高 明，敖 越，欒新紅，曹中贊

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽 110866；2.沈陽市動物疫病預防控制中心，遼寧沈陽 110034）

Toll樣受體信號傳導通路及其免疫調(diào)節(jié)作用的研究進展

高 明1，敖 越2，欒新紅1，曹中贊1

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽 110866；2.沈陽市動物疫病預防控制中心，遼寧沈陽 110034）

Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs）作為模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs）的一員，是介導天然免疫及病原體信號傳導與細胞活化信號轉(zhuǎn)導中的重要跨膜信號傳遞受體，可以識別高度保守的微生物組分-病原相關(guān)分子模式(PAMPS）。1984年在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)TLRs，參與成蠅的免疫反應，與果蠅的生長發(fā)育密切相關(guān)[1]。近些年，在人與許多動物體內(nèi)均有類似跨膜蛋白的發(fā)現(xiàn)，后被統(tǒng)一稱為TLRs受體家族。TLRs能夠識別許多不同種類的病原體，并迅速激活機體自身的免疫應答反應，也可以在某些特殊條件下被宿主自身的抗原激活。

1 TLRs

TLRs屬于跨膜蛋白，其大體分為3個部分：胞膜外區(qū)、胞漿區(qū)和跨膜區(qū)。其中，胞膜外區(qū)包含17～31個富含亮氨酸的重復序列(LRRs），其間有非LRR序列分隔，LRR基序一般由24個氨基酸組成主要是有利于促進蛋白間的相互黏附可以參與識別PAMPS[2]。TLRs受體分布非常廣泛，在B淋巴細胞、NK細胞、單核-巨噬細胞及樹突狀細胞表面都有分布，主要在天然免疫系統(tǒng)中表達。其中，TLR1分布比較廣泛，在多核及單核細胞等的表面均可進行表達；TLR2、4、5則主要分布于髓系統(tǒng)的單核細胞中，在外周血的白細胞中表達尤為豐富；而TLR3卻只在未成熟的樹突狀細胞中進行表達。而且，TLRs在不同的組織和細胞表達量有所不同[3]。

迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少15種TLRs[4]，鼠和人類的TLR1-9相同，TLR10為人類特有，TLR11-13為鼠特有，TLR14和TLR15相繼在小鼠和雞體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，也有研究顯示在小鼠和人細胞中均有TLR14的表達[5]。根據(jù)來源可以將TLRs的配體分為內(nèi)源和外源兩類。內(nèi)源性配體主要來自于宿主細胞[6]，外源性配體則主要是來自于病原微生物進化過程中的一些保守組分[7]。

2 TLRs介導的信號傳導通路

TLRs信號通路的活化在機體完成各種生命活動的過程中發(fā)揮著重要的作用。由TLRs介導的信號轉(zhuǎn)導通路可以誘導很多快速反應的活化，產(chǎn)生如一氧化氮合成酶、抗菌肽、炎癥細胞因子、共刺激分子、趨化細胞因子等效應分子，激活炎癥反應，參與機體防御反應。所有TLRs家族成員均依賴于TIR結(jié)構(gòu)域向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導識別信號，與接頭蛋白結(jié)合，活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB、絲裂原蛋白激酶(MAPK）、p38、IFN誘導因子等轉(zhuǎn)錄因子，最終誘導靶基因表達[8]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了至少有5種不同的轉(zhuǎn)接蛋白參與TLR信號途徑，即髓樣分化分子88(MyD88）、MyD88-轉(zhuǎn)接體樣/TIR-相關(guān)蛋白(MAL/TIRAP）、Toll受體相關(guān)分子(TRAM）、誘導IFN-P的TIR結(jié)構(gòu)域含有性轉(zhuǎn)接體(TRIF）和 SARM(Sterile A and HEAT/Aimadillo motifs）。其中，MyD88和TRIF可以誘導下游激酶活化從而引起一系列級聯(lián)反應，而TRAM和MAL/TIRAP可以分別轉(zhuǎn)運MyD88和TRIF激活Toll樣受體，接頭蛋白SARM則與TLRs信號通路的負調(diào)節(jié)有關(guān)[9]。除TLR3，MyD88是其他所有TLR家族成員信號通路的必需轉(zhuǎn)接分子，因此根據(jù)接頭蛋白的不同，可以將TLRs的后續(xù)信號轉(zhuǎn)導分為MyD88依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑兩種。

