)有一種分型技術(shù)能夠準(zhǔn)確區(qū)分HPS分離株毒力。血清型以及基因分型技術(shù)在分析HPS致病性與血清型和基因型間的關(guān)系都面臨挑戰(zhàn)。隨著高通量測(cè)序的發(fā)展，越來(lái)越多HPS序列公布，這必將從基因水平上區(qū)分致病性與非致病性HPS提供依據(jù)。相信隨著HPS序列的破解和生物信息學(xué)的發(fā)展，新的基因分型技術(shù)以及毒力和非毒力菌株間特有的差異基因的發(fā)現(xiàn)，并通過(guò)大量臨床分離株驗(yàn)證其在毒力鑒定中的分辨能力?；谥饕玖σ蜃佣⒌幕蚍中图夹g(shù)，必將成為HPS 流行病學(xué)以及毒力鑒定中的重要工具。

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