2.1 My D 8 8依賴性途徑 MyD88主要由3個重要結(jié)構(gòu)域組成：“死亡”結(jié)構(gòu)域(DD）、TIR結(jié)構(gòu)域以及中間的INT結(jié)構(gòu)域。結(jié)合物激活受體TIR域位于C-末端(TIR結(jié)構(gòu)域是MyD88與TLRs結(jié)合所必需的），而N-末端DD結(jié)構(gòu)域主要負責招募IL-1R相關(guān)激酶4(IRAK4），是進一步的信號級聯(lián)反應所必需的[10]。有一種轉(zhuǎn)錄變異的MyD88，稱為MyD88s，比野生型MyD88缺失了INT結(jié)構(gòu)域，盡管MyD88s同樣包含DD結(jié)構(gòu)域，還是無法招募激酶IRAK4，這種轉(zhuǎn)錄變異蛋白已被證明是MyD88依賴途徑的內(nèi)源性負調(diào)節(jié)因子[11]。

TLRs的TIR結(jié)構(gòu)域識別配體后二聚化，結(jié)構(gòu)改變，并由胞內(nèi)的TIR結(jié)構(gòu)域招募接頭蛋白MyD88，MyD88通過其C-端與TIR區(qū)發(fā)生同源性相互作用，MyD88接頭蛋白氨基端的DD募集含有“死亡”功能域的IL-1受體相關(guān)激酶(IRAKs）家族(包括 IRAK-1、IRAK-2、 IRAK-M 和IRAK-4，其中IRAK-4是激活MyD88依賴途徑信號必須的）[12]，導致IRAKs隨即發(fā)生自身磷酸化，與受體復合物解離后，高磷酸化的IRAK-1游離進入胞漿內(nèi)，與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6）結(jié)合，由TRAF6激活Ubcl3/TAK1途徑，激活 NF-κB誘導的激酶(NIK），NIK進一步激活NF-κB激酶抑制物(IKKs），IKK是一個大的多組分蛋白激酶復合體(>700 ku），它至少包括4種組分，即具有催化活性的IKKa/IKKl、IKKP/IKK2和兩個輔助蛋白IKKy/NEMO(NF-kB essential modulator）、IKAP(IKK complex-associated protein）。IKK復合物使得核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制成分 IκB磷酸化而降解并與 NF-κB分離，使核因子NF-κB激活而轉(zhuǎn)入細胞核中，與DNA結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，誘導相關(guān)基因的表達，分泌炎癥因子(如TNF-a，IL-6，IL-8），化學趨化因子等，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[13]。此外，TLR還能激活絲裂原活化的蛋白激酶(MAPKs）途徑，促使轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白1(AP-1）等的生成，MAPK信號通路主要參與細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡的調(diào)節(jié)，并與炎癥、腫瘤及其他多種疾病密切相關(guān)[14]。

Mal是第二個被描述的接頭蛋白，C-末端包含TIR結(jié)構(gòu)域。最初認為Mal與MyD88不同，負責非MyD88依賴的信號通路[15]。然而，之后的研究表明Mal不是介導非MyD88信號通路的關(guān)鍵分子，Mal雖然在TLR5介導的MyD88依賴信號通路中不發(fā)揮重要的作用，但在TLR2和TLR4介導的MyD88依賴信號通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是募集MyD88和受體結(jié)合的橋聯(lián)分子[16]。

2.2 My D 8 8非依賴途徑 MyD88非依賴性信號轉(zhuǎn)導途徑主要介導了TLR3的信號轉(zhuǎn)導，但也有相關(guān)研究顯示，TLR4除了可以介導MyD88依賴途徑，也可以介導MyD88非依賴性途徑[17]。MyD88非依賴途徑中主要涉及到3種接頭蛋白，其中最重要的是TRIF，TRIF包含一個TIR結(jié)構(gòu)域，在C-末端有一個受體作用蛋白同型關(guān)聯(lián)基序(RIP），N-端區(qū)域有一個可以和TRAF6結(jié)合的T6BM結(jié)構(gòu)域[18]。TRIF能夠引起一系列信號級聯(lián)反應最終激活NF-kB，與前面描述的兩種TLR接頭分子最大不同之處在于，TRIF還可激活I(lǐng)FN-β啟動子；接頭蛋白SARM在其C-末端也包含TIR結(jié)構(gòu)域，是一種TRIF依賴途徑的負調(diào)節(jié)因子。SARM的表達阻滯了TRIF信號傳導通路，而對MyD88通路無影響，推測SARM可以與TRIF共同作用，阻止TRIF與上游或下游信號通路分子相結(jié)合[19]；接頭蛋白TRAM包含一個TIR結(jié)構(gòu)域，最初認為TRAM參與了IL-1信號通路，之后的研究表明TRAM基因缺失小鼠的IL-1R信號傳導并未受損，TRAM僅在TLR4誘導的信號通路中發(fā)揮功能，它的最重要功能是在TLR4的TRIF依賴途徑中作為一個橋接蛋白連接TRIF和TLR4[20]。由此引起了一些關(guān)于TLR4信號傳導的新發(fā)現(xiàn)，即TLR4具有兩條獨特的信號傳導通路：一條主要由外源性配體引起的來源于細胞膜上的誘導，介導Mal-MyD88途徑；另一條主要由內(nèi)源性配體引起的信號來源于胞內(nèi)的誘導，介導TRAM-TRIF 途徑[21]。

與TLR4需要接頭蛋白TRAM的協(xié)同作用才能進行相應的信號傳導不同，TLR3可以直接激活TRIF信號傳導通路。TLR3活化募集接頭蛋白TRIF以后誘導NF-kB活化有兩條相互獨立的途徑。第一條途徑類似MyD88依賴性途徑，TRIF的氨基端能與TRAF6的梭基端結(jié)合，通過TRAF6誘導延遲期NF-kB的活化。第二條NF-kB活化途徑與受體相互作用蛋白1(RIPl）有關(guān)，TRIF的梭基端的RIP結(jié)合結(jié)構(gòu)域與RIP結(jié)合后同樣可以活化NF-kB，此外，通過這條途徑，TLR3還可以誘導細胞凋亡，RIP1與TRIF結(jié)合后可以通過Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(FADD），活化Caspase信號轉(zhuǎn)導途徑，最終導致細胞凋亡的發(fā)生[22]。TLR3活化募集TRIF以后誘導激活I(lǐng)FN-β啟動子的途徑與干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF-3）密切相關(guān)，TRIF分子可以與TANK結(jié)合激酶1(TBKl）、IKKi相互作用，介導IRF3憐酸化，磷酸化的IRF3形成二聚體并移位到核內(nèi)誘導I型干擾素和干擾素可以誘導基因的表達[23]。

2.3 TLRs信號通路的負調(diào)控 一方面，TLRs信號通路的激活可以誘導強烈的免疫應答，有利于機體抵抗病原微生物的感染；另一方面，TLRs的過度活化可以導致的炎性因子過度表達，引起內(nèi)毒素休克、自身免疫性疾病、心肌損傷及2型糖尿病等病癥發(fā)展和惡化[24]，還會促進腫瘤特別是炎癥相關(guān)性腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸[25]。因此，TLRs信號通路的活化必須受到嚴密的控制并需要相應的負向調(diào)控機制以使機體處于一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)。正常情況下，機體中存在很多TLRs信號通路的負向調(diào)控因子(如上文提到的MyD88s和SARM），可以十分精準的對TLRs信號通路進行負向調(diào)節(jié)，適當?shù)臏p弱TLRs的信號強度或直接終止TLRs的信號傳導，避免強烈的免疫反應對機體的造成的損傷。參與這種負調(diào)節(jié)機制的因子主要分以下3種：胞外負調(diào)控因子、跨膜負調(diào)控因子、胞內(nèi)負調(diào)控因子[26]。其中胞外負調(diào)控因子包括可溶性TLRs(sTLRs）、生長停滯特異基因6(Gas6）等，其中sTLRs可以在信號通路初始階段直接發(fā)揮調(diào)控作用，減弱TLRs信號，Gas6則可以抑制TLRs介導的炎性反應；跨膜負調(diào)控因子主要包括腫瘤發(fā)生抑制物(ST2）、防輻射105(Radioprotective 105）、單免疫球蛋白IL-1相關(guān)蛋白(SIGIRR）等，這幾種負向調(diào)節(jié)因子主要是影響連接復合體及功能復合體的結(jié)合作用；胞內(nèi)負調(diào)控因子包括抑制性鋅指蛋白(Triad2A）、細胞因子信號抑制物(SOCS）、腫瘤抑制因子CYLD(Cyclindomatosis）等，主要以泛素化降解、去泛素化及競爭性抑制等方式行使負調(diào)控功能。這些調(diào)節(jié)因子在TLR介導的信號傳導通路中形成了一個復雜的負反饋調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，維持機體免疫平衡。

3 TLRs與免疫調(diào)節(jié)作用

TLRs在病原體通過微生物相關(guān)分子模式(MAMPs）或者損傷相關(guān)分子模式(DAMPs）入侵后產(chǎn)生組織損傷的過程中發(fā)揮著天然免疫受體的重要角色。但TLRs的不適宜性的表達水平，可能會引起患者對乙型肝炎病毒(HBV）的感染產(chǎn)生缺陷性免疫應答[27]。針對非洲圍產(chǎn)期調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，幾種TLRs的多態(tài)性復合體與HIV有密切的聯(lián)系，如果針對這幾種復合物進行深入研究，可能會在天然免疫水平對HIV進行預防[28]。TLRs在慢性肝病的發(fā)展過程中也起著至關(guān)重要的作用，Kesar等發(fā)現(xiàn)通過TLRs的治療操作，可能會提供新的治療手段用以扭轉(zhuǎn)慢性肝病[29]。Valladares等推測 TLR1、4、9介導的反應，在聚乙烯(Polyethylene，PE）粒子引起顱骨內(nèi)骨溶解小鼠模型的變化中扮演著決定性的角色，在PE粒子引起的溶骨性病變中TLR2、4高表達，而TLR9則表現(xiàn)為低表達；TLR2、4可能將會作為預防磨損顆粒引起的骨溶性病變的新的治療靶點[30]。Neill發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)TLR11可以對侵入如腎臟的細菌進行反應，并能激活相應的天然免疫應答反應，有效消滅侵入的細菌[31]。利用滲出的白細胞作為組織學檢查的測量指標，通過與TLR11敲除鼠的腎臟相比，野生型小鼠腎臟的炎癥反應更為嚴重。因此，TLR11對于預防病原體誘導的自身組織免疫損傷的識別也發(fā)揮則會重要的作用[32]。TLRs作為可以增強炎癥反應的特殊性免疫受體，肥胖和代謝綜合征(MetS）、心血管疾病(CVD）中起著非常重要的作用，而且如果將TLRs作為治療的靶位點則可能會阻斷糖尿病和CVD的不良后遺癥[33]。Oliveira等首次報道了躁郁癥(Bipolar disorder，BD）與TLR-4在遺傳學上存在關(guān)聯(lián)，并在天然免疫中扮演著重要的角色，可能是TLR4表達、傳染病易感性的增加及自身免疫能力的改變進而誘發(fā)BD的產(chǎn)生[34]。

4 TLRs發(fā)展展望

TLRs作為一種模式識別受體，不僅在天然免疫中起重要作用，同時也被視為天然免疫與獲得性免疫的連接點，并影響獲得性免疫。因此TLRs仍為免疫研究熱點，主要有以下幾個方面：TLRs家族新成員的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)與功能的闡明；新的TLRs配體的不斷挖掘；TLRs在物種、組織、細胞的分布；TLRs與細胞吞噬和細胞凋亡的調(diào)節(jié)；新TLRs信號通路的發(fā)現(xiàn)；TLRs家族成員之間功能的互相聯(lián)系與作用；并且隨著對TLRs信號通路研究的深入，針對TLRs為靶點的藥物研究也正成為一個熱點。對于這些問題的研究，將進一步豐富對病原體與宿主免疫反應之間相互作用的了解，為頑固性耐抗生素的感染性疾病、自身免疫性疾病的治療及腫瘤的免疫治療提供思路。

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S852.4

B

1008-0589(2014）04-0335-04

10.3969/j.issn.1008-0589.2014.04.20

*Correspondingauthor

2013-03-21

國家自然科學基金面上項目(31172286）

高 明(1970-），男，遼寧阜新人，講師，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學研究.

(本文編輯：趙曉巖）